本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域。具體地，涉及一種傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)磁性微粒及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：雞傳染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease；IBD)又稱雞傳染性腔上囊病，是由傳染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus；IBDV)引起的一種急性、接觸傳染性疾病。傳染性法氏囊病毒屬于雙RNA病毒科，包括兩個(gè)血清型。以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮和法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重受損為特征。從而引起雞的免疫機(jī)能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果。發(fā)病率高，幾乎達(dá)100％，死亡率低，一般為5％～15％，是目前養(yǎng)禽業(yè)最重要的疾病之一。雛雞易發(fā)病，2～3天內(nèi)可波及60％～70％的雞，發(fā)病后3～4天死亡達(dá)到高峰，7～8天后死亡停止。病初精神沉郁，采食量減少，飲水增多，有些自啄肛門，排白色水樣稀糞，重者脫水，臥地不起，極度虛弱、最后死亡。耐過雛雞貧血消瘦，生長緩慢。剖檢可見：法氏囊發(fā)生特征性病變，法氏囊呈黃色膠胨樣水腫、質(zhì)硬、粘膜上覆蓋有奶油色纖維素性滲出物。有時(shí)法氏囊粘膜嚴(yán)重發(fā)炎，出血，壞死，萎縮。另外，病死雞表現(xiàn)脫水，腿和胸部肌肉常有出血，顏色暗紅。腎腫脹，腎小管和輸尿管充滿白色尿酸鹽。脾臟及腺胃和肌胃交界處粘膜出血。傳染性法氏囊抗原VP2蛋白是主要的中和性抗原蛋白，其抗體是疫苗免疫后抗體水平的監(jiān)測(cè)和病毒感染后抗體水平檢測(cè)的主要標(biāo)的，抗體水平高低與其免疫或感染狀況直接相關(guān)，通過抗體水平的監(jiān)測(cè)來制定合理、有效的免疫程序是提高群體免疫水平的保證?，F(xiàn)有的檢測(cè)機(jī)構(gòu)有獸醫(yī)站、疫苗公司、養(yǎng)殖場(chǎng)等存在著大量的樣本，也對(duì)大通量的傳染性法氏囊抗體檢測(cè)試劑盒和儀器有著需求。目前建立并應(yīng)用的傳染性法氏囊抗體檢測(cè)方法有瓊擴(kuò)試驗(yàn)、ELISA、病毒中和試驗(yàn)、膠體金試紙條等方法，其中瓊擴(kuò)試驗(yàn)?zāi)壳笆莻魅拘苑ㄊ夏铱贵w檢測(cè)最常用的方法，通過倍比稀釋抗體血清和抗原觀察是否發(fā)生沉淀判斷抗體滴度；ELISA試驗(yàn)較為靈敏，但難以定量；病毒中和試驗(yàn)是通過傳染性法氏囊病毒和抗體在細(xì)胞上中進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)來判定抗體滴度，能較全面反映中和抗體的高低，全過程為病毒滴定、抗體中和、結(jié)果判定等過程需5-7天時(shí)間，全過程只能人工來操作、判定，重復(fù)性差；膠體金方法能快速得出結(jié)果，但是只能定性，難以定量，限制了應(yīng)用范圍?，F(xiàn)有的瓊擴(kuò)試驗(yàn)、ELISA、病毒中和試驗(yàn)、膠體金等的方法難以滿足。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種高靈敏度、高準(zhǔn)確性、花費(fèi)時(shí)間較短的檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明第一方面，提供了一種傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒的制備方法，包括步驟：(a)提供磁性微粒溶液、和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段；(b)將(a)中的磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段進(jìn)行混合得到磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段相偶聯(lián)的混合液，其中，磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例為5-15mg：0.5-10nmol，較佳地，5-10mg：1-8nmol，更佳地，8-10mg：1.2-5mg，例如，1.1-2.27nmol。在另一優(yōu)選例中，所述步驟(b)中還包括步驟(b’)：向所述的混合液中加入交聯(lián)劑和/或催化劑，從而獲得經(jīng)交聯(lián)和/或經(jīng)催化的混合液。所述步驟(b)中還包括步驟(b”):向所述的混合中加入標(biāo)記物，從而獲得經(jīng)標(biāo)記的混合液。