一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境樣品檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種土壤中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的檢測(cè)方法。

二、

背景技術(shù)：

近年來(lái)，由于美白和紫外線防護(hù)越來(lái)越受到人們的重視，防曬劑的使用越來(lái)越頻繁。防曬劑在人們皮膚上使用后，隨著人們活動(dòng)會(huì)直接進(jìn)入環(huán)境中，或者先進(jìn)入城鎮(zhèn)污水處理系統(tǒng)中，再隨著污泥和污水的排放進(jìn)入環(huán)境中。很多研究表明，防曬劑可在很多水環(huán)境中檢出，作為一種新型污染物，已收到環(huán)保部門和環(huán)境科研工作者的重視。一些研究表明，有機(jī)防曬劑在環(huán)境中具有內(nèi)分泌干擾性和生物積累性，對(duì)環(huán)境具有潛在的危害。

2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(2-phenylbenzimidazole-5-sulfonicacid，簡(jiǎn)稱pbsa)是一種常用的防曬劑，由于其優(yōu)異的防曬性能，被廣泛的用于防曬化妝品中。

表12-苯基苯并咪唑-5-磺酸的基本信息

目前針對(duì)pbsa的研究主要集中在化妝品和產(chǎn)品中的含量水平，以及水環(huán)境中降解機(jī)理研究，但是pbsa在土壤中檢測(cè)方法研究以及含量水平研究幾近空白。因此，為了了解土壤環(huán)境中pbsa的濃度水平和環(huán)境行為，需要建立一種高效快捷、靈敏度高的分析方法，用于土壤中痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的定性定量檢測(cè)。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明的目的是針對(duì)以上問(wèn)題和不足，在于提供一種土壤中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(pbsa)的分析檢測(cè)方法，更具體的說(shuō)是采用超聲萃取、硅膠層析柱凈化和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)的分析方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟：

(1)超聲萃取

土壤樣品采集后，干燥并去除石塊和植物組織等較大的雜質(zhì)，研磨過(guò)篩。稱取土壤樣品于帶蓋離心管中，滴加內(nèi)標(biāo)溶液，待溶劑揮發(fā)；加入萃取溶劑，擰緊蓋子，混合均勻后，超聲萃取，離心分離，吸取上層清液于梨形燒瓶中；重復(fù)萃取步驟，將萃取液合并于梨形燒瓶中，并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

(2)硅膠層析柱凈化

在玻璃層析柱底部裝入少量玻璃棉，依次加入硅膠和無(wú)水硫酸鈉，平整表面后，加入溶劑清洗和活化硅膠。往梨形燒瓶中加入溶劑重新溶解，并將溶液轉(zhuǎn)移至硅膠層析柱中；用玻璃管接收層析柱中所需的部分流出液，在氮吹儀中吹干。往玻璃管中加入1ml甲醇重新溶解，過(guò)濾后，以2ml棕色進(jìn)樣小瓶中保存待測(cè)。

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

用分析天平稱取pbsa和內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別配成儲(chǔ)備液，并稀釋成工作溶液，最后配制成梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

(4)高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)

將梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中測(cè)定，使用內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在相同條件下將步驟(2)中的樣品溶液注入高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)行測(cè)定，將樣品中目標(biāo)化合物的色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到樣品中pbsa的定性定量結(jié)果。若樣品中pbsa的濃度超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍上線，應(yīng)相應(yīng)減少樣品量重新提取凈化和檢測(cè)。

步驟(1)中，優(yōu)選地使用冷凍干燥法，樣品研磨后果0.90mm篩子，密封保存于4℃的環(huán)境中。

步驟(1)中，土壤樣品量?jī)?yōu)選為5～10g。

步驟(1)中，內(nèi)標(biāo)物優(yōu)選為2-甲基-4-氯戊氧基丙酸(mecoprop)。

步驟(1)中，萃取溶劑為乙酸乙酯和甲酸的混合溶劑，兩者體積比為50:1～100:1。

步驟(1)中，具體提取過(guò)程為加入萃取溶劑7～10ml，擰緊蓋子，渦旋混合30s，超聲萃取15～20min，2500rpm離心15min，吸取上層清液于梨形燒瓶中，再重復(fù)提取2～3次，合并萃取液于梨形燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

