本發(fā)明涉及抗生素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置及其制造方法、抗生素檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

隨著全球工業(yè)的飛速發(fā)展以及科技的進(jìn)步，人們的物質(zhì)生活水平有了很大提高，環(huán)境污染問題也越來越受到人們的關(guān)注，成為當(dāng)今社會(huì)面臨的三大世界性問題之一。目前，在地球的多種基質(zhì)中都檢測(cè)到了人類或獸用抗生素的殘留?？股氐姆e累會(huì)對(duì)生態(tài)平衡及人類生命造成危害，導(dǎo)致水體中的微生物產(chǎn)生耐藥性，即使是微量水平的抗生素在長期暴露下，也會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成危害。中國感染性疾病占全部疾病總發(fā)病數(shù)的49％，其中細(xì)菌感染性占全部疾病的18％至21％，即80％以上屬于濫用抗生素，每年有8萬人因此死亡。因此抗生素污染問題己經(jīng)被多個(gè)國家列為重要的環(huán)境問題，相關(guān)的廢水檢測(cè)與處理技術(shù)研究正在迅速展開。

近年來，針對(duì)水環(huán)境中的抗生素檢測(cè)技術(shù)有了快速的發(fā)展，在市面上常用的有高效液相色譜法(hplc)、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)(sers)、免疫分析法、電化學(xué)生物傳感器法等，均存在一定的問題。例如，hplc技術(shù)存在前處理復(fù)雜易導(dǎo)致回收率偏低、不實(shí)用、耗時(shí)長、流速低、成本高、需專人測(cè)量、設(shè)備昂貴等諸多問題；sers技術(shù)存在基底均勻性和重復(fù)性不好等問題；免疫分析法存在樣品前處理和清理耗時(shí)長、快速檢測(cè)不實(shí)用、昂貴、非實(shí)時(shí)檢測(cè)等缺陷；而且，以上三種檢測(cè)技術(shù)專業(yè)性較強(qiáng)，門檻較高，需要有專業(yè)技術(shù)人員來維護(hù)，難以適應(yīng)抗生素檢測(cè)的發(fā)展需求。

雖然近幾年發(fā)展起來的電化學(xué)生物傳感器法具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但用于構(gòu)建傳感器的生命活性物質(zhì)物理化學(xué)穩(wěn)定性較差，容易受到溫度、ph等外界因素的干擾，在實(shí)際生產(chǎn)生活應(yīng)用中容易失活，限制了傳感器的實(shí)際應(yīng)用。

因此，目前急需一種操作簡單、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確度高且性能穩(wěn)定的抗生素檢測(cè)設(shè)備或方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明提出了一種基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置及其制造方法、抗生素檢測(cè)方法，利用磁性納米核殼型微球良好的吸附性能，微傳感器自身具有的響應(yīng)快速、樣品用量少、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)有效、簡便、快速、準(zhǔn)確地對(duì)液相中的抗生素濃度進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明提供的基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置，包括微傳感器和帶電壓輸出的皮安計(jì)；

所述皮安計(jì)的電壓輸出端連接所述微傳感器的電極接口；

所述微傳感器的工作電極上涂覆有pfsa高分子膜；

所述pfsa高分子膜上嵌有磁性納米核殼型微球。

作為一種可實(shí)施方式，所述磁性納米核殼型微球的核心為超順磁性fe3o4，超順磁性fe3o4的外部包裹著一層sio2,sio2層的外包裹著一層殼聚糖；殼聚糖的表面由分子印跡聚合物組成，用于特異性結(jié)合液相中的抗生素。

