本發(fā)明屬于有機(jī)磷酸酯阻燃劑的分析檢測領(lǐng)域，涉及一種適用于不同食物基質(zhì)的多種有機(jī)磷酸酯阻燃劑同時(shí)快速測定的方法。

背景技術(shù)：

有機(jī)磷酸酯阻燃劑（organophosphateflameretardants，opfrs）具有良好的阻燃性能，且兼有增塑、潤滑等多種功能，用途十分廣泛。隨著全球阻燃劑市場的不斷擴(kuò)大，以及鹵系阻燃劑（如多溴二苯醚類等）因環(huán)境安全性等原因被限制使用，opfrs作為一種優(yōu)秀的替代品，其社會(huì)需求和產(chǎn)量均呈快速增長趨勢。我國是opfrs生產(chǎn)大國，年產(chǎn)能已超10萬噸，而且使用量也在快速增長。絕大多數(shù)opfrs以添加劑形式在不同材料（家具、建材、紡織品以及電子產(chǎn)品等）中使用，導(dǎo)致其在生產(chǎn)和使用過程中容易向周圍環(huán)境釋放。opfrs的這種持續(xù)性排放已經(jīng)造成了其在各種環(huán)境介質(zhì)（大氣、灰塵、水體等）中的廣泛殘留。部分opfrs具有強(qiáng)烈生物效應(yīng)，具有潛在人體健康威脅。

食物在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、加工等過程中不可避免地受到食物接觸材料和環(huán)境介質(zhì)中的opfrs污染。早在上世紀(jì)80年代，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)食物中tnbp、tphp和tehp的殘留，并評(píng)估了人群的膳食暴露量。然而直至目前，仍僅有少量研究調(diào)查了opfrs在魚類、家禽、母乳等有限的人類食物樣品中的殘留。制約食物中opfrs分析的另一個(gè)原因是缺乏可靠、靈敏的分析方法。如上述魚類、禽類中opfrs研究采用了微波輔助萃?。╩ae）-凝膠滲透色譜（gpc）/固相萃取（spe）兩步凈化，gc-ms檢測的方法；母乳樣品采用了加速溶劑萃?。╝se）-gpc/柱層析凈化，uhplc-ms/ms檢測，然而這些方法，一般僅適用于特定的樣品種類，且均需耗費(fèi)大量溶劑且處理時(shí)間長，同時(shí)萃取時(shí)可能引入大量脂肪、蛋白等生物大分子，需額外的凈化步驟（gpc等）來降低基質(zhì)效應(yīng)的干擾。食物樣品種類多，基質(zhì)復(fù)雜，一般前處理手段難以完全排除基質(zhì)效應(yīng)對樣品痕量opfrs檢測的干擾，且通常一種前處理方法也難以滿足對不同樣品基質(zhì)的處理要求。

anastassiades等于2003年開發(fā)了經(jīng)典的quechers方法，樣品經(jīng)均質(zhì)后，用乙腈基質(zhì)分散萃取溶劑，采用n-丙基乙二胺（psa）等吸附劑去除絕大部分干擾物，并通過離心去除凈化，具有快速（quick）、簡單（easy）、廉價(jià)（cheap）、高效（effective）、可靠（rugged）、安全（safe）的特點(diǎn)。該方法問世以來，被眾多學(xué)者改進(jìn)推廣，已成功應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品等生物介質(zhì)中農(nóng)藥以及多種污染物殘留的分析。該方法受不同食物樣品基質(zhì)影響較小，且采用乙腈為萃取劑能有效降低脂肪等大分子的共萃出，簡化后續(xù)凈化步驟，且樣品處理設(shè)備簡單、溶劑用量少、快速。然而目前仍沒有該方法在食物樣品中opfrs的應(yīng)用研究報(bào)道。本方法基于quechers方法原理，建立了一種滿足多種食物基質(zhì)的前處理方法，并利用uplc-ms/ms的強(qiáng)大定性定量功能，實(shí)現(xiàn)了10種常用opfrs的多殘留快速檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種適用于不同食物基質(zhì)的opfrs多殘留快速檢測方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)應(yīng)用范圍窄、溶劑消耗量大、基質(zhì)干擾嚴(yán)重、靈敏度低等方面的不足。

