本發(fā)明涉及慶大霉素檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種禽肉中慶大霉素檢測方法及檢測卡。

背景技術(shù)：

慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素，主要用于治療細(xì)菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌引起的感染，慶大霉素能與細(xì)菌核糖體30s亞基結(jié)合，阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，由于其應(yīng)用范圍廣、療效好、價(jià)格低廉而被廣泛用于獸醫(yī)臨床和動物飼料添加劑中，但是慶大霉素在應(yīng)用過程中易產(chǎn)生較大的毒副作用，大劑量的不規(guī)范使用會導(dǎo)致動物性食品中的藥物殘留嚴(yán)重超標(biāo)，其中以禽類較為普遍，人類食用這一類肉制品后會產(chǎn)生腎毒性、耳毒性、肌肉阻滯和過敏等一系列毒副作用，我國農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定慶大霉素在肉制品中的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為100μg/Kg，所以需要嚴(yán)格把控肉制品中的慶大霉素殘留量。

慶大霉素殘留量常用的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法(HPLC-MS/MS)液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)薄層色譜法(TLC)、免疫測定法等，這些檢測方法需要的器材價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，而且需要高技術(shù)的操作人員，需要耗費(fèi)大量的人力物力，進(jìn)而致使上述方法無法在大量篩選中應(yīng)用，缺少一種操作簡單，價(jià)格低廉，適合應(yīng)用與大量篩選中的檢測方法。

免疫層析法(immunochromatography)是近幾年來國外興起的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。

免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique) 是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，英文縮寫為：GICT。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種禽肉中慶大霉素檢測方法。

本發(fā)明提出一種禽肉中慶大霉素檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：

S1，取需要檢測的新鮮禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉組織，將取得的肌肉組織進(jìn)行粉碎處理；

S2，取兩只50ml的離心管，分別標(biāo)記為管A和管B，使用天平稱得2-4g S1中切碎的組織樣品，放入管A中待用；

S3，向S2中的管A中加入5-10ml濃度為2-3.3mol/L的乙酸乙酯溶液，手動將管A劇烈震蕩3min后，在25℃的環(huán)境中，將管A放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速調(diào)至4000r/min，定時5min；

S4，用滴管移取S3中管A離心得到的上清液1-3ml至管B中，氮?dú)獯蹈苫蛘呤褂?5℃空氣吹干；

S5，使用移液槍向管B中加入300-500μL濃度為1-1.5mol/L的PBS緩沖液和100-300μL濃度為1-1.5mmol/L的氯化鈣溶液，輕輕吹打液體潤洗管B內(nèi)壁，吹打時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡；

S6，將管B放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，用滴管取下層液體150μL作為待檢樣品；

S7，將S6中取得的待檢樣品滴入慶大霉素檢測卡上的滴液區(qū)，觀察反應(yīng)結(jié)果，完成檢測；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）和檢測線（T）均顯示紅色色帶，無論顏色深淺均可判斷檢測樣品為陰性；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）顯示為紅色色帶，檢測線（T）不顯示紅色色帶，初步判斷檢測樣品為陽性；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）不顯示紅色色帶時，無論檢測線（T）是否顯示紅色色帶，該檢測卡均判斷為失效。

一種禽肉中慶大霉素檢測卡，所述檢測卡包括上殼和下殼，所述上殼的下沿設(shè)置有插塊，所述下殼的上沿開設(shè)有插槽，所述插塊與插槽插接，所述上殼上分別開設(shè)有滴液孔和觀察窗，所述滴液孔位于觀察窗的一側(cè)，所述觀察窗的內(nèi)部粘接有透明保護(hù)殼，所述下殼的上表面對應(yīng)滴液孔的位置設(shè)置有樣品墊，所述樣品墊靠近觀察窗的一側(cè)設(shè)置有膠體金結(jié)合墊，所述膠體金結(jié)合墊靠近觀察窗的一側(cè)設(shè)置有NC膜，所述NC膜遠(yuǎn)離膠體金結(jié)合墊的一側(cè)設(shè)置有吸水墊，所述NC膜上沿著膠體金結(jié)合墊至吸水墊的方向依次包被有呈條狀的慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG。

優(yōu)選的，所述膠體金結(jié)合墊上包被有抗慶大霉素單克隆抗體和膠體金的結(jié)合物，所述慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG分別作為檢測卡上的檢測線T和質(zhì)控線C。

優(yōu)選的，所述樣品墊遠(yuǎn)離觀察窗的一側(cè)面與膠體金結(jié)合墊的一側(cè)面接觸，所述膠體金結(jié)合墊的另一側(cè)面與NC膜的一側(cè)面接觸，所述NC膜的另一側(cè)面與吸水墊的一側(cè)面接觸。

