本發(fā)明涉及抗原檢測技術(shù)領(lǐng)域，進一步涉及基于膠體金免疫層析技術(shù)的金黃色葡萄球菌快速檢測方法，具體涉及一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙及其制備方法。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎，也稱奶牛乳腺炎，是奶牛乳腺受到物理、化學及病原微生物感染等刺激后引起的炎癥反應，是奶牛常見病之一，且發(fā)病率呈上升趨勢。全球約三分之一奶牛患有各種類型的乳房炎，在我國奶牛乳房炎發(fā)病率為30％-70％，其中隱性乳房炎發(fā)病率高達50％-70％，近半數(shù)由金黃色葡萄球菌引起。金黃色葡萄球菌致病性主要是由于它產(chǎn)生多種毒素和酶，這些毒力因子影響金黃色葡萄球菌吸附、入侵組織和逃避宿主防御的能力。β-溶血素是一種具有神經(jīng)磷脂酶c樣活性的溶血素，能特異性裂解細胞膜的鞘磷脂，而使細胞膜發(fā)生滲透，進而導致細胞溶解，在金屬離子存在時，β-溶血素活性更強。研究表明，牛源金黃色葡萄球菌比人源金黃色葡萄球菌更多表現(xiàn)β溶血，更少表現(xiàn)α溶血。在對奶牛乳腺上皮細胞的吸附、擴散中，β-溶血素是誘導紅細胞溶解主要的原因，同時還增強了α溶血素溶血能力。
奶牛乳房炎的分類有不同標準，按輕重緩急分為最急性乳房炎、急性乳房炎、慢性乳房炎及亞臨床乳房炎，按照臨床癥狀分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎。乳房炎診斷包括臨床診斷和實驗診斷，臨床診斷根據(jù)不同微生物引起的臨床癥狀不同，可對乳房炎進行初步診斷。由于隱性乳房炎無明顯臨床癥狀，需借助試驗方法對其進行診斷，一般包括體細胞計數(shù)法、乳汁pH檢查、電導率法、病原微生物鑒定、PCR診斷法、美國加州乳房炎檢驗法、蛋白組學診斷法、酶學檢驗法、微量元素檢驗法等。但這些方法對檢測人員的技術(shù)要求高，需要特殊的實驗室設備，且費時、不經(jīng)濟。為了開發(fā)更加快速、便捷的檢測方法，現(xiàn)有技術(shù)的研究者進行了諸多嘗試，至今仍未取得理想的使用效果，究其原因，是此類方法的開發(fā)不僅應當著眼于金黃色葡萄球菌的抗原特性本身，還應當結(jié)合奶牛乳房炎這一特定的使用環(huán)境。此外，現(xiàn)有技術(shù)的快捷檢測方法在抗原抗體反應層面設計不盡合理，所選用的顯色試劑的發(fā)光性能有待提升，從而造成檢測流程復雜、靈敏性不佳等問題；而現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的血清學檢測方法則更難以滿足上述要求。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙及其制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中對奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的常規(guī)血清學檢測方法流程復雜、操作時間較長。
本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中基于抗原抗體反應的金黃色葡萄球菌快速檢測方法，由于發(fā)光體系設計不合理從而導致檢測靈敏性較低。
為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙，該膠體金試紙包括膠體金免疫層析反應體系，其中：其中金標蛋白是重組的金黃色葡萄球菌A蛋白，包被抗原是金黃色葡萄球菌β-溶血素，質(zhì)控線是羊抗牛IgG。
一種上述膠體金試紙的制備方法，包括以下步驟：
1)取金黃色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纖維膜形成檢測線，取羊抗牛IgG包被所述硝酸纖維素膜形成質(zhì)控線，即得到分析膜；
2)制備膠體金溶液，并采用膠體金標記體系標記SPA，將所得的金標蛋白在支持膜上固相化，即得到膠體金-SPA復合物結(jié)合墊；
3)取步驟1)所得的分析膜、步驟2)所得的膠體金-SPA復合物結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、底板，組裝試紙，即得到所述檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙。