本發(fā)明采用超聲輔助萃取樣品中的目標(biāo)物，操作簡單快捷、溶劑使用量少；無水mgso4+psa+c18的分散固相萃取凈化，能夠有效去除基質(zhì)中的干擾物質(zhì)；uplc-ms/ms具有較快的分析速度，較低的檢測限和高選擇性和靈敏度，適用于痕量污染物的檢測。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種適用于不同食物基質(zhì)的opfrs多殘留快速檢測方法，包括以下步驟：

（1）食物樣品處理：取食物樣品，勻漿；

（2）提取：取勻漿樣品到離心管中，加入內(nèi)標(biāo)混合液，平衡；加入提取溶劑，渦旋混勻，超聲萃??；

（3）凈化：于步驟（2）離心管中加入無水nacl和無水mgso4，渦旋混勻，離心，取上清液至新離心管，加入基質(zhì)分散固相萃取劑以及無水mgso4，渦旋混勻，離心，取上清液氮吹濃縮，用醇溶劑替換并定容，最后過濾膜，所得樣品液待測定；

（4）配置基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將空白食物混合樣品按上述步驟(1)至(3)處理，用所得樣品基質(zhì)溶液配置opfrs內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用醇定容并過濾；

（5）樣品檢測：

采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜測定步驟(3)、(4)所得溶液中的opfrs。

優(yōu)選地，步驟（1）食物樣品處理：取適量洗凈陰干的新鮮食物樣品可食用部分置于玻璃試管中，用勻漿機(jī)充分勻漿；

優(yōu)選地，步驟（2）提?。簻?zhǔn)確移取1.0-2.0g上述步驟（1）獲得的勻漿樣品于具塞玻璃離心管中，加入10-25ng內(nèi)標(biāo)混合液，平衡15-30min；加入4-5ml0.5%甲酸-乙腈溶液，渦旋混勻1min，超聲萃取15-30min；

優(yōu)選地，步驟（3）凈化：于步驟(2)離心管中加入400-500mg無水nacl和400-500mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min^-1離心5min，取上清液至新離心管，加入基質(zhì)分散固相萃取劑psa30-60mg和c1820-40mg以及200-400mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min^-1離心5min，取上清液氮吹濃縮，用甲醇溶劑替換并定容至0.5ml，最后過0.22μm濾膜，所得樣品液待測定；

優(yōu)選地，步驟（4）配置基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將空白食物混合樣品按上述步驟（1）至（3）處理，用所得樣品基質(zhì)溶液配置opfrs內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，甲醇定容并過濾；標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各目標(biāo)物系列濃度范圍在0.1-100ng·ml^-1，各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物濃度相同，為20-50ng·ml^-1；

優(yōu)選地，步驟（5）樣品檢測：采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜測定步驟（3）、（4）所得溶液中的opfrs。

優(yōu)選地，步驟（1）所述食物包括魚肉、畜禽肉、蔬菜、谷物、牛奶、雞蛋、豆腐的一種或多種的混合。

優(yōu)選地，所述opfrs包括tmp、tep、tcep、tcpp、tdcpp、tphp、tnbp、tbep、tcrp、tehp中的一種或多種的混合，更優(yōu)選地，所述opfrs同時(shí)包括tmp、tep、tcep、tcpp、tdcpp、tphp、tnbp、tbep、tcrp、tehp。

優(yōu)選地，步驟（2）中有機(jī)溶劑中添加適量的酸，所述的酸為有機(jī)酸，選自甲酸、乙酸、三氟乙酸等，所述的有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、乙腈等。

優(yōu)選地，步驟（3）中分散固相萃取劑為同時(shí)包含psa、c18；更優(yōu)選地，步驟（3）中無水nacl、無水mgso4、分散固相萃取劑psa、c18的用量分別為400-500mg，400-500mg，30-60mg，20-40mg。