作為一種可實(shí)施方式，所述微傳感器的工作電極的尖端設(shè)置有用于防止待檢測(cè)溶液流入電極內(nèi)部的玻璃保護(hù)層。

本發(fā)明提供的基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置的制造方法，包括以下步驟：

利用多元醇法制備超順磁性fe3o4；

基于制備的超順磁性fe3o4，利用溶膠-凝膠法制備fe3o4@sio2；

基于制備的fe3o4@sio2，利用反向乳液交聯(lián)法制備fe3o4@sio2@cs；

利用分子印跡技術(shù)，對(duì)fe3o4@sio2@cs進(jìn)行改性，得到對(duì)應(yīng)的抗生素分子印跡磁性核殼型微球fe3o4@sio2@cs-mip；

基于制備的fe3o4@sio2@cs-mip，利用滴涂法，將fe3o4@sio2@cs-mip溶液涂覆在微傳感器的工作電極的表面；

將得到的抗生素分子印跡微傳感器接入皮安計(jì)的電壓輸出端，得到抗生素檢測(cè)裝置。

作為一種可實(shí)施方式，所述利用多元醇法制備超順磁性fe3o4，包括以下步驟：

將fe(acac)3和三甘醇進(jìn)行混合，得到fe(acac)3和三甘醇的混合物；

將fe(acac)3和三甘醇的混合物加熱至180℃，并在該溫度下保持30分鐘；然后快速加熱回流，并保持回流30分鐘；

對(duì)加熱后fe(acac)3和三甘醇的混合物進(jìn)行冷卻至室溫，得到含有fe3o4的黑色均勻膠體懸浮液；

向得到的懸浮液中加入乙醇和乙酸乙酯，使納米顆粒絮凝，并利用磁場(chǎng)從溶液中分離得到黑色絮凝物；

將黑色絮凝物再次分散在乙醇中，用乙酸乙酯重新沉淀，磁力分離三次，完全除去過量的三甘醇和副產(chǎn)物，通過在真空下干燥沉淀，獲得固體產(chǎn)物，即為超順磁性fe3o4。

作為一種可實(shí)施方式，所述基于制備的超順磁性fe3o4，利用溶膠-凝膠法制備fe3o4@sio2，包括以下步驟：

將超順磁性fe3o4分散至去離子水中，利用超聲分散得到磁流體；

將磁流體加入無水乙醇中，隨后再加入氨水，將混合體系在30度的水浴條件下勻速機(jī)械攪拌；

混合體系攪拌30分鐘后，向該體系中逐滴加入正硅酸乙酯，攪拌45分鐘后用進(jìn)樣針逐滴滴加3-氨丙基三甲氧基硅烷，持續(xù)攪拌4小時(shí)；

反應(yīng)結(jié)束后，利用外加磁場(chǎng)將產(chǎn)物回收，用去離子水和無水乙醇依次進(jìn)行洗滌直至洗出液澄清，最后放入60度烘箱中干燥，得到fe3o4@sio2。

作為一種可實(shí)施方式，所述基于制備的fe3o4@sio2，利用反向乳液交聯(lián)法制備fe3o4@sio2@cs，包括以下步驟：

將fe3o4@sio2超聲分散到去離子水中，然后將體系轉(zhuǎn)移至50度的恒溫水浴體系中進(jìn)行機(jī)械攪拌，并逐滴加入5％gla溶液，持續(xù)攪拌1小時(shí)，使體系充分反應(yīng)；

攪拌結(jié)束后，向體系中加入殼聚糖的乙酸溶液，攪拌30分鐘，進(jìn)行反應(yīng)；

反應(yīng)結(jié)束后，再次向反應(yīng)體系中逐滴加入5％gla溶液，反應(yīng)1小時(shí)后體系自然冷卻至室溫；然后采用外加磁場(chǎng)將產(chǎn)品分離，并用無水乙醇洗滌至洗出液澄清，干燥得到fe3o4@sio2@cs。

作為一種可實(shí)施方式，利用分子印跡技術(shù)，對(duì)fe3o4@sio2@cs進(jìn)行改性，得到對(duì)應(yīng)的抗生素分子印跡磁性核殼型微球fe3o4@sio2@cs-mip,包括以下步驟：

