白蘞素的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了白蘞素的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的白蘞素的藥物組合物中含有白蘞素和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，白蘞素、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，可以治療前列腺增生；白蘞素和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)前列腺增生的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療前列腺增生的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
白蘞素的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及白蘞素的新用途，具體涉及白蘞素的藥物組合物 及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 前列腺增生(BPH)是中老年男性常見疾病之一，隨全球人口老年化發(fā)病日漸增多。 前列腺增生的發(fā)病率隨年齡遞增，但有增生病變時(shí)不一定有臨床癥狀。城鎮(zhèn)發(fā)病率高于鄉(xiāng) 村，而且種族差異也影響增生程度。
[0003] 迄今為止，尚未見白蘞素及其藥物組合物與前列腺增生的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種白蘞素的藥物組合物，該藥物組合物中含有白蘞素和 一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，白蘞素和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療前列腺增生。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0008] -種白蘞素的藥物組合物，包括白蘞素、如權(quán)利要求1所述的化合物（I)和藥學(xué)上 可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤(rùn)滑劑。
[0010] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將翼首草粉碎，用85~95%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用 大孔樹脂除雜，先用35 %乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用90 %乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集90 %洗 脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中90%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為120:1、60:1、30:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d) 步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為40:1、30:1和10:1的二氯甲烷-甲 醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體 積百分濃度為85%的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到化合物(I)。
[0012] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0013] 上述化合物(I)在制備治療前列腺增生的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 上述白蘞素的藥物組合物在制備治療前列腺增生的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明提供的白蘞素的藥物組合物中含有白蘞素和一種結(jié)構(gòu)新穎 的天然產(chǎn)物，白蘞素和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)前列腺增生具有治療作用;二者聯(lián)合作用 時(shí)，對(duì)前列腺增生的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療前列腺增生的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。
[0017] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0018]分離方法：（a)將翼首草(2kg)粉碎，用90 %乙醇熱回流提?。?5L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用35%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用90%乙醇洗脫 12個(gè)柱體積，收集90%洗脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中90%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為120:1 (11個(gè)柱體積）、60:1 (9個(gè)柱體積）、30:1 (9 個(gè)柱體積)和15:1 (8個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得至1」4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分 3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為40:1(6個(gè)柱體積）、30:1(8個(gè)柱體積)和10:1(6個(gè) 柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為85 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個(gè)柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮即得(純度大于98 % )。
[0019] 結(jié)構(gòu)確證:冊(cè)431-]\^顯示[]\?1]+為111/2 395.1992，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C21H3QO7，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρηι，pyridine_d5，500MHz):Η_1β(3 · 87，m)，H_ 2a(1.65，m)，H-20(1.56，m)，H-3a(1.33，m)，H-30(1.35，m)，H-50(2.O4，s)，H-90(1.55，d，J = 3.5Hz)，H-lla(4.53，br，s)，H-12a(2.31，dd，J=12.8,5.OHz)，H-120(1.84，m)，H-13a (1.79，br，s)，H-14a(2.42，m)，Η-14β(1·86，πι)，H-16(2.15，m)，H-17a(3.77，d，J=10.0， 4.OHz)，H-170(3.66，d，J=lO.O,4.OHz)，H-18(1.21，s)，H-19(l.O6，s)，H-2〇a(5.16，d，J = 9.5〇泡），!1-2〇0(4.32，(1，了 = 9.5〇泡），17-〇16(3.22,8);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)心（卯111， pyridine-ds ,125MHz) ：73.3(CH,1-C), 29.9(CH2,2-C)39.9(CH2,3-C), 34.2(C, 4-0,64.4 (CH，5-C)，215.0(C，6-C)，101.0(C，7-C)，61.5(C，8-C)，55.4(CH，9-C)，43.5(C，10-C)，66.9 (CH，11-C)，29.7(CH2，12-C)，29.6(CH，13-C)，29.6(CH2，14-C)，225.1(C，15-C)，58.7(CH， 16-C)，69.8(CH2，17-C)，34.9(CH 3，18-C)，22.5(CH3，19-C)，66.4(CH2,20-C)，58.3(CH3，17-0〇1 3)。