優(yōu)選的，所述透明保護(hù)殼為無色透明有機(jī)玻璃。

有益效果

本發(fā)明提供了一種禽肉中慶大霉素檢測方法及檢測卡，具備以下有益效果：

該禽肉中慶大霉素檢測方法及檢測紙，通過在切碎的待檢組織樣中加入5-10ml的乙酸乙酯，手動將管A劇烈震蕩3min后，在25℃的環(huán)境中使用離心機(jī)進(jìn)形離心后取上清液，能夠有效的對樣品肌肉組織進(jìn)行纖維脫脂，有效降低脂肪對檢測結(jié)果的影響，結(jié)合免疫層析法和免疫膠體金技術(shù)，樣本中的慶大霉素在側(cè)向移動的過程中與膠體金結(jié)合墊內(nèi)的抗慶大霉素單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和NC膜檢測線上慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物的結(jié)合，利用膠體金顏色的變化體現(xiàn)在NC膜上檢測判斷禽肉中是否含有慶大霉素，操作方便，價(jià)格低廉，適合作為慶大霉素大量篩選檢測的檢測方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明檢測卡結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本發(fā)明檢測卡剖視圖。

圖中：1上殼、2下殼、3插塊、4插槽、5滴液孔、6觀察窗、7保護(hù)殼、8樣品墊、9膠合金結(jié)合墊、10 NV膜、11吸水墊、12慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物、13羊抗鼠IgG。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖來對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

請參閱附圖1-2，本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案，一種禽肉中慶大霉素檢測卡，檢測卡包括上殼1和下2殼，上殼1的下沿設(shè)置有插塊3，下殼2的上沿開設(shè)有插槽4，插塊3與插槽4插接，上殼1上分別開設(shè)有滴液孔5和觀察窗6，滴液孔5位于觀察窗6的一側(cè)，觀察窗6的內(nèi)部粘接有透明保護(hù)殼7，透明保護(hù)殼7為無色透明有機(jī)玻璃，下殼2的上表面對應(yīng)滴液孔5的位置設(shè)置有樣品墊8，樣品墊8靠近觀察窗6的一側(cè)設(shè)置有膠體金結(jié)合墊9，膠體金結(jié)合墊9靠近觀察窗6的一側(cè)設(shè)置有NC膜10，NC膜10遠(yuǎn)離膠體金結(jié)合墊9的一側(cè)設(shè)置有吸水墊11，NC膜10上沿著膠體金結(jié)合墊9至吸水墊11的方向依次包被有呈條狀的慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物12和羊抗鼠IgG 13，膠體金結(jié)合墊9上包被有抗慶大霉素單克隆抗體和膠體金的結(jié)合物，慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物12和羊抗鼠IgG13分別作為檢測卡上的檢測線T和質(zhì)控線C，樣品墊8遠(yuǎn)離觀察窗6的一側(cè)面與膠體金結(jié)合墊9的一側(cè)面接觸，膠體金結(jié)合墊9的另一側(cè)面與NC膜10的一側(cè)面接觸，NC膜10的另一側(cè)面與吸水墊11的一側(cè)面接觸。

實(shí)施例一

本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案，一種禽肉中慶大霉素檢測方法，檢測方法包括以下步驟：

S1，取需要檢測的新鮮禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉組織，將取得的肌肉組織進(jìn)行粉碎處理；

S2，取兩只50ml的離心管，分別標(biāo)記為管A和管B，使用天平稱得2g S1中切碎的組織樣品，放入管A中待用；

S3，向S2中的管A中加入6ml濃度為2mol/L的乙酸乙酯溶液，手動將管A劇烈震蕩3min后，在25℃的環(huán)境中，將管A放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速調(diào)至4000r/min，定時5min；

S4，用滴管移取S3中管A離心得到的上清液1ml至管B中，氮?dú)獯蹈苫蛘呤褂?5℃空氣吹干；

S5，使用移液槍向管B中加入300μL濃度為1.3mol/L的PBS緩沖液和100μL濃度為1.3mmol/L的氯化鈣溶液，輕輕吹打液體潤洗管B內(nèi)壁，吹打時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡；

S6，將管B放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，用滴管取下層液體150μL作為待檢樣品；

S7，將S6中取得的待檢樣品滴入慶大霉素檢測卡上的滴液區(qū)，觀察反應(yīng)結(jié)果，完成檢測；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）和檢測線（T）均顯示紅色色帶，無論顏色深淺均可判斷檢測樣品為陰性；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）顯示為紅色色帶，檢測線（T）不顯示紅色色帶，初步判斷檢測樣品為陽性；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）不顯示紅色色帶時，無論檢測線（T）是否顯示紅色色帶，該檢測卡均判斷為失效。