配置含一定量的目標(biāo)抗生素、甲醇、甲基丙烯酸的溶液，振蕩5分鐘，暗置12小時(shí)，使目標(biāo)抗生素與功能單體充分作用；

將適量fe3o4@sio2@cs溶于溶液中，加入適量交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲分散5分鐘，通氮?dú)?5分鐘；然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)的情況下加熱至60度，反應(yīng)24小時(shí)后，得到抗生素分子印跡磁性核殼型微球fe3o4@sio2@cs-mip；

利用索氏提取器進(jìn)行抽提，反復(fù)多次，直至溶液中檢測(cè)不到抗生素分子，干燥備用。

作為一種可實(shí)施方式，所述基于制備的fe3o4@sio2@cs-mip，利用滴涂法，將fe3o4@sio2@cs-mip溶液涂覆在微傳感器的工作電極的表面，包括以下步驟：

將fe3o4@sio2@cs-mip分散到nafionpfsapolymer(全氟磺酸聚合物)中，充分?jǐn)嚢枋蛊浞稚⒕鶆颍玫絺溆萌芤海?/p>

將備用溶液滴涂在微傳感器的工作電極表面，常溫下靜置至干燥，用超純水沖洗工作電極表面，氮?dú)獯蹈纱谩?/p>

本發(fā)明提供的抗生素檢測(cè)方法，利用上述抗生素檢測(cè)裝置進(jìn)行抗生素檢測(cè)，包括以下步驟：

將參比電極、微傳感器的工作電極和對(duì)電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入鐵氰化鉀溶液，通過循環(huán)伏安法檢測(cè)電流響應(yīng)；

根據(jù)所得電流響應(yīng)與待檢測(cè)溶液的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；

獲取待檢測(cè)溶液的濃度，并根據(jù)所繪制的工作曲線，計(jì)算出待檢測(cè)溶液中抗生素的濃度。

本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果在于：

本發(fā)明提供的基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置及其制造方法、抗生素檢測(cè)方法，利用磁性納米核殼型微球良好的吸附性能，以及微傳感器自身具有的響應(yīng)快速、樣品用量少、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)有效、簡便、快速、準(zhǔn)確地對(duì)液相中的抗生素濃度進(jìn)行檢測(cè)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例一提供的基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為圖1中的a處放大圖，其示出了工作電極的結(jié)構(gòu)；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例一提供的基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置中的磁性納米核殼型微球的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例。

參見圖1，本發(fā)明實(shí)施例一提供了一種基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置，包括微傳感器100和帶電壓輸出的皮安計(jì)200。本發(fā)明利用微傳感器100檢測(cè)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的電信號(hào)，通過皮安計(jì)200進(jìn)行顯示，從而得到具體的電流值。將得到的電流值與工作曲線進(jìn)行比對(duì)，即可檢測(cè)出抗生素的實(shí)際濃度。皮安計(jì)200的電壓輸出端連接微傳感器100的電極接口，微傳感器100的工作電極上設(shè)置有pfsa高分子膜，pfsa高分子膜上嵌有磁性納米核殼型微球。磁性納米核殼型微球的核心為超順磁性fe3o4，超順磁性fe3o4的外部包裹著一層sio2,sio2層的外包裹著一層殼聚糖；殼聚糖的表面由分子印跡聚合物組成，用于特異性結(jié)合液相中的抗生素。

如圖2所示，微傳感器的尖端a外部由玻璃進(jìn)行包裹，在使用過程中玻璃保護(hù)層可以有效防止溶液流入電極內(nèi)部，保護(hù)其內(nèi)部電極絲110。工作電極的電極絲110采用碳纖維材料，在碳纖維絲的表面涂有pfsa高分子膜，在膜上嵌有大量的磁性納米核殼型微球111，這樣既提高了磁性納米核殼型微球在微傳感器上的粘附性與穩(wěn)定性，也使得微傳感器能更均勻的傳導(dǎo)電子。