優(yōu)選地，步驟（3）中樣品轉(zhuǎn)移時(shí)，用1-2ml0.5%甲酸-乙腈溶液潤洗原容器，潤洗液離心取上清液合并到新容器。

優(yōu)選地，步驟（3）中濃縮樣品時(shí)氮吹至近干，剩余樣品液體積50-100μl時(shí)進(jìn)行溶劑替換。

優(yōu)選地，步驟（4）中混合食物樣品由與步驟（1）中等量的魚肉、畜禽肉、蔬菜、谷物、牛奶、雞蛋、豆腐的一種或多種的混合充分勻漿而成，優(yōu)選地，選自由等量魚肉、雞肉、豬肉、蔬菜、牛奶充分勻漿而成的。

優(yōu)選地，步驟（4）中基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中目標(biāo)化合物濃度系列在0.1-100ng·ml^-1，內(nèi)標(biāo)物濃度與步驟（2）添加量一致，在20-50ng·ml^-1。

優(yōu)選地，步驟（5）中目標(biāo)物檢測方法包括定性檢測和定量檢測；

優(yōu)選地，定性檢測：檢測步驟（3）得到的樣品液中目標(biāo)化合物，若目標(biāo)物總離子流色譜峰保留時(shí)間與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中一致，且定性、定量離子對均在此保留時(shí)間檢出，則判斷檢出該目標(biāo)化合物。

優(yōu)選地，定量檢測：檢測步驟（4）得到的各濃度基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)工作液，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液中各濃度目標(biāo)物與各自內(nèi)標(biāo)物定量離子對色譜峰面積比值對其相應(yīng)濃度進(jìn)行回歸分析，得到內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線；將在相同條件下測得的步驟（3）樣品液中目標(biāo)物與各自內(nèi)標(biāo)物定量離子對色譜峰面積比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品液中目標(biāo)物含量，然后根據(jù)樣品液所代表的試樣質(zhì)量及回收率計(jì)算得到樣品中目標(biāo)物含量。

優(yōu)選地，步驟（5）檢測條件為：

色譜參數(shù)：

色譜柱：watersbehc18柱（2.1mm×100mm×1.7μm）；

柱溫：40℃；

進(jìn)樣量：2μl；

流動(dòng)相：a：超純水+0.1%甲酸，b：乙腈+0.1%甲酸；

流速：0.3ml·min^-1；

表1：梯度洗脫程序

質(zhì)譜參數(shù)：

離子源：電噴霧電離，正電離模式（esi+）；

質(zhì)譜檢測方式：多反應(yīng)選擇離子監(jiān)測（mrm）；

毛細(xì)管電壓：3.5kv；

脫溶劑氣：氮?dú)?，流?00l·h^-1，溫度為350℃；

碰撞氣：氬氣；

表2各opfrs的定性離子對、定量離子對、碰撞能量

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

（1）本發(fā)明采用改進(jìn)quechers方法對食物樣品進(jìn)行前處理，一方面以乙腈為基礎(chǔ)萃取劑，降低基質(zhì)干擾物的共萃取，同時(shí)使用psa和c18兩種分散萃取吸附劑，有效去除不同性質(zhì)的干擾雜質(zhì)，大大提高了方法靈敏度；另一方面大大降低方法溶劑使用量少、操作簡單、快速、重現(xiàn)性好，適合大通量的食物opfrs殘留快速分析要求。方法基質(zhì)效應(yīng)在92.3-116.1%（除三苯甲基磷酸酯為65.9%），平均回收率78.6-127.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.1-9.7%。

（2）本發(fā)明采用超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜對目標(biāo)物進(jìn)行定性定量分析，在11min內(nèi)實(shí)現(xiàn)10種opfrs及其內(nèi)標(biāo)物同時(shí)快速分析，比普通液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜大大縮短了分析時(shí)間，適合大通量的食物檢測，定性、定量更加準(zhǔn)確。方法定量限為0.05-0.42ng·g^-1。

（3）本發(fā)明可同時(shí)滿足魚肉類、畜禽肉類、蔬菜類、谷物類、蛋奶類等不同類型的食物分析。

附圖說明

圖1為由等量魚肉、雞肉、豬肉、蔬菜、牛奶充分勻漿而成的混合食物基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液10種opfrs（10ng·ml^-1）總離子流色譜圖

圖2為由等量魚肉、雞肉、豬肉、蔬菜、牛奶充分勻漿而成的混合食物基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液7種內(nèi)標(biāo)（20ng·ml^-1）總離子流色譜圖