在另一優(yōu)選例中，所述的傳染性法氏囊病毒抗原或其片段包括VP2蛋白或其片段。在另一優(yōu)選例中，所述標(biāo)記物包括發(fā)光標(biāo)記物，例如，光激發(fā)發(fā)光標(biāo)記物、電激發(fā)發(fā)光標(biāo)記物。在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)光標(biāo)記物包括吖啶酯、堿性磷酸酶、和/或過氧化物酶。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟(c)：向(b)所獲得的混合液中加入封閉劑。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒與所述的傳染性法氏囊病毒抗原或其片段的結(jié)合方式包括直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)。在另一優(yōu)選例中，所述的間接偶聯(lián)包括通過以下方式介導(dǎo)的偶聯(lián)：鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)的偶聯(lián)、抗FITC抗體-FITC偶聯(lián)。在另一優(yōu)選例中，所述的直接偶聯(lián)包括通過磁性微粒羧基與蛋白氨基縮合形成酰胺、磁性微粒氨基與蛋白氨基通過戊二醛交聯(lián)形成五碳橋、或甲苯磺?；判晕⒘Ｅc蛋白氨基共價(jià)偶聯(lián)相連接。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒核心為氧化鐵。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒還含有活性基團(tuán)。在另一優(yōu)選例中，所述的活性基團(tuán)包括羥基、羧基、磺?；虬被钚曰鶊F(tuán)。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒的粒徑為0.1-5μm，優(yōu)選地為1-3μm。在另一優(yōu)選例中，所述的磁性微粒溶液中,磁性微粒粒徑CV<3％。在另一優(yōu)選例中，所述傳染性法氏囊病毒抗原或其片段包括：傳染性法氏囊病毒全長、天然傳染性法氏囊病毒片段、重組表達(dá)的傳染性法氏囊病毒全長、重組表達(dá)的傳染性法氏囊病毒片段，傳染性法氏囊病毒多肽、或傳染性法氏囊病毒化學(xué)合成物。在另一優(yōu)選例中，所述傳染性法氏囊病毒VP2蛋白的全長序列如SEQIDNO.:1所示。在另一優(yōu)選例中，所述傳染性法氏囊病毒VP2蛋白片段的序列如SEQIDNO.:2所示。在另一優(yōu)選例中，所述傳染性法氏囊病毒VP2蛋白多肽片段的序列如SEQIDNO.:3所示。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：(a)提供磁性微粒溶液、和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段；(b)將(a)中的磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段進(jìn)行混合得到混合液，其中，磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例為10mg：0.6-9.5nmol；(b’)向(b)中加入交聯(lián)劑或催化劑，從而得到經(jīng)交聯(lián)或催化的混合液；(b”)向(b’)經(jīng)交聯(lián)或催化的混合液中加入封閉劑。本發(fā)明第二方面，提供了一種傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒，其中，磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段的比例為5-15mg：0.5-10nmol，較佳地，5-10mg：1-8nmol，更佳地，8-10mg：1.2-5nmol，例如，10mg：1.1-2.27nmol。在另一優(yōu)選例中，所述傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒由本發(fā)明第一方面所述的方法制成。本發(fā)明第三方面，提供了本發(fā)明第二方面所述傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒的用途，用于制備檢測(cè)傳染性法氏囊抗體的檢測(cè)試劑和/或試劑盒。本發(fā)明第四方面，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒含有容器和說明書，所述的容器內(nèi)含有本發(fā)明第二方面所述的傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒。在另一優(yōu)選例中，所述的容器內(nèi)還含有獨(dú)立包裝的質(zhì)控品或校準(zhǔn)品、或清洗液。