如圖3所示，磁性納米核殼型微球111的核心由超順磁性fe3o4組成，使其微球具有良好的磁性能與吸附性能；中間包裹著一層sio2，用以保護(hù)fe3o4；外層包裹著一層殼聚糖，用以提高核殼型微球的吸附性能，并且作為分子印跡聚合物的載體；在殼聚糖的表面由分子印跡聚合物組成，用于特異性結(jié)合液相中的抗生素。

本發(fā)明利用磁性納米核殼型微球良好的吸附性能，以及得微傳感器本身具有的響應(yīng)快速、樣品量少、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)有效、簡便、快速、準(zhǔn)確地對(duì)液相中的抗生素濃度進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明實(shí)施例二提供了一種基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置的制造方法，包括以下步驟：

s100、利用多元醇法制備超順磁性fe3o4；

將一定量的fe(acac)3和三甘醇(treg)加入三頸燒瓶，通氮?dú)獗Ｗo(hù)并進(jìn)行攪拌；將混合物緩慢加熱至180℃，并在該溫度下保持30分鐘；然后快速加熱回流，并保持回流30分鐘；冷卻至室溫后，得到含有fe3o4的黑色均勻膠體懸浮液；在反應(yīng)溶液中加入乙醇和乙酸乙酯使納米顆粒進(jìn)行絮凝，利用磁場(chǎng)從溶液中分離絮凝物。然后將黑色沉淀再分散在乙醇中，用乙酸乙酯重新沉淀，磁力分離三次，完全除去過量的treg和副產(chǎn)物，通過在真空下干燥沉淀獲得固體產(chǎn)物，即為超順磁性fe3o4。

s200、基于制備的超順磁性fe3o4，利用溶膠-凝膠法制備fe3o4@sio2；

將fe3o4分散至去離子水中，利用超聲進(jìn)行分散15分鐘，得到一定濃度的磁流體；量取新鮮配制的磁流體20ml加到裝有150ml無水乙醇三頸燒瓶中，隨后加入適量氨水，最后將混合體系在30度的水浴條件下勻速機(jī)械攪拌；混合體系攪拌30分鐘后，向該體系中逐滴加入一定量的正硅酸乙酯，攪拌45分鐘后用進(jìn)樣針逐滴滴加適量的3-氨丙基三甲氧基硅烷；進(jìn)樣完成后，持續(xù)攪拌4小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，利用外加磁場(chǎng)將產(chǎn)物回收，用去離子水和無水乙醇依次進(jìn)行洗滌直至洗出液澄清，最后放入60度烘箱中干燥，得到fe3o4@sio2。

s300、基于制備的fe3o4@sio2，利用反向乳液交聯(lián)法制備fe3o4@sio2@cs；

稱取fe3o4@sio2超聲分散到去離子水中，然后將體系轉(zhuǎn)移至50度的恒溫水浴體系中；機(jī)械攪拌下，逐滴加入5％gla溶液，持續(xù)攪拌1小時(shí)，充分反應(yīng)；向體系中加入殼聚糖的乙酸溶液，攪拌30min；反應(yīng)結(jié)束后，再次向反應(yīng)體系中逐滴加入5％gla溶液；反應(yīng)1小時(shí)后，將體系自然冷卻至室溫；然后采用外加磁場(chǎng)將產(chǎn)品分離，并用無水乙醇洗滌至洗出液澄清，干燥得到fe3o4@sio2@cs。

s400、利用分子印跡技術(shù)，對(duì)fe3o4@sio2@cs進(jìn)行改性，得到對(duì)應(yīng)的抗生素分子印跡磁性核殼型微球fe3o4@sio2@cs-mip。