步驟(2)中，硅膠和無(wú)水硫酸鈉分別為1.0g和0.5g。

步驟(2)中，硅膠活化具體操作為：依次加入10ml甲醇、10ml乙酸乙酯和10ml正己烷，注意過(guò)程中液面不能低于無(wú)水硫酸鈉上界面。

步驟(2)中，樣品溶液加入和洗脫的具體過(guò)程為：往梨形燒瓶中加入2～3ml正己烷重新溶解，并將溶液轉(zhuǎn)移至硅膠層析柱中，棄去流出液，再重復(fù)步驟2次；往梨形燒瓶中加入2～3ml乙酸乙酯重新溶解，并將溶液轉(zhuǎn)移至硅膠層析柱中，用玻璃管接收流出液，再重復(fù)步驟2次，合并流出液，于氮吹儀中吹干。

步驟(3)中，優(yōu)選的內(nèi)標(biāo)物為2-甲基-4-氯戊氧基丙酸(mecoprop)，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的梯度濃度至少5個(gè)以上。

步驟(4)中，優(yōu)選的色譜條件如下：色譜柱為agilentsb-c18(3.0×100mm,1.8μm)、柱溫為40℃，流動(dòng)相為水(a)和乙腈(b)；梯度洗脫程序?yàn)?～2min50～90％流動(dòng)相b，2～5min90％流動(dòng)相b，流速0.30ml/min。

步驟(4)中，優(yōu)選的質(zhì)譜條件如下：電噴霧離子化離子源(esi)負(fù)模式；干燥氣溫度300℃，流速3ml/min；霧化器壓力30psi；鞘氣溫度250℃，流速11ml/min；毛細(xì)管電壓3000v，噴嘴電壓1000v。在此條件下，pbsa和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。

表2pbsa和內(nèi)標(biāo)在高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的質(zhì)譜參數(shù)

a粗體為定量離子

本發(fā)明利用超聲萃取、硅膠層析柱凈化和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)技術(shù)，建立了2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的分析檢測(cè)方法，有效地對(duì)土壤中的痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸進(jìn)行定性定量檢測(cè)，本發(fā)明具有以下創(chuàng)新點(diǎn)。

(1)2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的極性較強(qiáng)，本發(fā)明使用甲酸酸化的乙酸乙酯作為提取溶劑，可以抑制2-苯基苯并咪唑-5-磺酸在提取過(guò)程中的離子化，增加回收率，同時(shí)中等極性的乙酸乙酯溶劑可以減少土壤中干擾物的過(guò)分提取，減少了方法的基質(zhì)干擾，提高了靈敏度。

(2)土壤基質(zhì)復(fù)雜，為了方法的基質(zhì)干擾，本發(fā)明使用自制的硅膠層析柱凈化，先使用正己烷洗脫非極性雜質(zhì)，再用乙酸乙酯洗脫目標(biāo)化合物2-苯基苯并咪唑-5-磺酸，達(dá)到凈化目的，進(jìn)一步提高了方法靈敏度。

(3)本發(fā)明使用內(nèi)標(biāo)法定量，經(jīng)過(guò)儀器條件優(yōu)化后，選用的內(nèi)標(biāo)物2-甲基-4-氯戊氧基丙酸和目標(biāo)化合物在儀器中峰型良好，保留時(shí)間相近，并且在萃取前加入到樣品中，抵消了目標(biāo)化合物在萃取過(guò)程中損失所造成的誤差，多次實(shí)驗(yàn)中都取得了良好的回收率。

(4)我國(guó)目前對(duì)土壤環(huán)境中的2-苯基苯并咪唑-5-磺酸關(guān)注較少，由于土壤環(huán)境基質(zhì)復(fù)雜，常規(guī)分析方法干擾嚴(yán)重，造成分析困難，其分析檢測(cè)技術(shù)尚處于技術(shù)空白。本發(fā)明從提取、凈化和儀器分析方面提供了一套土壤中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的檢測(cè)技術(shù)，平均回收率為91.8％～92.1％，檢出限為0.19～0.22ng/g，定量限為0.64～0.74ng/g，適用于土壤中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的分析檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效是建立一種高效快捷、靈敏度高的分析方法，用于土壤中痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的定性定量檢測(cè)

附圖說(shuō)明

圖1為2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(pbsa)和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸(mecoprop)的特征離子流圖。

五、具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)超聲萃取

土壤樣品采集100g，冷凍干燥并去除石塊和植物組織等較大的雜質(zhì)，研磨過(guò)0.90mm篩。稱取5g土壤樣品于帶蓋離心管中，滴加100μl1mg/l的內(nèi)標(biāo)物2-甲基-4-氯戊氧基丙酸工作溶液，待溶劑揮發(fā)；加入10ml乙酸乙酯和甲酸混合溶劑(體積比50:1)，擰緊蓋子，渦旋混合30s，超聲萃取15min，2500rpm離心15min，吸取上層清液于梨形燒瓶中，再重復(fù)提取2次，合并萃取液于梨形燒瓶中，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

