本發(fā)明屬于醫(yī)藥檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種測定腸內(nèi)菌中芍藥苷代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法。
背景技術(shù)：
：赤芍為我國的傳統(tǒng)中藥材，具有清熱涼血，散瘀止痛的功效，可用于溫毒發(fā)斑，跌撲損傷，肝郁肋痛，經(jīng)閉痛經(jīng)和臃腫瘡瘍等癥。赤芍中的化學(xué)成分較復(fù)雜，但赤芍中的單萜苷類成分被認(rèn)為是赤芍的主要活性成分，主要有芍藥苷等，其大部分具有橋頭氧β-葡萄糖和高度氧化的籠狀蒎烷骨架結(jié)構(gòu)，現(xiàn)代藥理學(xué)表明，芍藥苷具有擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)?、解熱解痙、利尿等多種作用。對于口服藥物來說，消化道是最主要的藥物代謝場所之一。腸道中含有大量的腸道菌群及活性酶，藥物經(jīng)過時(shí)必然會發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，且消化道菌叢中產(chǎn)生的酶，大部分是分解或還原酶，其種類比肝臟中的酶還多，因此，研究腸內(nèi)細(xì)菌對藥物的影響也格外重要。從某種程度上說，腸內(nèi)菌群對藥物的代謝可以看做是對肝臟代謝的補(bǔ)充。近年研究表明，芍藥苷靜脈給藥后主要以原形從腎排泄，離體肝灌流結(jié)果顯示在肝代謝少，芍藥苷在腸壁、肝臟和肺幾乎不能被代謝轉(zhuǎn)化，因此，其可能主要經(jīng)腸內(nèi)菌代謝。研究藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物尚存在著給藥量有限和血藥濃度低等一些弊端和限制，而體外研究藥物代謝的方法存在著很多優(yōu)勢，藥物體外腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化模擬人體腸內(nèi)藥物代謝，生成的代謝產(chǎn)物較穩(wěn)定，更有利于對其進(jìn)行檢測和制備，且貼近藥物體內(nèi)代謝事實(shí)。對于探討藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物，深入研究藥物活性產(chǎn)物及其作用機(jī)制具有重要意義，對于科學(xué)用藥具有指導(dǎo)作用。所以通過腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化測定芍藥苷體外代謝產(chǎn)物成為一種探討芍藥苷體內(nèi)代謝物的一種重要方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有研究的空缺，提供一種測定腸內(nèi)菌中芍藥苷代謝物的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法，該方法具有操作簡便，樣品處理簡單、分析速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：測定腸內(nèi)菌中芍藥苷代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，包括如下步驟：1)腸內(nèi)菌的制備：取糞便，在無菌無氧操作條件下，將糞便放入到一個(gè)充滿氮?dú)獾淖苑獯校辜S便均質(zhì)化，然后放入到滅菌完畢的gam培養(yǎng)基中，輕輕振搖，置無菌厭氧恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃下培養(yǎng)24h；2)芍藥苷的腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化：在無菌厭氧培養(yǎng)箱中，向培養(yǎng)的腸內(nèi)菌中加入芍藥苷，然后放置在37℃恒溫?fù)u床上振搖，速度為100r/min，培養(yǎng)2-24h，取出，加入乙酸乙酯終止反應(yīng)，得芍藥苷的腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物；3)樣品處理：采用萃取液萃取芍藥苷的腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物三次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸干，再用甲醇轉(zhuǎn)移至ep管中，過0.22μm微孔濾膜，獲得代謝產(chǎn)物樣品；4)樣品測定：具體條件如下：色譜條件：色譜柱：dikmadiamonsiltmodsc18色譜柱；洗脫時(shí)間：t＝50min；進(jìn)樣量：10μl；檢測波長：λ＝230nm；柱溫：30℃；流速：0.5ml/min；流動相：水(a)+甲醇(b)，采用梯度洗脫，程序如表1所示；表1時(shí)間(min)流速(ml/min)a(％)b(％)00.58515100.57030200.56040350.50100500.50100質(zhì)譜條件：一級質(zhì)譜：電離模式：電噴霧電離(esi)；掃描模式：正離子掃描；電噴霧電壓：4.0bar；干燥氣流速：10l/min；干燥氣溫度：200℃；二級質(zhì)譜：電離模式：電噴霧電離(esi)；掃描模式：正離子掃描；碰撞氣：氮?dú)?