以檢測(cè)頭孢曲松鈉為例：配置含一定量的頭孢曲松鈉、甲醇、甲基丙烯酸的溶液，振蕩5分鐘，暗置約12小時(shí)，使頭孢曲松鈉與功能單體充分作用；將適量fe3o4@sio2@cs溶于溶液中，加入適量交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲分散5分鐘，通氮?dú)?5分鐘；在氮?dú)獗Ｗo(hù)的情況下加熱至60度，反應(yīng)24小時(shí)后，得到抗生素分子印跡磁性核殼型微球fe3o4@sio2@cs-mip。利用索氏提取器進(jìn)行抽提，反復(fù)多次，直至溶液中檢測(cè)不到抗生素分子，干燥備用。其他抗生素的分子印跡微傳感器的制備基本與之相同，只是在制備過程中投加不同的模版分子。

s500、基于制備的fe3o4@sio2@cs-mip，利用滴涂法，將fe3o4@sio2@cs-mip溶液涂覆在微傳感器的工作電極的表面；

取少量fe3o4@sio2@cs-mip分散到nafionpfsapolymer中，充分?jǐn)嚢枋蛊浞稚⒕鶆?；將溶液滴涂在碳纖維微電極表面，常溫下靜置至干燥，用超純水沖洗電極表面，氮?dú)獯蹈纱谩?/p>

s600、將得到的抗生素分子印跡微傳感器接入皮安計(jì)的電壓輸出端，得到抗生素檢測(cè)裝置。

本發(fā)明實(shí)施例三提供了一種抗生素檢測(cè)方法，利用上述實(shí)施例一提供的基于微傳感器的抗生素檢測(cè)裝置進(jìn)行抗生素檢測(cè)，包括以下步驟：

第一步，將參比電極、微傳感器的工作電極和對(duì)電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入8mmol/l的鐵氰化鉀溶液，通過循環(huán)伏安法檢測(cè)電流響應(yīng)；

第二步，根據(jù)所得電流響應(yīng)與待檢測(cè)溶液的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；

第三步，獲取待檢測(cè)溶液的濃度，并根據(jù)所繪制的工作曲線，計(jì)算出待檢測(cè)溶液中抗生素的濃度。

工作曲線指的是微傳感器的電流隨抗生素濃度變化的一種線性關(guān)系，是由多個(gè)數(shù)值點(diǎn)并通過數(shù)學(xué)擬合得到的。微傳感器檢測(cè)樣品得到的只是一個(gè)電流值，檢測(cè)得到的電流值同工作曲線對(duì)照可得到抗生素的濃度。

將參比電極、工作電極和對(duì)電極連接在電化學(xué)工作站上，在電解槽中加入8mmol/l的鐵氰化鉀溶液，通過循環(huán)伏安法檢測(cè)電流響應(yīng)；當(dāng)洗脫掉頭孢曲松鈉模板分子后，電流響應(yīng)明顯增大，因?yàn)樵谌コ０宸肿雍?，電極表面具有很多能特異性識(shí)別頭孢曲松鈉的立體空穴，[fe(cn)6]^3-/4-通過這些空穴到達(dá)電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。根據(jù)所得電流響應(yīng)與頭孢曲松鈉的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線，用于樣品檢測(cè)；對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行頭孢曲松鈉濃度的測(cè)定，其檢測(cè)結(jié)果對(duì)照所繪制的頭孢曲松鈉工作曲線，計(jì)算出樣品中頭孢曲松鈉的濃度。

本發(fā)明采用分子印跡聚合物結(jié)構(gòu)可控，可以針對(duì)不同的目標(biāo)分子制備不同的分子印跡聚合物，對(duì)不同模板分子均有良好的特異性。磁性納米核殼型微球環(huán)境耐受性好，可以在各種惡劣環(huán)境如高溫、有機(jī)溶劑和酸堿性環(huán)境中保持穩(wěn)定的性質(zhì)；易于保存，有很長的使用壽命，有效地解決了傳統(tǒng)生物微傳感器易失活、穩(wěn)定性差等問題。進(jìn)一步地，利用微傳感器檢測(cè)抗生素，相較于傳統(tǒng)的電極具有樣品用量少、響應(yīng)快速、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步的詳細(xì)說明，應(yīng)當(dāng)理解，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。特別指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。