(2)硅膠層析柱凈化

在玻璃層析柱底部裝入少量玻璃棉，依次加入1g硅膠和0.5g無(wú)水硫酸鈉，輕敲玻璃柱平整表面，依次加入10ml甲醇、10ml乙酸乙酯和10ml正己烷活化硅膠柱，注意過(guò)程中液面不能低于無(wú)水硫酸鈉上界面。往梨形燒瓶中加入2ml正己烷重新溶解，并將溶液轉(zhuǎn)移至硅膠層析柱中，棄去流出液，再重復(fù)步驟2次；往梨形燒瓶中加入2ml乙酸乙酯重新溶解，并將溶液轉(zhuǎn)移至硅膠層析柱中，用玻璃管接收流出液，再重復(fù)步驟2次，合并流出液，于氮吹儀中吹干。往玻璃管中加入1ml甲醇重新溶解，過(guò)濾后，以2ml棕色進(jìn)樣小瓶中保存待測(cè)。

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

用分析天平稱取2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇配制成100mg/l儲(chǔ)備溶液并稀釋成1mg/l工作溶液，最后配制成濃度為1、5、10、20、50、100和200μg/l的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為100μg/l。

(4)高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)

將梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中測(cè)定，使用內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在相同條件下將步驟(2)中的樣品溶液注入高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)行測(cè)定，將樣品中目標(biāo)化合物的色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到樣品中pbsa的定性定量結(jié)果。

定性鑒定：在相同儀器條件下，若樣品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的保留時(shí)間相一致，并且定性和定量離子對(duì)的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液一樣，則可判斷樣品中存在2-苯基苯并咪唑-5-磺酸。

定量分析：以內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性范圍0～200μg/l，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)>0.999，通過(guò)軟件計(jì)算樣品溶液中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的濃度，最后按樣品量計(jì)算樣品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的濃度。

加標(biāo)回收率、重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)：

回收率采用3次平行加標(biāo)，加標(biāo)方法為：在5.0g土壤樣品中加入100μl1mg/l2-苯基苯并咪唑-5-磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得樣品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的濃度為20ng/g，等待30min，溶劑揮發(fā)完全后，進(jìn)行提取和檢測(cè)。將實(shí)際測(cè)定的加標(biāo)樣品濃度減去空白樣品濃度，并與理論添加濃度進(jìn)行比較，得到2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的回收率，以3個(gè)平行加標(biāo)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示方法重復(fù)性?；|(zhì)效應(yīng)按以下方法測(cè)試：將空白樣品提取和濃縮至1ml后，取100μl的樣品溶液于進(jìn)樣小瓶中，在氮吹儀上吹干，加入100μl濃度分別為100μg/l的2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，旋渦混合均勻，上機(jī)檢測(cè)。將實(shí)際測(cè)定的加標(biāo)樣品濃度減去空白樣品濃度，并與理論添加濃度進(jìn)行比較，得到方法的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果。方法的加標(biāo)回收率、重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3所示，可以看出，土壤中加標(biāo)濃度為20ng/g的情況下，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的平均回收率為91.8％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4％，基質(zhì)效應(yīng)為92.2％，說(shuō)明方法回收率和重復(fù)性好、基質(zhì)干擾低，可用于土壤樣品的檢測(cè)。

檢出限和定量限：

信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，信噪比為10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，具體操作為：通過(guò)數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算出加標(biāo)濃度下的信噪比，用該加標(biāo)濃度除以信噪比，該結(jié)果的3倍為方法檢測(cè)限，10倍為定量限。方法的檢出限和定量限結(jié)果如表3所示，可以看出，土壤中加標(biāo)濃度為20ng/g的情況下，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的檢出限為0.19ng/g，定量限為0.64ng/g，說(shuō)明本檢測(cè)方法靈敏度高，可用于土壤樣品中痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的檢測(cè)。

表3方法回收率、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

^a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)(n＝3)；^b平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)(n＝3)；^c(ng/g)；^d(ng/g)