在氫譜中可以觀察到兩個(gè)單峰甲基信號(hào)[5111.21(3!1，8)和1.06(3!1， 8)]，一個(gè)甲氧基 信號(hào)[6113.22(3!1，8，17-016)]，兩個(gè)連氧亞甲基質(zhì)子信號(hào)[61 13.77(1!1，(1，1=10.0,4.0他）與 3.66(1!1，(1，了 = 10.0,4.0抱），5.16(1!1，(1，了 = 9.50抱）與4.32(1!1，(1，了 = 9.50!^)]，兩個(gè)連氧 次甲基質(zhì)子信號(hào)[SH3.87(lH，m)與4.53(1!1，1^，8)];在碳譜中顯示該化合物有21個(gè)碳信號(hào)， 包括三個(gè)甲基（一個(gè)甲氧基），六個(gè)亞甲基(兩個(gè)連氧碳），六個(gè)次甲基(兩個(gè)連氧碳）以及六 個(gè)季碳(兩個(gè)羰基和一個(gè)連氧季碳）。結(jié)合以上信息可以得出該化合物可能是一個(gè)二萜類化 合物，通過文獻(xiàn)查閱可以發(fā)現(xiàn)該化合物和已知化合物ent_10，6a，7a，llP-tetrahydroxy-n-methoxy-iPJO-epoxy-kauran-lS-one 具有及其相似的結(jié)構(gòu) 。將新化合物的核磁數(shù)據(jù)和 ent-?β，6α，7a，110_tetrahyd;roxy_17-methoxy_70，20_epoxy_kauran_15_one 進(jìn) 比車交，發(fā) 現(xiàn)該化合物多出了一個(gè)羰基碳信號(hào)，同時(shí)在已知化合物中的C-6位的羥基也消失，故而推測(cè) 該新化合物和已知化合物的區(qū)別在C-6的羥基氧化成了羰基。進(jìn)一步的對(duì)新化合物的HMBC 譜的解析中，H-5/C-6，H-5/C-7的相關(guān)性證實(shí)了 C-6位為一個(gè)羰基。R0ESY譜中，Η-11β/Η-9β 以及Η-1β/Η-9β的相關(guān)性表明C-1和C-11位的羥基均為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和 R0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一 步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。
[0020]該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：
〇
[0022] 實(shí)施例2:藥理作用
[0023]本實(shí)施例采用昆明種小鼠去勢(shì)，連續(xù)3周sc丙酸睪酮5mg · kg4 · 0-1，造前列腺增 生模型，觀察藥物對(duì)前列腺增生的治療作用。
[0024] 1、材料與方法
[0025] 1.1動(dòng)物
[0026] 小鼠，昆明種，雄性，20~23g，80只，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
[0027] 1.2試劑與樣品
[0028]白蘞素自制并經(jīng)過結(jié)構(gòu)確證。化合物（I)自制，制備方法見實(shí)施例1。戊巴比妥鈉， 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司；丙酸睪酮注射 液，上海通用藥業(yè)股份有限公司；癃閉舒膠囊，石家莊科迪藥業(yè)有限公司；小鼠睪酮（T) ELISA檢測(cè)試劑盒，北京科美東雅生物技術(shù)有限公司；小鼠雌二醇(E2)ELISA檢測(cè)試劑盒，北 京科美東雅生物技術(shù)有限公司。
[0029] 1.3儀器
[0030] FA(N)/JA(N)系列電子天平，上海民橋精密儀器有限公司；TGL-16G高速冷凍離心 機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；電動(dòng)勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Sn-895B型智能放 免γ測(cè)量?jī)x:上海原子核研究所四環(huán)儀器一廠。
[0031] 1.4小鼠分組及模型制備
[0032]取體重20~23g雄性小鼠80只，隨機(jī)取10只作為空白對(duì)照組，做假手術(shù)處理；其余 小鼠造前列腺增生模型，小鼠稱重后腹腔注射2%戊巴比妥鈉(30mg · kg^1)麻醉，常規(guī)消毒 皮膚，于無菌條件下經(jīng)陰囊摘除雙側(cè)睪丸，殘端處結(jié)扎，縫合皮膚，肌內(nèi)注射青霉素20萬u· kg<;手術(shù)后第3天，取去勢(shì)成功、狀態(tài)良好的小鼠50只，隨機(jī)分為5組用于造前列腺增生模 型，分別為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組(癃閉舒膠囊混懸液450mg · kg<)和白蘞素組(80mg · kg-0、化合物（I)組(80mg · kg-4、白蘞素與化合物（I)組合物組【40mg · kg-1白蘞素+40mg · kg^1化合物（I)】，連續(xù)3周每日sc丙酸睪酮5mg · kg-1(溶于大豆油)造模，空白組注射等量溶 媒。于造模型第1天，模型對(duì)照組ig生理鹽水；陽性對(duì)照組ig癃閉舒膠囊混懸液(450mg · kg 4);白蘞素組、化合物（I)組、白蘞素與化合物（I)組合物組ig上述劑量的藥物，給藥體積均 為20mL · kg^1;空白對(duì)照組灌服同體積的生理鹽水;每日給藥1次，連續(xù)給藥3周。于末次給藥 后2h(禁食不禁水12h)，小鼠稱重后眼眶取血，離心，分離血清，測(cè)血清中T，E2水平;然后脫 頸椎處死小鼠，迅速取前列腺組織，對(duì)各組小鼠前列腺腺體進(jìn)行立體計(jì)量學(xué)測(cè)定，測(cè)定腺體 的體密度。
[0033] 1.5血清中T的測(cè)定
[0034]用小鼠TELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中T的含量:試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，往預(yù)先包被T抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、對(duì)照品、HRP標(biāo)記 的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán) 色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的T呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算樣品濃度，即得到小鼠血清中T的含量。
[0035] 1·6血清中E2的測(cè)定