在另一優(yōu)選例中，所述校準(zhǔn)品包括傳染性法氏囊病毒抗體陰性或陽性血清稀釋液。在另一優(yōu)選例中，所述清洗液包括含有Tween20的Tris緩沖液或含有Tween20的PBS緩沖液。在另一優(yōu)選例中，所述Tween20的Tris緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為8.0。在另一優(yōu)選例中，所述Tween20的PBS緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為7.0。在另一優(yōu)選例中，所述的說明書記載了含有本發(fā)明第二方面所述的傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒的使用方法，包括步驟：(i)提供待測(cè)樣品、和所述傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒；(ii)將所述待測(cè)樣品與所述傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微?；旌喜⑦M(jìn)行反應(yīng)；(iii)將(ii)中反應(yīng)后的混合液進(jìn)行洗滌并加入發(fā)光底物；(iv)對(duì)(iii)中加入發(fā)光底物后的混合液進(jìn)行發(fā)光值檢測(cè)，從而定量或定性檢測(cè)待測(cè)樣品中的傳染性法氏囊病毒抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的待測(cè)樣品包括血液樣品、體液樣品和組織樣品。本發(fā)明第五方面，提供了一種檢測(cè)傳染性法氏囊病毒抗體的檢測(cè)方法，包括步驟：(i)提供待測(cè)樣品、和所述傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒；(ii)將所述待測(cè)樣品與所述傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微?；旌喜⑦M(jìn)行反應(yīng)；(iii)將(ii)中反應(yīng)后的混合液進(jìn)行洗滌并加入發(fā)光底物；(iv)對(duì)(iii)中加入發(fā)光底物后的混合液進(jìn)行發(fā)光值檢測(cè)，從而定量或定性檢測(cè)待測(cè)樣品中的傳染性法氏囊病毒抗體。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1是本發(fā)明制備實(shí)施例1中的校準(zhǔn)曲線；圖2是本發(fā)明制備實(shí)施例2中的校準(zhǔn)曲線；圖3是本發(fā)明制備實(shí)施例3中的校準(zhǔn)曲線；圖4是本發(fā)明制備實(shí)施例4中的校準(zhǔn)曲線；圖5是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中羧基磁珠最適的蛋白用量曲線；圖6是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1中甲苯磺?；胖樽钸m的蛋白用量曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，采用特定比例的傳染性法氏囊病毒抗原或其片段和磁性微粒進(jìn)行混合，可以獲得包被飽和均質(zhì)、空間構(gòu)象穩(wěn)定的包被磁性微粒，所包被的磁性微粒上作為傳染性法氏囊病毒抗體的檢測(cè)試劑，能夠高靈敏、高準(zhǔn)確率地檢出樣本中傳染性法氏囊病毒抗體，且在最大程度上節(jié)省了試劑制備成本。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。傳染性法氏囊病毒抗原或其片段可用于本發(fā)明的傳染性法氏囊病毒抗原蛋白或其片段沒有特殊限制，可以包括所述天然或重組的傳染性法氏囊病毒抗原蛋白的全長或其片段。優(yōu)選地，可包括傳染性法氏囊病毒VP2蛋白全長序列如SEQIDNO.:1所示，其含有469個(gè)氨基酸，分子量57kD；傳染性法氏囊病毒VP2蛋白片段序列如SEQIDNO.:2所示，其含有134氨基酸，分子量17kD；傳染性法氏囊病毒VP2蛋白多肽序列如SEQIDNO.:3所示，其含有50氨基酸，分子量5.5kD。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化所述多肽。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。所述多肽的純度還可以用氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。本發(fā)明的所述蛋白或其片段可以是重組的、天然的、合成的蛋白或其片段。本發(fā)明所述蛋白或其片段可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、植物)中產(chǎn)生。磁性微粒如本文所用，術(shù)語“磁性微粒”、“磁性顆?！薄ⅰ按胖椤笨苫Q使用，指的是內(nèi)部有磁性核心，外部包覆聚合物的微粒。