作為優(yōu)選，步驟1)所述金黃色葡萄球菌β-溶血素是通過以下方法制備的：金黃色葡萄球菌標準株接種于THB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48小時，離心，取上清，經(jīng)過濾除菌、超濾、柱層析純化后，得到濃度為1～2mg/mL的金黃色葡萄球菌β-溶血素溶液。
作為優(yōu)選，步驟2)所述膠體金溶液是通過檸檬酸鈉還原法制備的。
作為優(yōu)選，步驟2)所述膠體金標記體系中：膠體金顆粒的粒徑為20～30nm。
作為優(yōu)選，步驟2)所述膠體金標記體系中：蛋白與膠體金的結(jié)合反應pH為5.9～6.2。
作為優(yōu)選，步驟2)所述膠體金標記體系中：膠體金上結(jié)合的蛋白量為20～60μg/mL。
作為優(yōu)選，步驟2)所述膠體金標記體系中：穩(wěn)定劑為PEG。
作為優(yōu)選，步驟3)中組裝試紙前先對步驟1)所得的分析膜執(zhí)行以下操作：取步驟1)所得的分析膜經(jīng)0.4％(v/v)濃度的甘油浸泡0.5h，再在37℃下烘干2h，而后取脫脂奶粉溶液和BSA溶液在4℃條件下封閉分析膜1h，而后洗滌、干燥。
作為優(yōu)選，步驟3)所述組裝試紙，具體包括以下操作：
A)取粘性底板；
B)將分析膜黏于底板4～10cm位置，檢測線在前，質(zhì)控線在后；
C)將膠體金-SPA復合物結(jié)合墊貼于底板2cm位置，上端壓于分析膜上端，重疊0.5cm；
D)將樣品墊黏貼于底板上，下端壓于膠體金-SPA復合物結(jié)合墊上端，重疊1cm；
E)吸水墊黏于底板上，上端壓于分析膜的下端，重疊1cm。
本發(fā)明提供了一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙及其制備方法，該技術(shù)方案根據(jù)抗原、抗體特異結(jié)合的免疫反應原理，利用膠體金免疫層析技術(shù)，以重組的金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金標蛋白，以高純度的金黃色葡萄球菌β-溶血素作為包被抗原，利用羊抗牛IgG為質(zhì)控線制備膠體金試紙條。本發(fā)明在確定了上述反應體系的基礎(chǔ)上通過實驗手段優(yōu)選了具體操作條件，在保證反應性能的基礎(chǔ)上設計了可行的試紙復合模式，所得的產(chǎn)品可以檢測奶牛金黃色葡萄球菌抗體，與傳統(tǒng)的血清學方法比，更快速、特異、簡便，5分鐘內(nèi)可眼觀實驗結(jié)果。適用于金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎的診斷、檢疫和流行病學調(diào)查，由于其結(jié)果判斷直觀，成本低，養(yǎng)殖人員可根據(jù)需要隨時進行檢測，適合基層推廣。
具體實施方式
以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。
以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準確數(shù)值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。
除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。
以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
實施例1金黃色葡萄球菌β-溶血素提取與鑒定
1.1金黃色葡萄球菌β-溶血素提取
金黃色葡萄球菌標準株接種于THB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，按1％將其接種于1000mLTHB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)48小時，菌液10000×g離心15分鐘，棄菌體，上清通過0.45μm濾膜過濾除菌，經(jīng)10KD超濾管超濾、SephadexG-50柱層析純化后，Bradford法測β-溶血素濃度為1-2mg/mL，置于4℃冰箱保存待用。
1.2CAMP試驗