；毛?xì)管電壓：2.8kv；錐孔電壓：3.0v；源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣體流量：50l/hr；碰撞能量：15-35ev。上述的測定腸內(nèi)菌中芍藥苷代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，所述的糞便來源于人體或動物體。上述的測定腸內(nèi)菌中芍藥苷代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，步驟3)中，所述的的萃取液為水飽和的乙酸乙酯溶液。上述的測定腸內(nèi)菌中芍藥苷代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，步驟3)中，所述的萃取液為水飽和的甲基叔丁基醚(mtbe)溶液。上述的測定腸內(nèi)菌中芍藥苷代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，所述的色譜柱，型號為diamonsiltmodsc18色譜250mm×4.6mm，5μm。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明，采用腸內(nèi)菌對芍藥苷進(jìn)行體外代謝，通過液質(zhì)聯(lián)用檢測方法對代謝產(chǎn)物進(jìn)行測定，結(jié)果表明，芍藥苷在腸內(nèi)菌中代謝后，在mtbe萃取層樣品中，檢測到34個(gè)代謝物，鑒定了10個(gè)代謝產(chǎn)物，其中7個(gè)代謝物為首次在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)；在乙酸乙酯萃取層，檢測到12個(gè)代謝物，鑒定了1個(gè)代謝產(chǎn)物，為已知代謝物。相比其它方法，該方法可以同時(shí)檢測芍藥苷的更多代謝產(chǎn)物，選用mtbe較其它常用溶劑可以萃取出培養(yǎng)液中更多的代謝產(chǎn)物，能更多、更準(zhǔn)確推測出代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，對于深入研究活性產(chǎn)物及其作用機(jī)制具有重要意義，對于科學(xué)用藥具有指導(dǎo)作用。本發(fā)明，采用腸內(nèi)菌對芍藥苷進(jìn)行體外代謝，可以較大程度的模擬藥物的體內(nèi)代謝，同時(shí)解決探討藥物體內(nèi)代謝過程中，原型藥物及其代謝產(chǎn)物的濃度低，體內(nèi)干擾因素多等問題，對排除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾、準(zhǔn)確的找到代謝產(chǎn)物，從而對鑒定代謝產(chǎn)物，并深入研究藥物活性產(chǎn)物及其作用機(jī)制具有重要意義。本發(fā)明，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，檢測時(shí)間短，通量高，檢測靈敏度高，特異性好，成本低。本發(fā)明，集高效液相(hplc)和質(zhì)譜(ms)的優(yōu)點(diǎn)于一身，既具有hplc的高效、準(zhǔn)確、靈敏性好的特點(diǎn)，能夠?qū)?fù)雜混合物樣品進(jìn)行分離和分析，同時(shí)也具有質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性特點(diǎn)，對未知化合物的鑒定提供精確的分子量和豐富的結(jié)構(gòu)特征信息，因此，特別適合于有效成分復(fù)雜、含量低的中藥研究。本發(fā)明，對于探討藥物體內(nèi)代謝產(chǎn)物，深入研究活性產(chǎn)物及其作用機(jī)制具有重要意義，對于科學(xué)用藥具有指導(dǎo)作用。同時(shí)對促進(jìn)赤芍新藥開發(fā)和劑型改進(jìn)以及對中醫(yī)的方藥理論均具有重要意義。附圖說明圖1為芍藥苷提取分離流程圖。圖2為芍藥苷在腸內(nèi)菌中轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層的總離子流色譜圖。圖3為對照組1mtbe萃取層總離子流色譜圖。圖4為對照組2mtbe萃取層總離子流色譜圖。圖5為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物1的選擇離子流色譜圖。圖6為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物2的選擇離子流色譜圖。圖7為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物3的選擇離子流色譜圖。圖8為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物4的選擇離子流色譜圖。圖9為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物5的選擇離子流色譜圖。圖10為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物6的選擇離子流色譜圖。圖11為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物7的選擇離子流色譜圖。