圖3為實(shí)施例雞肉樣品中實(shí)測10種opfrs總離子流色譜圖

圖4為實(shí)施例雞肉樣品中7種基質(zhì)添加內(nèi)標(biāo)（添加濃度20ng·ml^-1）總離子流色譜圖

圖5為實(shí)施例青菜樣品中實(shí)測10種opfrs總離子流色譜圖

圖6為實(shí)施例青菜樣品檢測內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液7種基質(zhì)添加內(nèi)標(biāo)（添加濃度20ng·ml^-1）總離子流色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。

儀器和試劑

（1）儀器

超高效液相色譜（acquity，美國waters公司），電噴霧電離（esi）串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（xevotq-s，美國waters公司）；氮吹濃縮儀（n-evap-12，美國organomation公司）；t10高速分散機(jī)（德國ika公司）；低速離心機(jī)（centrifuge5430，德國eppendorf公司）；分析天平（220g/0.1mg，me204，瑞士mettler-toledo公司）。

（2）試劑

使用溶劑均為lc-ms級(jí)。純甲醇購自美國fisherscientific，乙腈和二氯甲烷（dichloromethane，dcm）購自j.t.baker公司。甲酸（99%）購自百靈威。填料psa購自美國agilent公司，c18購自美國welch公司，分析純無水mgso4、nacl均用乙腈洗滌、晾干，無水mgso4及nacl450℃烘烤4h以去除可能殘留的有機(jī)物。

opfrs標(biāo)準(zhǔn)品分別購自德國dr.ehrenstorfer公司和美國accustandard公司。內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品分別購自美國cambridgeisotopelaboratories和sigma-aldrich。

標(biāo)準(zhǔn)品分別用乙腈配制質(zhì)量濃度為1-2mg·ml^-1的儲(chǔ)備液，于-20℃保存。配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和低濃度單標(biāo)時(shí)用甲醇稀釋。

實(shí)施例1

本實(shí)施例著重于分析方法基質(zhì)效應(yīng)、加標(biāo)回收率和制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

步驟（1）：混合樣品處理

取等量魚肉、雞肉、豬肉、青菜、牛奶各10g，混合后充分勻漿；

步驟（2）：提取

準(zhǔn)確稱取勻漿液1.0g于10ml具塞玻璃離心管，分別編號(hào)為a1-a7，b1-b7，其中a1-a7分別添加50μl不同濃度（1、5、10、50、100、500、1000ng·ml^-1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液和20μl內(nèi)標(biāo)混合溶液（1000ng·ml^-1），a1-a7和b1-b7均加入4ml0.5%甲酸-乙腈，渦旋混勻1min，超聲萃取10-15min。另取10ml離心管，編號(hào)c1-c7，加入4ml含0.5%甲酸的乙腈，渦旋混勻1min，超聲萃取10-15min。

步驟（3）：凈化

a1-a7，b1-b7和c1-c7中均加入400mg無水nacl和400mg無水mgso4，渦旋混勻1min。在3000r·min^-1下離心5min，取上清液至相應(yīng)編號(hào)的新離心管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗后，再次離心取上清液，合并兩次上清液。在所有樣品上清液中加入50mgpsa，30mgc18，200mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min^-1離心5min后取上清液至相應(yīng)編號(hào)的玻璃氮吹管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗后，再次離心取上清液，合并兩次上清液，氮吹濃縮至近干，a1-a7樣品用甲醇復(fù)溶至0.5ml，b1-b7和c1-c7樣品分別加入50μl不同濃度（1、5、10、50、100、500、1000ng·ml^-1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合溶液和20μl內(nèi)標(biāo)混合溶液（1000ng·ml^-1），用甲醇定容至0.5ml。所有樣品過0.22μm濾膜，所得樣品液待測定。

步驟（3）：檢測

樣品檢測方法參數(shù)同發(fā)明內(nèi)容說明。

步驟（4）：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將樣品系列a1-a7，b1-b7及c1-c7均以各目標(biāo)化合物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物定量離子對的色譜峰面積比為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中曲線b為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作曲線，各曲線相關(guān)系數(shù)r²分別為a：0.985-0.999，b：0.996-0.999，c：0.993-0.999。