在綿陽血瓊脂平板上打直徑6mm孔，向孔中加入50μL純化的β-溶血素，37℃過夜，4℃1小時，可觀察到CAMP現(xiàn)象。
實施例2膠體金的制備
2.1檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒
100mL0.01％HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入一定量1％檸檬酸三鈉水溶液，開始有些藍色，然后淺藍、藍色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7-10分鐘出現(xiàn)透明的橙紅色，根據(jù)檸檬酸三鈉用量與膠體金顆粒直徑的關(guān)系制備直徑10nm、15nm、25nm、50nm、60nm的膠體金顆粒，電鏡下觀察其分散度和均勻度，選擇25nm粒徑進行標記。
2.2膠體金標記蛋白
將SPA經(jīng)0.05mol/L pH7.0NaCl4℃透析過夜，10000×g4℃離心1小時。
膠體金溶液經(jīng)0.1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至5.9-6.2。
將膠體金溶液分裝10管，每管1mL，將SPA調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值后，分裝10管，每管1ml，用0.05mol/L，pH9.0硼酸鹽緩沖液作系列稀釋為5-50mg/ml，分別取1ml加入1管膠體金溶液中，對照組加1ml稀釋液(不含蛋白質(zhì))，混勻；放置5min后，在上述各管內(nèi)加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻靜置2小時，觀察結(jié)果，根據(jù)顏色變化情況，確定SPA和膠體金的用量比例。按上述比例將SPA和膠體金混合后，每25mLSPA-膠體金混合物加入1mLPEG溶液。超速離心法純化膠體金-SPA復合物，最后用0.01mol/LPBS(0.02％NaN3)混懸，4℃保存。電鏡下觀察膠體金-SPA復合物的質(zhì)量和分散度。
實施例3試紙條的組裝
3.1 β-溶血素抗原包被量確定
采用斑點金免疫滲濾試驗確定抗原包被量，抗原經(jīng)PBS按1:2-1:256倍比稀釋，各取2μL點樣于0.45微孔濾膜上，干燥后，置于5％脫脂奶粉中封閉2小時，PBST洗滌3-5次，每次5分鐘，干燥后，滴加β-溶血素陽性血清，洗滌干燥后，滴加膠體金-SAP復合物，靜置觀察紅色斑點。
3.2羊抗牛IgG包被量的確定
方法同3.1。
3.3分析膜處理
NC膜經(jīng)0.4％甘油浸泡半小時，37℃烘干箱中烘干2小時，固定蛋白。不同濃度的脫脂奶粉(1％、3％、5％、7％)和BSA(1％、3％、5％、7％)封閉分析膜，4℃，1小時，滴加膠體金溶液，根據(jù)背景顏色選擇封閉液。
檢測線和質(zhì)控線包被的分析膜，經(jīng)封閉和洗滌后，分別置于37℃、室溫、4℃干燥，根據(jù)顏色變化選擇最佳干燥條件。
3.4膠體金-SPA復合物結(jié)合墊的制備
將玻璃纖維膜剪成規(guī)格均一的小塊作為結(jié)合墊，浸泡于膠體金-SPA溶液中30分鐘，室溫干燥。
3.5樣品墊制備
將玻璃纖維膜剪切成一定規(guī)格大小的條帶，浸入預處理液中于37℃孵育2小時，取出，37℃烘干，待用。
3.6分析膜的包被
將NC膜剪成一定規(guī)格條帶，兩端分別包被β-溶血素和羊抗牛IgG，包被β-溶血素作為檢測線(T線)，包被羊抗牛IgG作為質(zhì)控線(C線)，然后依據(jù)上述優(yōu)選的封閉條件和烘干條件進行處理。
3.7試紙條組裝
1)取粘性底板剪成一定規(guī)格；
2)將分析膜黏于底板4-10cm位置，檢測線在前，質(zhì)控線在后；
3)將金標結(jié)合墊貼于底板2cm位置，上端壓于分析膜上端，重疊0.5cm；
4)將樣品墊黏貼于底板上，下端壓于金標結(jié)合墊上端，重疊1cm；
5)吸水墊黏于底板上，上端壓于分析膜的下端，重疊1cm；
6)裝配成型的試紙條保存于干燥的環(huán)境中，待檢測用。
實施例4試紙條靈敏度檢測
將金黃色葡萄球菌β-溶血素陽性血清進行2倍梯度稀釋，用3批實驗室自制試紙條進行檢測，確定該試紙條對梯度稀釋的陽性血清的靈敏度，結(jié)果見表1。由表1可見，3批試制條檢測梯度稀釋陽性血清的結(jié)果一致，血清效價均價側(cè)至1:32倍。