包覆層含有活性基團(tuán)，可與蛋白、多肽等偶聯(lián)，并不影響蛋白、多肽的免疫活性；磁核使微粒在外部磁場(chǎng)作用下可定向移動(dòng)聚集，離開磁場(chǎng)之后可在溶液中均勻分散，從而兼顧了抗原抗體的液相反應(yīng)和抗原抗體復(fù)合物與未反應(yīng)物質(zhì)的分離?？捎糜诒景l(fā)明的磁性微粒沒有特殊限制，可以是任何具有磁性核心、表面附有聚合物的磁性顆粒。可用于本發(fā)明磁性微粒的核心為氧化鐵(Fe3O4)；可用于本發(fā)明磁性顆粒表面的聚合物包括聚苯乙烯、丙烯酸樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯等。本發(fā)明磁性微粒的大小優(yōu)選為0.1-5μm，優(yōu)選為1-3μm。可用于本發(fā)明的磁性微粒通常以微粒群溶液的形式存在，通常，所述微粒群溶液中，微粒大小形狀高度均一，粒徑CV<3％?？捎糜诒景l(fā)明的磁性微粒還可以含有多個(gè)活性基團(tuán)，從而通過化學(xué)交聯(lián)的方式將蛋白、多肽結(jié)合于磁性微粒表面。優(yōu)選地，所述的活性基團(tuán)包括羥基、羧基、磺?；虬被钚曰鶊F(tuán)。含有活性基團(tuán)的磁性微?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備獲得或直接市售可得。例如購于日本JSR公司，貨號(hào)：MagnosphereTMMS300/Caboxyl的含有羧基的磁性微粒；或購于日本JSR公司，貨號(hào)：MagnosphereTMMS300/Tosyl含有甲苯磺?；拇判晕⒘！魅拘苑ㄊ夏也《究乖蚱淦闻悸?lián)的磁性微粒及其制備方法本發(fā)明提供了一種傳染性法氏囊病毒抗原或其片段偶聯(lián)的磁性微粒及其制備方法，所述方法包括步驟：(a)提供磁性微粒溶液、和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段；(b)將(a)中的磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段進(jìn)行混合得到磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段相偶聯(lián)的混合液，其中，磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例為5-15mg：0.5-10nmol，較佳地，5-10mg：1-8nmol，更佳地，8-10mg：1.2-5mg，例如，1.1-2.27nmol；(c)：向(b)所獲得的混合液中加入封閉劑。通常，所述步驟(b)中還包括步驟(b’)：向所述的混合液中加入交聯(lián)劑和/或催化劑，從而獲得經(jīng)交聯(lián)和/或經(jīng)催化的混合液。所述步驟(b)中還包括步驟(b”):向所述的混合中加入標(biāo)記物，從而獲得經(jīng)標(biāo)記的混合液。所述方法包括步驟：(a)提供磁性微粒溶液、和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段；(b)將(a)中的磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段進(jìn)行混合得到混合液，其中，磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例為5-15mg：0.5-10nmol，較佳地，5-10mg：1-8nmol，更佳地，8-10mg：1.2-5mg，例如，1.1-2.27nmol；(b’)向(b)中加入交聯(lián)劑或催化劑，從而得到經(jīng)交聯(lián)或催化的混合液；(b”)向(b’)經(jīng)交聯(lián)或催化的混合液中加入封閉劑?？捎糜诒景l(fā)明的交聯(lián)劑和催化劑沒有特別限制，可以是本領(lǐng)域中常用于磁珠表面包裹的交聯(lián)劑或催化劑。優(yōu)選地，所述的交聯(lián)劑和催化劑包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、戊二醛、硫酸銨?？捎糜诒景l(fā)明的標(biāo)記物沒有特殊限制，可以是生物檢測(cè)領(lǐng)域中用于顯色、顯影的常用標(biāo)記物。優(yōu)選地，所述標(biāo)記物包括發(fā)光標(biāo)記物，例如光激發(fā)發(fā)光標(biāo)記物、電激發(fā)發(fā)光標(biāo)記物。例如，所述發(fā)光標(biāo)記物包括吖啶酯、堿性磷酸酶、和/或過氧化物酶。其可通過本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行制備或配置。