步驟（5）：方法基質(zhì)效應(yīng)、加標(biāo)回收率、方法定量限的計(jì)算

根據(jù)各響應(yīng)曲線的斜率，可以分別計(jì)算方法基質(zhì)效應(yīng)（matrixeffect，me）、絕對回收率（absoluterecovery，ra）、相對回收率（relativerecovery，rr）：

公式1

公式2

公式3

其中slopea、slopeb、slopec分別為樣品a、樣品b和樣品c得到經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正的相對響應(yīng)曲線的斜率。

質(zhì)譜儀器檢測限（instrumentdetectionlimits，idls）計(jì)算方法為：連續(xù)測定5次進(jìn)樣的不同濃度（c：0.5、1、5ng·ml^-1）溶劑加標(biāo)樣品的儀器絕對響應(yīng)值平均值（）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandarddeviation，rsd），檢測限計(jì)算公式為：

公式4

其中為響應(yīng)值在99%置信區(qū)間，自由度為5情況下的t檢驗(yàn)分布區(qū)間值。取不同加標(biāo)濃度計(jì)算值的最小值作為idl。并根據(jù)idl和相應(yīng)的相對回收率計(jì)算得到方法定量限（methodquantificationlimits,mqls）。計(jì)算公式為：

公式5

本實(shí)施例中各opfrs方法基質(zhì)效應(yīng)、加標(biāo)回收率、儀器檢測限和方法定量限如表3。

表3方法基質(zhì)效應(yīng)、回收率及檢測限

實(shí)施例2

本實(shí)施例為本發(fā)明應(yīng)用于雞肉中的opfrs檢測。

步驟（1）：雞肉樣品處理

取洗凈后雞胸肉5g，充分勻漿；

步驟（2）：提取

準(zhǔn)確稱取雞肉勻漿液1.0g共3份分別于10ml具塞玻璃離心管中，分別添加20μl內(nèi)標(biāo)混合溶液（1000ng·ml^-1），加入4ml0.5%甲酸-乙腈，渦旋混勻1min，超聲萃取10-15min。

步驟（3）：凈化

平行樣品中均加入300mg無水nacl和300mg無水mgso4，渦旋混勻1min。在3000r·min^-1下離心5min，取上清液至相應(yīng)新離心管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗后，再次離心取上清液，合并兩次上清液。上清液中加入40mgpsa，40mgc18，200mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min^-1離心5min后取上清液至相應(yīng)編號(hào)的玻璃氮吹管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗后，再次離心取上清液，合并兩次上清液，氮吹濃縮至近干，樣品用甲醇復(fù)溶至0.5ml，樣品過0.22μm濾膜，所得樣品液待測定。

步驟（4）：檢測

樣品檢測方法參數(shù)同發(fā)明內(nèi)容說明。

實(shí)施例3

本實(shí)施例為本發(fā)明應(yīng)用于青菜中的opfrs檢測。

步驟（1）：青菜樣品處理

取洗凈后青菜5g，充分勻漿；

步驟（2）：提取

準(zhǔn)確稱取1青菜勻漿液1.0g共3份分別于10ml具塞玻璃離心管中，分別添加20μl內(nèi)標(biāo)混合溶液（1000ng·ml^-1），加入4ml0.5%甲酸-乙腈，渦旋混勻1min，超聲萃取10-15min。

步驟（3）：凈化

平行樣品中均加入300mg無水nacl和400mg無水mgso4，渦旋混勻1min。在3000r·min^-1下離心5min，取上清液至相應(yīng)新離心管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗后，再次離心取上清液，合并兩次上清液。上清液中加入50mgpsa，30mgc18，200mg無水mgso4，渦旋混勻1min，3000r·min^-1離心5min后取上清液至相應(yīng)的玻璃氮吹管中。原離心管用2ml0.5%甲酸-乙腈潤洗后，再次離心取上清液，合并兩次上清液，氮吹濃縮至近干，樣品用甲醇復(fù)溶至0.5ml，樣品過0.22μm濾膜，所得樣品液待測定。

步驟（4）：檢測

樣品檢測方法參數(shù)同發(fā)明內(nèi)容說明。