圖12為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物8的選擇離子流色譜圖。圖13為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物9的選擇離子流色譜圖。圖14為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化后mtbe萃取層代謝產(chǎn)物10的選擇離子流色譜圖。圖15為芍藥苷在腸內(nèi)菌中代謝途徑。具體實(shí)施方式為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明，從而對本發(fā)明的保護(hù)范圍作出明確的限定，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作出進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實(shí)施例1測定腸內(nèi)菌中芍藥苷代謝物的液質(zhì)聯(lián)用方法，包括以下步驟1)芍藥苷的提取分離將5kg赤芍藥材飲片粉碎，取250g，加入10倍量的70％乙醇，浸泡一夜，采用加熱回流方法對浸泡的赤芍提取，共提取三次，提取時(shí)間分別為2h，1h，1h。將提取液用三層紗布過濾藥渣，合并溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。隨后先用石油醚萃取，棄石油醚層，取水相繼續(xù)用乙酸乙酯萃取，棄乙酸乙酯層，取水相再繼續(xù)用正丁醇萃取，取正丁醇層，過200-300目硅膠柱，氯仿-甲醇洗脫，洗脫液再用10:1的甲醇和水混合液洗滌，得芍藥苷，具體步驟如圖1。芍藥苷也可以采用市購產(chǎn)品。2)腸內(nèi)菌的制備取8名健康志愿者第一次全便，男女各4名，取便前保持10天正常飲食，不服用抗生素及其他藥物。取適當(dāng)大小的充滿氮?dú)獾淖苑獯缓髷D壓出全部氮?dú)?，再通入氮?dú)?，如此重?fù)操作2次，再次將自封袋充滿氮?dú)猓饪?。在自封袋中裝入一次排便的所有糞便，封口。用手?jǐn)D壓自封袋，使糞便均質(zhì)化。在無菌無氧操作條件下，取3-5g糞便，放入到另一個(gè)充滿氮?dú)獾淖苑獯?，使糞便均質(zhì)化，然后放入到200ml滅菌完畢的gam培養(yǎng)基(250ml具塞三角瓶)中，輕輕振搖，加塞封口，置無菌厭氧恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃下培養(yǎng)24h，獲得腸內(nèi)菌菌液。gam培養(yǎng)基的組成：胰蛋白胨10g；大豆胨3g；朊胨10g；消化血清粉13.5g；酵母浸膏5g；牛肉膏2.2g；牛肝浸出粉1.2g；葡萄糖3g；kh2po42.5g；nacl5g；可溶性淀粉5g；l-半胱氨酸·hcl0.5g；硫代乙醇酸鈉0.3g；蒸餾水加至1l。上述成分混合加熱溶解，調(diào)ph至7.1～7.2，115℃高壓滅菌20分鐘。3)芍藥苷的腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化準(zhǔn)確稱取芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品100mg，置于10ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，得到10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。在無菌厭氧培養(yǎng)箱中，在7瓶gam培養(yǎng)基中按表2要求添加腸內(nèi)菌菌液，并按表2時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)化。表2芍藥苷腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化表序號轉(zhuǎn)化時(shí)間實(shí)驗(yàn)組12h實(shí)驗(yàn)組24h實(shí)驗(yàn)組38h實(shí)驗(yàn)組412h實(shí)驗(yàn)組524h對照組124h對照組224h實(shí)驗(yàn)組：gam培養(yǎng)基+0.5ml腸內(nèi)菌菌液+0.5ml芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液對照組1：gam培養(yǎng)基+0.5ml腸內(nèi)菌菌液對照組2：gam培養(yǎng)基+0.5ml芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液在實(shí)驗(yàn)組編號1-5及對照組2中加入0.5ml芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，緩慢滴加，邊滴加邊振搖，滴加完畢后，蓋好瓶塞，用封口膜密封瓶口，標(biāo)記。將實(shí)驗(yàn)組及對照組三角瓶無菌厭氧培養(yǎng)箱中取出，放置在37℃恒溫?fù)u床上振搖，速度為100r/min左右，開始計(jì)時(shí)，分別在2h、4h、8h、12h、24h取出相應(yīng)的三角瓶。