[0036] 用小鼠E2ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中雌二醇的含量:試劑盒采用雙抗體一步夾 心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，往預(yù)先包被E2抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、對(duì)照品、 HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn) 化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的E 2S正相關(guān)。用酶標(biāo) 儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定A，計(jì)算樣品濃度，即得到小鼠血清中扮的含量。
[0037] 1.7前列腺腺體的體密度測(cè)定
[0038] 采用通用立體計(jì)量學(xué)測(cè)定方法，應(yīng)用測(cè)試格點(diǎn)分析法，計(jì)算腺體上的交叉點(diǎn)數(shù)與 參照系中的交叉點(diǎn)數(shù)的百分比，為該組織中腺體的體密度(Vv)。
[0039] 1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0040] 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以X±s表示，計(jì)量資料組間比較采用單 因素方差分析。P<〇. 05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0041 ] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0042] 2.1對(duì)小鼠前列腺增生模型血清T、E2水平的影響
[0043]與空白對(duì)照組比，模型組小鼠血清中T水平顯著升高（P<0.01)，E2水平顯著降低 (P<0.01)，說明造模成功。和模型對(duì)照組相比，白蘞素與化合物（I)組合物組及陽性對(duì)照組 小鼠血清中T水平顯著降低、E 2水平顯著升高(P<0.01);與模型對(duì)照組比，白蘞素組、化合 物(I)組小鼠血清中T水平降低、平升高(P<0.05)。
[0044] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0045] 2.2對(duì)前列腺增生模型小鼠前列腺腺體的體密度的影響
[0046] 與空白對(duì)照組比，模型組前列腺腺體體密度顯著升高(P<0.01)，說明造前列腺增 生模型成功。與模型對(duì)照組比，白蘞素組、化合物（I)組小鼠前列腺腺體的體密度降低(P< 〇. 05);和模型對(duì)照組相比，白蘞素與化合物（I)組合物組、陽性對(duì)照組小鼠前列腺腺體的體 密度顯著降低(p<0.01)。
[0047] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0048] 表1對(duì)小鼠前列腺增生模型血清睪酮、雌二醇水平及前列腺腺體密度的影響
[0050]本實(shí)驗(yàn)采用小鼠去勢(shì)后皮下注射丙酸睪酮成功建立前列腺增生模型，小鼠去勢(shì) 后，前列腺迅速萎縮，再給予外源性雄激素，可造成動(dòng)物體內(nèi)性激素水平紊亂，使前列腺發(fā) 生增生。睪酮(T)是人體內(nèi)主要的雄激素，在5α_還原酶作用下變?yōu)殡p氫睪酮(DHT)，前列腺 內(nèi)的DHT濃度增加可導(dǎo)致腺體增生。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)通過DHT的作用增加釋 放，促前列腺間質(zhì)增生，刺激前列腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)與血漿中雄激 素的含量呈正相關(guān)，導(dǎo)致前列腺的增生，造成前列腺增生模型。雌雄激素比例的變化是前列 腺增生的關(guān)鍵誘因，血清中睪酮、雌二醇水平對(duì)反應(yīng)前列腺增生狀況有重要意義。前列腺濕 重及前列腺指數(shù)是反映前列腺增生程度最客觀的指標(biāo)之一，前列腺組織形態(tài)是確定是否增 生的關(guān)鍵;前列腺增生是慢性病，長(zhǎng)期的病理變化可能會(huì)累及相關(guān)臟器。前列腺增生可能會(huì) 累及機(jī)體免疫功能，胸腺的組織形態(tài)學(xué)變化及其淋巴細(xì)胞的個(gè)數(shù)可有效反應(yīng)前列腺增生狀 況。
[0051 ]結(jié)果表明，白蘞素、化合物（I)單獨(dú)作用時(shí)，可以治療前列腺增生；白蘞素和化合物 (I)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)前列腺增生的治療效果進(jìn)一步提高，可開發(fā)成治療前列腺增生的藥物。 [0052]上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物α)，2. -種白蘞素的藥物組合物，其特征在于:包括白蘞素、如權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的白蘞素的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的載體包 括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或 潤(rùn)滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的白蘞素的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠囊 劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓 劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將翼 首草粉碎，用85~95%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用35%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用90%乙醇洗脫 12個(gè)柱體積，收集90%洗脫液，減壓濃縮得90%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中90%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為120:1、60:1、30:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為40:1、30:1 和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合 的反相硅膠分離，用體積百分濃度為85 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集14~18個(gè)柱體積洗 脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。7. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療前列腺增生的藥物中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2~4任一所述的白蘞素的藥物組合物在制備治療前列腺增生的藥物中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/352GK105949169SQ201610367878
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】高忠青
【申請(qǐng)人】淄博夸克醫(yī)藥技術(shù)有限公司