優(yōu)選的是，所述發(fā)光標(biāo)記物為吖啶酯時(shí)，發(fā)光底物由第一發(fā)光底物和第二發(fā)光底物組成，第一發(fā)光底物為含有0.1mol/L硝酸、0.1％過氧化氫的溶液，第二發(fā)光底物為含有2％Tween-20、0.25mol/LNaOH的溶液；所述發(fā)光標(biāo)記物為堿性磷酸酶時(shí)，發(fā)光底物為以金剛烷為基礎(chǔ)的底物液；所述發(fā)光標(biāo)記物為過氧化物酶時(shí)，發(fā)光底物由第一發(fā)光底物和第二發(fā)光底物組成，第一發(fā)光底物為含有0.5g/L魯米諾、0.1g/L對(duì)碘酚的溶液，第二發(fā)光底物為0.625g/L過氧化脲溶液?？捎糜诒景l(fā)明傳染性法氏囊病毒抗原或其片段偶聯(lián)的磁性微粒中磁性微粒溶液和傳染性法氏囊病毒抗原或其片段的混合比例為10mg：0.6-9.5nmol，優(yōu)選為10mg：2.0-8.0nmol。在該范圍以下時(shí)，發(fā)光值隨蛋白用量增加迅速上升，說明蛋白未完全結(jié)合于磁珠；在該范圍內(nèi)時(shí)，發(fā)光值增幅變緩，說明磁珠結(jié)合蛋白接近飽和；而超過該范圍時(shí)，發(fā)光值隨蛋白用量增加反而有所降低，說明蛋白開始出現(xiàn)較多的自身交聯(lián)，從而導(dǎo)致了偶聯(lián)磁珠產(chǎn)生構(gòu)型的改變。本發(fā)明中傳染性法氏囊病毒抗原或其片段與磁性微粒之間可通過直接或間接偶聯(lián)。例如，所述的直接偶聯(lián)包括通過磁性微粒羧基與蛋白氨基縮合形成酰胺、磁性微粒氨基與蛋白氨基通過戊二醛交聯(lián)形成五碳橋、甲苯磺?；判晕⒘Ｅc蛋白氨基共價(jià)偶聯(lián)相連接。所述的間接偶聯(lián)包括通過以下方式介導(dǎo)的偶聯(lián)：鏈霉親和素-生物素介導(dǎo)的偶聯(lián)、抗FITC抗體-FITC偶聯(lián)。優(yōu)選的方式為：鏈霉親和素包被在磁性微粒上，生物素偶聯(lián)在傳染性法氏囊病毒上，通過鏈霉親和素-生物素作用結(jié)合傳染性法氏囊病毒和磁性微粒；抗FITC抗體包被在磁性微粒上，F(xiàn)ITC交聯(lián)在傳染性法氏囊病毒上，通過抗FITC抗體-FITC相互作用結(jié)合傳染性法氏囊病毒和磁性微粒。本發(fā)明傳染性法氏囊病毒抗原或其片段偶聯(lián)的磁性微?？捎糜谥苽錂z測(cè)傳染性法氏囊病毒抗體的檢測(cè)試劑和/或試劑盒。檢測(cè)試劑或試劑盒本發(fā)明提供了一種檢測(cè)傳染性法氏囊病毒抗體的檢測(cè)試劑或試劑盒，所述的試劑盒含有容器和說明書，所述的容器內(nèi)含有本發(fā)明傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒。優(yōu)選地，所述的容器內(nèi)還含有獨(dú)立包裝的質(zhì)控品或校準(zhǔn)品、或清洗液；其中，所述校準(zhǔn)品包括傳染性法氏囊病毒抗體陰性或陽性血清稀釋液。優(yōu)選地，所述的說明書記載了含有本發(fā)明第二方面所述的傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒的使用方法，包括步驟：(i)提供待測(cè)樣品、和所述傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒；(ii)將所述待測(cè)樣品與所述傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微?；旌喜⑦M(jìn)行反應(yīng)；(iii)將(ii)中反應(yīng)后的混合液進(jìn)行洗滌并加入發(fā)光底物；(iv)對(duì)(iii)中加入發(fā)光底物后的混合液進(jìn)行發(fā)光值檢測(cè)，從而定量或定性檢測(cè)待測(cè)樣品中的傳染性法氏囊病毒抗體?？捎糜诒景l(fā)明的清洗液沒有特別限制，可以為本領(lǐng)域常用的磁珠清洗液，優(yōu)選包括含有Tween20的Tris緩沖液或含有Tween20的PBS緩沖液。在另一優(yōu)選例中，所述Tween20的Tris緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為8.0。在另一優(yōu)選例中，所述Tween20的PBS緩沖液濃度為0.05mol/L，pH為7.0。應(yīng)用本發(fā)明傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)的磁性微粒及含有其的檢測(cè)試劑、檢測(cè)試劑盒可有效地用于高效、高靈敏度地檢測(cè)待測(cè)樣本中的傳染性法氏囊病毒抗體，且所述檢測(cè)可以是定性或定量檢測(cè)。本發(fā)明有益效果本發(fā)明采用特定粒徑的磁性微粒作為包被載體，采用特定的傳染性法氏囊病毒與磁性微粒之比進(jìn)行混合并反應(yīng)，獲得了包被均質(zhì)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的傳染性法氏囊病毒抗原或其片段偶聯(lián)磁性微粒，也節(jié)省了包被蛋白原料，其包被的蛋白充分、檢測(cè)范圍較寬，靈敏度較高、反應(yīng)時(shí)間非常短(僅需5-10分鐘)，并具有高通量、自動(dòng)化、可重復(fù)的優(yōu)異特點(diǎn)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork：ColdSpringVP2rborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。