反應(yīng)結(jié)束后，加入乙酸乙酯終止反應(yīng)，得芍藥苷的腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物。4)樣品處理分別取不同實(shí)驗(yàn)組的芍藥苷的腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物，分別用1:1(v/v)的水飽和的乙酸乙酯溶液萃取芍藥苷的腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物三次，合并有機(jī)相，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)相旋干，使用甲醇轉(zhuǎn)移至ep管中，然后開口揮干，加入2ml甲醇溶解。再分別取不同實(shí)驗(yàn)組甲醇溶解后的產(chǎn)物各0.1ml合并至新的ep管中，過0.22μm微孔濾膜，獲得乙酸乙酯萃取的代謝產(chǎn)物測試樣品。分別取不同實(shí)驗(yàn)組的芍藥苷的腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物，分別用1:1(v/v)的水飽和的甲基叔丁基醚溶液萃取芍藥苷的腸內(nèi)菌代謝產(chǎn)物三次，合并有機(jī)相，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)相旋干，使用甲醇轉(zhuǎn)移至ep管中，然后開口揮干，加入2ml甲醇溶解。再分別取不同實(shí)驗(yàn)組甲醇溶解后的產(chǎn)物各0.1ml合并至新的ep管中，過0.22μm微孔濾膜，獲得甲基叔丁基醚萃取的代謝產(chǎn)物測試樣品。將對照組1和對照組2分別用水飽和的乙酸乙酯萃取和水飽和的甲基叔丁基醚(mtbe)萃取，作為空白對照測試。5)樣品測定腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)樣品處理后，進(jìn)行代謝物的測定，具體條件如下：色譜條件：色譜柱：dikmadiamonsiltmodsc18色譜柱；洗脫時(shí)間：t＝50min；進(jìn)樣量：10μl；檢測波長：λ＝230nm；柱溫：30℃；流速：0.5ml/min；流動相：水(a)+甲醇(b)，采用梯度洗脫，程序如表1所示；表1質(zhì)譜條件：一級質(zhì)譜：電離模式：電噴霧電離(esi)；掃描模式：正離子掃描；電噴霧電壓：4.0bar；干燥氣流速：10l/min；干燥氣溫度：200℃；二級質(zhì)譜：電離模式：電噴霧電離(esi)；掃描模式：正離子掃描；碰撞氣：氮?dú)?；毛?xì)管電壓：2.8kv；錐孔電壓：3.0v；源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣體流量：50l/hr；碰撞能量：15-35ev。結(jié)果如圖1-15所示，圖1為芍藥苷提取分離流程圖，芍藥苷純度在98.0％以上。圖2為芍藥苷在腸內(nèi)菌中轉(zhuǎn)化的mtbe層的總離子流色譜圖，圖3為對照組1mtbe萃取層總離子流色譜圖，圖4為對照組2mtbe萃取層總離子流色譜圖，通過軟件ms-dial對圖2、圖3和圖4進(jìn)行處理，可以篩選出新增加的色譜峰，即為芍藥苷在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化中mtbe萃取層的代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明，芍藥苷在腸內(nèi)菌中代謝后，在mtbe萃取層樣品中，檢測到34個(gè)代謝物。使用軟件masslynxv4.1對代謝產(chǎn)物二級離子碎片進(jìn)行讀取；利用化合物數(shù)據(jù)庫和ms2analyzerver2.1軟件等對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行推導(dǎo)，并利用文獻(xiàn)和cfm-id軟件對結(jié)構(gòu)進(jìn)行佐證。在mtbe萃取層鑒定了10個(gè)代謝產(chǎn)物，其中7個(gè)代謝物為首次在腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)(圖5-14中代謝物p2、p3、p5、p6、p8、p9、p10)，同樣的操作在乙酸乙酯萃取層，檢測到12個(gè)代謝物，鑒定了1個(gè)代謝產(chǎn)物，為已知代謝物。相比其它方法，本發(fā)明的方法可以同時(shí)檢測芍藥苷的更多代謝產(chǎn)物，選用mtbe較其它溶劑可以萃取出培養(yǎng)液中更多的代謝產(chǎn)物，且用上述軟件及分析方法能更多、更準(zhǔn)確推測出代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，對于深入研究活性產(chǎn)物及其作用機(jī)制具有重要意義，對于科學(xué)用藥具有指導(dǎo)作用。同時(shí)對促進(jìn)赤芍新藥開發(fā)和劑型改進(jìn)以及對中醫(yī)的方藥理論均具有重要意義。圖5-14為芍藥苷在腸內(nèi)菌中代謝產(chǎn)物1-10的選擇離子流色譜圖，圖15為通過以上方法推導(dǎo)的芍藥苷在腸內(nèi)菌中代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。當(dāng)前第1頁12