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一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙及其制備方法與流程

文檔序號:12453943閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙,該膠體金試紙包括膠體金免疫層析反應(yīng)體系,其特征在于:其中金標(biāo)蛋白是重組的金黃色葡萄球菌A蛋白,包被抗原是金黃色葡萄球菌β-溶血素,質(zhì)控線是羊抗牛IgG。

2.一種權(quán)利要求1所述膠體金試紙的制備方法,其特征在于包括以下步驟:

1)取金黃色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纖維膜形成檢測線,取羊抗牛IgG包被所述硝酸纖維素膜形成質(zhì)控線,即得到分析膜;

2)制備膠體金溶液,并采用膠體金標(biāo)記體系標(biāo)記SPA,將所得的金標(biāo)蛋白在支持膜上固相化,即得到膠體金-SPA復(fù)合物結(jié)合墊;

3)取步驟1)所得的分析膜、步驟2)所得的膠體金-SPA復(fù)合物結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、底板,組裝試紙,即得到所述檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟1)所述金黃色葡萄球菌β-溶血素是通過以下方法制備的:金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株接種于THB培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng)48小時(shí),離心,取上清,經(jīng)過濾除菌、超濾、柱層析純化后,得到濃度為1~2mg/mL的金黃色葡萄球菌β-溶血素溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟2)所述膠體金溶液是通過檸檬酸鈉還原法制備的。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟2)所述膠體金標(biāo)記體系中:膠體金顆粒的粒徑為20~30nm。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟2)所述膠體金標(biāo)記體系中:蛋白與膠體金的結(jié)合反應(yīng)pH為5.9~6.2。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟2)所述膠體金標(biāo)記體系中:膠體金上結(jié)合的蛋白量為20~60μg/mL。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟2)所述膠體金標(biāo)記體系中:穩(wěn)定劑為PEG。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟3)中組裝試紙前先對步驟1)所得的分析膜執(zhí)行以下操作:取步驟1)所得的分析膜經(jīng)0.4%(v/v)濃度的甘油浸泡0.5h,再在37℃下烘干2h,而后取脫脂奶粉溶液和BSA溶液在4℃條件下封閉分析膜1h,而后洗滌、干燥。

10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟3)所述組裝試紙,具體包括以下操作:

A)取粘性底板;

B)將分析膜黏于底板4~10cm位置,檢測線在前,質(zhì)控線在后;

C)將膠體金-SPA復(fù)合物結(jié)合墊貼于底板2cm位置,上端壓于分析膜上端,重疊0.5cm;

D)將樣品墊黏貼于底板上,下端壓于膠體金-SPA復(fù)合物結(jié)合墊上端,重疊1cm;

E)吸水墊黏于底板上,上端壓于分析膜的下端,重疊1cm。

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