表1對梯度稀釋的陽性血清的靈敏度檢測
注：結(jié)果判定標準為質(zhì)控線顯示紅色，檢測線顯示紅色為陽性；質(zhì)控線顯示紅色，檢測線不顯色為陰性；質(zhì)控線不顯色為試驗不成立。
實施例5試紙條特異性試驗
采用實驗室自制的3批奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌抗體膠體金試紙條對已知的10份陽性樣本、10份陰性樣本進行檢測。結(jié)果試紙條的平均陽性符合率為80％，有2份未檢出，平均陰性符合率為86.67％。具體結(jié)果見表2。
表2試紙條對已知樣本的特異性試驗
注：結(jié)果判定標準為檢測結(jié)果與已知結(jié)果一致判為陽性標為“+”，檢測結(jié)果與已知結(jié)果不一致判為陰性標為“-”
實施例6
本實施例公開一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙及其制備方法，該試紙可以檢測奶牛金黃色葡萄球菌抗體，與傳統(tǒng)的血清學方法比，更快速、特異、簡便。適用于金黃色葡萄球菌奶牛乳房炎的診斷、檢疫和流行病學調(diào)查。
本實施例的解決方案是根據(jù)抗原、抗體能特異結(jié)合的免疫學原理，利用膠體金免疫層析技術(shù)，以重組的金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)作為金標蛋白，以高純度的金黃色葡萄球菌β-溶血素作為包被抗原，利用羊抗牛IgG為質(zhì)控線制備膠體金試紙條。
上述檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙的其制備方法，包括以下步驟：
(1)提取金黃色葡萄球菌β-溶血素
金黃色葡萄球菌標準株接種于THB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48小時，離心，取上清，經(jīng)過濾除菌、超濾、柱層析純化后，測得濃度為1-2mg/mL，置于4℃冰箱保存待用。
(2)制備分析膜
將步驟(1)制備的金黃色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纖維膜形成檢測線(T線)，羊抗牛IgG包被硝酸纖維素膜形成質(zhì)控線(C線)，備用。
(3)制備膠體金-SPA復合物結(jié)合墊
利用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液，并采用標記體系標記SPA，將金標抗體在支持膜上固相化。
(4)組裝試紙條
將步驟(2)的分析膜、步驟(3)的膠體金-SPA復合物結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、底板組裝成膠體金快速檢測試紙條。
步驟(3)中的標記體系為：膠體金顆粒在25nm均一、穩(wěn)定，抗體蛋白與膠體金結(jié)合最適宜的pH為5.9-6.2，最適結(jié)合膠體金的蛋白量為20-60μg/mL，最佳穩(wěn)定劑為PEG。
本實施例的優(yōu)點在于：能有效檢測奶牛乳汁中或血清中的金黃色葡萄球菌抗體，與常規(guī)的血清學檢測方法相比，檢測快速、不需要使用人員的特殊技能，不需要特殊的儀器設備，5分鐘內(nèi)可眼觀實驗結(jié)果。
實施例7
一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙的制備方法，包括以下步驟：
1)取金黃色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纖維膜形成檢測線，取羊抗牛IgG包被所述硝酸纖維素膜形成質(zhì)控線，即得到分析膜；
2)制備膠體金溶液，并采用膠體金標記體系標記SPA，將所得的金標蛋白在支持膜上固相化，即得到膠體金-SPA復合物結(jié)合墊；
3)取步驟1)所得的分析膜、步驟2)所得的膠體金-SPA復合物結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、底板，組裝試紙，即得到所述檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙。
在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
