86] 4. 2免疫熒光染色檢測EV71抗原表達
[0087] HBMEC細胞感染病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h，采用免疫熒光法檢測病毒抗原的表達，具體 步驟如下：
[0088] 1)細胞固定：將96孔板中的培養(yǎng)液移去，加入PBS清洗細胞2次，每孔加入100 μ 1 預(yù)冷甲醇，于-20°C條件下固定20min，用預(yù)冷的PBS清洗細胞3次。
[0089] 2)透膜：固定后的細胞每孔加入100 μ 1 0. 1% TritonX-100,室溫孵育15min，用 預(yù)冷PBS洗滌3次。
[0090] 3)封閉：每孔加入100 μ 1 3% BSA，于室溫下孵育lh。
[0091] 4) 一抗孵育：每孔加入EV71特異性鼠源單抗1(M) (1:2000稀釋）100 μ 1，室溫孵 育lh，用預(yù)冷的PBS洗滌3次。
[0092] 5)二抗孵育：每孔加入AF 488熒光標(biāo)記抗鼠 IgG(l: 1000稀釋）100 μ 1，室溫避光 孵育lh，用預(yù)冷的PBS避光洗滌2次。
[0093] 6)標(biāo)記細胞核：每孔加入細胞核熒光染料DAPI (1:5000, PBS稀釋），室溫避光孵育 15min，用預(yù)冷的PBS避光洗滌3次。
[0094] 7)熒光顯微鏡下檢測并計算綠色AF 488陽性細胞克隆數(shù)。4. 3蛋白免疫印跡。
[0095] (1)用蛋白裂解液分別提取對照組與ARF6干擾組HBMEC細胞的總蛋白。
[0096] (2)蛋白質(zhì)定量后分別將30ug蛋白加到12. 5%濃度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，并 截取相應(yīng)條帶用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)到PVDF膜上。
[0097] (3)蛋白的非特異性位點用5%的脫脂牛奶封閉，然后用特異性一抗封閉，4°C過 夜，用TBST緩沖液洗三遍，洗去一抗。
[0098] (4)然后用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2小時，繼而用TBST緩沖液洗三遍。
[0099] (5)最后，利用顯色液顯色并拍照分析·
[0100] 4. 4RT-PCR檢測細胞中EV71病毒量
[0101] HBMEC細胞感染病毒后繼續(xù)培養(yǎng)48h，采用TRIzol提取對照組與干擾組細胞的總 RNA，并逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過RT-PCR檢測EV71病毒量。具體步驟同2. 2所示。
[0102] 實驗結(jié)果：
[0103] 1設(shè)計、合成并篩選有效的siRNA
[0104] 針對各個目的基因序列，我們設(shè)計了多個RNA干擾靶點序列，并利用設(shè)計軟件進 行預(yù)評估測定，選擇3個最佳的動力學(xué)參數(shù)靶點進入后續(xù)實驗流程，每一基因共合成3條干 擾序列，如表1所示。
[0105] 采用體外轉(zhuǎn)染的方法，將各個基因的干擾RNA轉(zhuǎn)染到HBMEC細胞中去，48h后通過 RT-PCR法檢測各干擾RNA的干擾效率，最終篩選到干擾效果最佳的siRNA序列進行后續(xù)實 驗，其干擾效率如表2所示。
[0106] 表2 RT-PCR法檢測siRNA干擾序列對相關(guān)宿主基因的下調(diào)效率
[0110] NT :轉(zhuǎn)染 non-targeting siRNA 的 HBMEC 細胞組（陰性對照組）
[0111] siRNA :轉(zhuǎn)染針對各目的基因的siRNA的HBMEC細胞組（實驗組）。
[0112] 2siRNA干擾后的干擾效率以及細胞毒性檢測
[0113] 挑選出的針對各宿主分子的有效siRNA轉(zhuǎn)染HBMEC細胞，轉(zhuǎn)染后48h通過RT-PCR 法檢測各干擾RNA的干擾效率，同時采用CCK8檢測轉(zhuǎn)染后對HBMEC細胞毒性的影響。
[0114] 結(jié)果如圖1所示，轉(zhuǎn)染有效siRNA組與CTRL組相比，轉(zhuǎn)染各siRNA后能夠明顯抑 制相應(yīng)基因的表達水平（P < 0. 01)。細胞毒性實驗表明，各SiRNA轉(zhuǎn)染后并沒有產(chǎn)生明顯 的細胞毒性（P > 〇. 05)，對細胞正常的生理功能未產(chǎn)生影響，可用于后續(xù)實驗。