實(shí)施例2

(1)超聲萃取

土壤樣品采集100g，冷凍干燥并去除石塊和植物組織等較大的雜質(zhì)，研磨過(guò)0.90mm篩。稱取10g土壤樣品于帶蓋離心管中，滴加100μl1mg/l的內(nèi)標(biāo)物2-甲基-4-氯戊氧基丙酸工作溶液，待溶劑揮發(fā)；加入10ml乙酸乙酯和甲酸混合溶劑(體積比100:1)，擰緊蓋子，渦旋混合30s，超聲萃取15min，2500rpm離心15min，吸取上層清液于梨形燒瓶中，再重復(fù)提取2次，合并萃取液于梨形燒瓶中，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

(2)硅膠層析柱凈化

在玻璃層析柱底部裝入少量玻璃棉，依次加入1g硅膠和0.5g無(wú)水硫酸鈉，輕敲玻璃柱平整表面，依次加入10ml甲醇、10ml乙酸乙酯和10ml正己烷活化硅膠柱，注意過(guò)程中液面不能低于無(wú)水硫酸鈉上界面。往梨形燒瓶中加入2ml正己烷重新溶解，并將溶液轉(zhuǎn)移至硅膠層析柱中，棄去流出液，再重復(fù)步驟2次；往梨形燒瓶中加入2ml乙酸乙酯重新溶解，并將溶液轉(zhuǎn)移至硅膠層析柱中，用玻璃管接收流出液，再重復(fù)步驟2次，合并流出液，于氮吹儀中吹干。往玻璃管中加入1ml甲醇重新溶解，過(guò)濾后，以2ml棕色進(jìn)樣小瓶中保存待測(cè)。

(3)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

用分析天平稱取2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別用甲醇配制成100mg/l儲(chǔ)備溶液并稀釋成1mg/l工作溶液，最后配制成濃度為1、5、10、20、50、100和200μg/l的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)物濃度為100μg/l。

(4)高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)

將梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中測(cè)定，使用內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在相同條件下將步驟(2)中的樣品溶液注入高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)行測(cè)定，將樣品中目標(biāo)化合物的色譜峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得到樣品中pbsa的定性定量結(jié)果。

定性鑒定：在相同儀器條件下，若樣品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中的保留時(shí)間相一致，并且定性和定量離子對(duì)的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)溶液一樣，則可判斷樣品中存在2-苯基苯并咪唑-5-磺酸。

定量分析：以內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性范圍0～200μg/l，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)>0.999，通過(guò)軟件計(jì)算樣品溶液中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的濃度，最后按樣品量計(jì)算樣品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的濃度。

加標(biāo)回收率、重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)：

回收率采用3次平行加標(biāo)，加標(biāo)方法為：在10.0g土壤樣品中加入100μl1mg/l2-苯基苯并咪唑-5-磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得樣品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的濃度為10ng/g，等待30min，溶劑揮發(fā)完全后，進(jìn)行提取和檢測(cè)。將實(shí)際測(cè)定的加標(biāo)樣品濃度減去空白樣品濃度，并與理論添加濃度進(jìn)行比較，得到2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的回收率，以3個(gè)平行加標(biāo)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示方法重復(fù)性。基質(zhì)效應(yīng)按以下方法測(cè)試：將空白樣品提取和濃縮至1ml后，取100μl的樣品溶液于進(jìn)樣小瓶中，在氮吹儀上吹干，加入100μl濃度分別為100μg/l的2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，旋渦混合均勻，上機(jī)檢測(cè)。將實(shí)際測(cè)定的加標(biāo)樣品濃度減去空白樣品濃度，并與理論添加濃度進(jìn)行比較，得到方法的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果。方法的加標(biāo)回收率、重復(fù)性和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表4所示，可以看出，土壤中加標(biāo)濃度為10ng/g的情況下，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的平均回收率為90.5％，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2％，基質(zhì)效應(yīng)為91.1％，說(shuō)明方法回收率和重復(fù)性好、基質(zhì)干擾低，可用于土壤樣品的檢測(cè)。

檢出限和定量限：

信噪比為3時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，信噪比為10時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度為定量限，具體操作為：通過(guò)數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算出加標(biāo)濃度下的信噪比，用該加標(biāo)濃度除以信噪比，該結(jié)果的3倍為方法檢測(cè)限，10倍為定量限。方法的檢出限和定量限結(jié)果如表4所示，可以看出，土壤中加標(biāo)濃度為10ng/g的情況下，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的檢出限為0.22ng/g，定量限為0.74ng/g，說(shuō)明本檢測(cè)方法靈敏度高，可用于土壤樣品中痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的檢測(cè)。

表4方法回收率、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限和定量限

^a平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)(n＝3)；^b平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(％)(n＝3)；^c(ng/g)；^d(ng/g)

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。