步驟1)所述金黃色葡萄球菌β-溶血素是通過以下方法制備的：金黃色葡萄球菌標準株接種于THB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48小時，離心，取上清，經(jīng)過濾除菌、超濾、柱層析純化后，得到濃度為1mg/mL的金黃色葡萄球菌β-溶血素溶液。
步驟2)所述膠體金溶液是通過檸檬酸鈉還原法制備的。
步驟2)所述膠體金標記體系中：膠體金顆粒的粒徑為20nm。
步驟2)所述膠體金標記體系中：蛋白與膠體金的結(jié)合反應pH為5.9。
步驟2)所述膠體金標記體系中：膠體金上結(jié)合的蛋白量為20μg/mL。
步驟2)所述膠體金標記體系中：穩(wěn)定劑為PEG。
步驟3)中組裝試紙前先對步驟1)所得的分析膜執(zhí)行以下操作：取步驟1)所得的分析膜經(jīng)0.4％(v/v)濃度的甘油浸泡0.5h，再在37℃下烘干2h，而后取脫脂奶粉溶液和BSA溶液在4℃條件下封閉分析膜1h，而后洗滌、干燥。
步驟3)所述組裝試紙，具體包括以下操作：
A)取粘性底板；
B)將分析膜黏于底板4cm位置，檢測線在前，質(zhì)控線在后；
C)將膠體金-SPA復合物結(jié)合墊貼于底板2cm位置，上端壓于分析膜上端，重疊0.5cm；
D)將樣品墊黏貼于底板上，下端壓于膠體金-SPA復合物結(jié)合墊上端，重疊1cm；
E)吸水墊黏于底板上，上端壓于分析膜的下端，重疊1cm。
實施例8
一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙的制備方法，包括以下步驟：
1)取金黃色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纖維膜形成檢測線，取羊抗牛IgG包被所述硝酸纖維素膜形成質(zhì)控線，即得到分析膜；
2)制備膠體金溶液，并采用膠體金標記體系標記SPA，將所得的金標蛋白在支持膜上固相化，即得到膠體金-SPA復合物結(jié)合墊；
3)取步驟1)所得的分析膜、步驟2)所得的膠體金-SPA復合物結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、底板，組裝試紙，即得到所述檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙。
在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：
步驟1)所述金黃色葡萄球菌β-溶血素是通過以下方法制備的：金黃色葡萄球菌標準株接種于THB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48小時，離心，取上清，經(jīng)過濾除菌、超濾、柱層析純化后，得到濃度為2mg/mL的金黃色葡萄球菌β-溶血素溶液。
步驟2)所述膠體金標記體系中：膠體金顆粒的粒徑為30nm。
步驟2)所述膠體金標記體系中：蛋白與膠體金的結(jié)合反應pH為6.2。
步驟2)所述膠體金標記體系中：膠體金上結(jié)合的蛋白量為60μg/mL。
步驟3)所述組裝試紙，具體包括以下操作：
A)取粘性底板；
B)將分析膜黏于底板10cm位置，檢測線在前，質(zhì)控線在后；
C)將膠體金-SPA復合物結(jié)合墊貼于底板2cm位置，上端壓于分析膜上端，重疊0.5cm；
D)將樣品墊黏貼于底板上，下端壓于膠體金-SPA復合物結(jié)合墊上端，重疊1cm；
E)吸水墊黏于底板上，上端壓于分析膜的下端，重疊1cm。
實施例9
一種檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙的制備方法，包括以下步驟：
1)取金黃色葡萄球菌β-溶血素包被于硝酸纖維膜形成檢測線，取羊抗牛IgG包被所述硝酸纖維素膜形成質(zhì)控線，即得到分析膜；
2)制備膠體金溶液，并采用膠體金標記體系標記SPA，將所得的金標蛋白在支持膜上固相化，即得到膠體金-SPA復合物結(jié)合墊；
3)取步驟1)所得的分析膜、步驟2)所得的膠體金-SPA復合物結(jié)合墊、吸水紙、樣品墊、底板，組裝試紙，即得到所述檢測奶牛乳房炎中金黃色葡萄球菌的膠體金試紙。
以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。