[0115] 3siRNA干擾后對EV71病毒感染的影響
[0116] 轉(zhuǎn)染各宿主分子的有效siRNA來下調(diào)宿主細胞相關(guān)分子的表達后，感染相同劑量 的EV71病毒，感染48h后，采用免疫熒光法檢測各宿主分子下調(diào)后對EV71感染的影響，發(fā) 現(xiàn)與對照組相比，轉(zhuǎn)染EFS siRNA(SEQ ID N0:18)以及轉(zhuǎn)染FYN siRNA(SEQ ID N0:22)分 別使EFS與FYN基因下調(diào)后，明顯降低了 EV71對HBMEC細胞的感染（圖2A)。通過計算病 毒量發(fā)現(xiàn)，EFS基因下調(diào)后對病毒的抑制率達到77%，F(xiàn)YN基因下調(diào)后對病毒的抑制率達到 86 %而其余分子的下調(diào)并沒有明顯抑制EV71對HBMEC細胞的感染（P > 0. 05)(圖2B)。
[0117] 為明確EFS對EV71感染的抑制作用，在轉(zhuǎn)染EFS分子siRNA后，通過免疫印跡法 檢測EFS蛋白分子的表達，并在感染EV71后觀察細胞病變情況，以及通過RT-PCR檢測EV71 病毒量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染EFS分子siRNA(SEQ ID N0:18)后，能夠明顯抑制發(fā)現(xiàn)EFS蛋白分 子的表達（圖3A)。與對照組相比，EFS蛋白表達下調(diào)后，能夠抑制細胞病變且HBMEC細胞 中的病毒量也顯著下降（圖3B，C)，與免疫熒光法檢測結(jié)果相一致。這些結(jié)果表明，與對照 細胞相比，下調(diào)EFS基因后EV71對HBMEC細胞的感染能力明顯下降，病毒量減少。
[0118] 進一步，分別轉(zhuǎn)染三條EFS分子的siRNA觀察對病毒感染性的影響。結(jié)果表明不 同的siRNA對EFS分子的下調(diào)效率不同（圖4A)，其中siRNA (SEQ ID N0:18)的干擾效率最 高，與前面的結(jié)果相一致。檢測干擾后對EV71感染性的影響發(fā)現(xiàn)，三條EFS分子的siRNA對 病毒感染的抑制率均可達到60%以上，而且隨著對EFS分子的下調(diào)效率的增高，對EV71感 染的抑制率也在升高（圖4B)，提示EFS分子在EV71感染HBMEC中的重要作用。因此，EFS 可作為抑制EV71對HBMEC細胞感染的新的宿主靶點。
[0119] 為明確FYN對EV71感染的抑制作用，在轉(zhuǎn)染FYN分子siRNA后，通過免疫印跡法 檢測FYN蛋白分子的表達，并在感染EV71后觀察細胞病變情況，以及通過RT-PCR檢測EV71 病毒量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染FYN分子siRNA(SEQ ID N0:22)后，能夠明顯抑制發(fā)現(xiàn)FYN蛋白分 子的表達（圖5A)。與對照組相比，F(xiàn)YN蛋白表達下調(diào)后，能夠抑制細胞病變且HBMEC細胞 中的病毒量也顯著下降（圖5B)，與免疫熒光法檢測結(jié)果相一致。這些結(jié)果表明，與對照細 胞相比，下調(diào)FYN基因后EV71對HBMEC細胞的感染能力明顯下降，病毒量減少。
[0120] 進一步，分別轉(zhuǎn)染三條FYN分子的siRNA觀察對病毒感染性的影響。結(jié)果表明不 同的siRNA對FYN分子的下調(diào)效率不同（圖6A)，其中siRNA (SEQ ID N0:22)的干擾效率最 高，與前面的結(jié)果相一致。檢測干擾后對EV71感染性的影響發(fā)現(xiàn)，三條FYN分子的siRNA對 病毒感染的抑制率均可達到60%以上，而且隨著對FYN分子的下調(diào)效率的增高，對EV71感 染的抑制率也在升高（圖6B)，提示FYN分子在EV71感染HBMEC中的重要作用。因此，F(xiàn)YN 可作為抑制EV71對HBMEC細胞感染的新的宿主靶點。
[0121] 通過以上實驗結(jié)果證明：本發(fā)明篩選到能夠抑制EV71感染HBMEC細胞的新的宿主 細胞分子FYN以及EFS。FYN或EFS基因下調(diào)以后，不影響細胞正常的生理功能，但明顯抑 制了 EV71對HBMEC細胞的感染。因此本發(fā)明為臨床預(yù)防和治療因 EV71感染所導(dǎo)致的血腦 屏障的失能提供了新的靶點和治療方案。