實(shí)施例二

本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案，一種禽肉中慶大霉素檢測方法，檢測方法包括以下步驟：

S1，取需要檢測的新鮮禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉組織，將取得的肌肉組織進(jìn)行粉碎處理；

S2，取兩只50ml的離心管，分別標(biāo)記為管A和管B，使用天平稱得3g S1中切碎的組織樣品，放入管A中待用；

S3，向S2中的管A中加入7ml濃度為2.3mol/L的乙酸乙酯溶液，手動將管A劇烈震蕩3min后，在25℃的環(huán)境中，將管A放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速調(diào)至4000r/min，定時5min；

S4，用滴管移取S3中管A離心得到的上清液2ml至管B中，氮?dú)獯蹈苫蛘呤褂?5℃空氣吹干；

S5，使用移液槍向管B中加入400μL濃度為1.4mol/L的PBS緩沖液和200μL濃度為1.4mmol/L的氯化鈣溶液，輕輕吹打液體潤洗管B內(nèi)壁，吹打時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡；

S6，將管B放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，用滴管取下層液體150μL作為待檢樣品；

S7，將S6中取得的待檢樣品滴入慶大霉素檢測卡上的滴液區(qū)，觀察反應(yīng)結(jié)果，完成檢測；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）和檢測線（T）均顯示紅色色帶，無論顏色深淺均可判斷檢測樣品為陰性；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）顯示為紅色色帶，檢測線（T）不顯示紅色色帶，初步判斷檢測樣品為陽性；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）不顯示紅色色帶時，無論檢測線（T）是否顯示紅色色帶，該檢測卡均判斷為失效。

實(shí)施例三

本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案，一種禽肉中慶大霉素檢測方法，檢測方法包括以下步驟：

S1，取需要檢測的新鮮禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉組織，將取得的肌肉組織進(jìn)行粉碎處理；

S2，取兩只50ml的離心管，分別標(biāo)記為管A和管B，使用天平稱得4g S1中切碎的組織樣品，放入管A中待用；

S3，向S2中的管A中加入9ml濃度為3.3mol/L的乙酸乙酯溶液，手動將管A劇烈震蕩3min后，在25℃的環(huán)境中，將管A放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速調(diào)至4000r/min，定時5min；

S4，用滴管移取S3中管A離心得到的上清液3ml至管B中，氮?dú)獯蹈苫蛘呤褂?5℃空氣吹干：

S5，使用移液槍向管B中加入500μL濃度為1.5mol/L的PBS緩沖液和300μL濃度為1.5mmol/L的氯化鈣溶液，輕輕吹打液體潤洗管B內(nèi)壁，吹打時應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡；

S6，將管B放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，用滴管取下層液體150μL作為待檢樣品；

S7，將S6中取得的待檢樣品滴入慶大霉素檢測卡上的滴液區(qū)，觀察反應(yīng)結(jié)果，完成檢測；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）和檢測線（T）均顯示紅色色帶，無論顏色深淺均可判斷檢測樣品為陰性；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）顯示為紅色色帶，檢測線（T）不顯示紅色色帶，初步判斷檢測樣品為陽性；

當(dāng)檢測卡上的質(zhì)控線（C區(qū)）不顯示紅色色帶時，無論檢測線（T）是否顯示紅色色帶，該檢測卡均判斷為失效。

綜上所述，該禽肉中慶大霉素檢測方法及檢測卡，通過在切碎的待檢組織樣中加入5-10ml的乙酸乙酯，手動將管A劇烈震蕩3min后，在25^。C的環(huán)境中使用離心機(jī)進(jìn)形離心后取上清液，能夠有效的對樣品肌肉組織進(jìn)行纖維脫脂，有效降低脂肪對檢測結(jié)果的影響，結(jié)合免疫層析法和免疫膠體金技術(shù)，樣本中的慶大霉素在側(cè)向移動的過程中與膠體金結(jié)合墊9內(nèi)的抗慶大霉素單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和NC膜10檢測線上慶大霉素-載體蛋白偶聯(lián)物12的結(jié)合，利用膠體金顏色的變化體現(xiàn)在NC膜10上檢測判斷禽肉中是否含有慶大霉素，操作方便，價(jià)格低廉，適合作為慶大霉素大量篩選檢測的檢測方法。

需要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語僅僅用來將一個實(shí)體或者操作與另一個實(shí)體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實(shí)體或操作之間存在任何這種實(shí)際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下。由語句“包括一個......限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素”。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。