[0122] 以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用。2. 蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制備預(yù)防或治療手足口病藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制備預(yù)防或治療腸道病毒71 型感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為能夠抑制或下調(diào)FYN表達量的試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制備預(yù)防或治療腸道病毒71 型感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抑制或下調(diào)FYN表達量的試劑是siRNA、shRNA或 包含siRNA、shRNA的重組載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制備預(yù)防或治療腸道病毒71 型感染藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為FYN的干擾RNA，所述的干擾RNA的序列選自 以下任一： GCUCUGAAAUUACCAAAUCUU(SEQIDN0:22)、 AUGAAUUAUAUCCAUAGAGAU(SEQIDN0:23)、 GCCUCUUUGUCUAAAACAAUA(SEQIDN0:24)。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制備預(yù)防或治療手足口病藥物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述的藥物為能夠抑制或下調(diào)FYN表達量的試劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制備預(yù)防或治療手足口病藥物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述的抑制或下調(diào)FYN表達量的試劑是siRNA、shRNA或包含siRNA、 shRNA的重組載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因在制備預(yù)防或治療手足口病藥物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為FYN的干擾RNA，所述的干擾RNA的序列選自以下任一： GCUCUGAAAUUACCAAAUCUU(SEQIDN0:22)、 AUGAAUUAUAUCCAUAGAGAU(SEQIDNO:23)、 GCCUCUUUGUCUAAAACAAUA(SEQIDNO:24)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，是一種抗腸道病毒71型感染的新靶點及應(yīng)用。本發(fā)明以人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)作為靶細胞，采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)靶細胞宿主蛋白的表達，來尋找可有效抑制EV71感染人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)的宿主因子，從而保護血腦屏障的功能，預(yù)防病毒穿過血腦屏障感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本發(fā)明通過實驗發(fā)現(xiàn)蛋白酪氨酸激酶FYN癌基因(FYN？proto-oncogene,Src？family？tyrosine？kinase)分子在EV71感染HBMEC中發(fā)揮著重要的作用，下調(diào)FYN的表達，能明顯抑制EV71的感染。本發(fā)明提供了FYN在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型感染藥物中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1/68, A61P31/14, A61K48/00, A61K31/7088
【公開號】CN105288654
【申請?zhí)枴緾N201510033891
【發(fā)明人】朱勇喆, 戚中田, 徐慶強, 趙平, 陳生林
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年1月23日