通用方法1.傳染性法氏囊抗體的檢測(cè)方法，包括如下步驟：S1、取若干反應(yīng)管，依次加入20μL待測(cè)血清或校準(zhǔn)品、100μL稀釋液和25μL包被傳染性法氏囊抗原蛋白的磁性懸浮液；S2、37℃下反應(yīng)10分鐘；S3、磁鐵吸附，吸去上清液，每個(gè)反應(yīng)管加入300-500μL清洗液，重復(fù)清洗3次，棄去清洗液；S4、向S3中加入100μL堿性磷酸酶標(biāo)記的傳染性法氏囊抗體溶液；S5、37℃下反應(yīng)10分鐘；S6、重復(fù)步驟S3中的清洗步驟；S7、S6中加入100μL發(fā)光底物；S8、37℃下反應(yīng)5分鐘；S9、用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)發(fā)光值。2.繪制校準(zhǔn)曲線，根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)血清中抗體的濃度。以濃度值取對(duì)數(shù)為X軸，以發(fā)光值取Logit為Y軸，進(jìn)行線性擬合，繪制校準(zhǔn)曲線。Sn：校準(zhǔn)品(除校準(zhǔn)品零值外)或樣本發(fā)光值；S0：校準(zhǔn)品零值的發(fā)光值。制備實(shí)施例1本實(shí)施例制備了一種傳染性法氏囊抗體檢測(cè)的試劑盒，包括包被傳染性法氏囊抗原蛋白的磁性懸浮液，堿性磷酸酶標(biāo)記的傳染性法氏囊抗體溶液，稀釋液，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，清洗液，發(fā)光底物和反應(yīng)管。包被傳染性法氏囊抗原蛋白的磁性懸浮液的制備：(1)取1mL含磁性微粒(購于日本JSR公司，貨號(hào)：MagnosphereTMMS300/Caboxyl)的溶液，濃度為10mg/mL，用0.1mol/LpH為5.0的2-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液清洗2遍，最后懸浮于1mL0.1mol/LpH為5.0的MES緩沖液中；(2)加入純化的傳染性法氏囊抗原蛋白(購自于青島易邦生物工程有限公司)50-500μg；(3)稱取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，用0.1mol/LpH為5.0的MES緩沖液溶解，使EDC的濃度為10mg/mL；(4)取(3)中的EDC溶液100μL加入(2)中，37℃下振蕩反應(yīng)2小時(shí)；(5)磁鐵吸附，去上清液，用0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后懸浮在0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含1％的BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300(購于Sigma公司，貨號(hào)：48914-U)。所述的磁性微粒為含有羧基基團(tuán)的磁性微粒。堿性磷酸酶標(biāo)記的傳染性法氏囊抗體溶液的制備：(1)取1mg堿性磷酸酶，用0.05mol/LpH為9.5的碳酸鹽緩沖液(CB緩沖液)稀釋至10mg/mL；(2)稱取高碘酸鈉(NaIO4)并用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液溶解，使NaIO4的濃度為12.5mg/mL；(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振蕩混勻，于2-8℃下避光反應(yīng)1小時(shí)；(4)取10μL乙二醇，加入1mL0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液，獲得乙二醇溶液；(5)取(4)中乙二醇溶液100μL加入(3)中，于2-8℃避光反應(yīng)1小時(shí)；(6)取傳染性法氏囊單克隆抗體0.5-1mg加入(5)中，混勻后用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液于2-8℃下避光透析20-24小時(shí)；(7)稱取硼氫化鈉(NaBH4)溶于純水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2-8℃避光反應(yīng)2小時(shí)；(9)過分子篩純化分離未結(jié)合的堿性磷酸酶和傳染性法氏囊單克隆抗體；(10)將(9)中純化后的抗體溶液用含有1％BSA的pH為7.00.05M的3-嗎啉丙磺酸(MOPS)緩沖液稀釋備用。稀釋濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)效果來確定，合適的稀釋濃度為0.1-0.5μg/mL。校準(zhǔn)品是經(jīng)標(biāo)定的含有已知濃度的傳染性法氏囊抗體的緩沖液。校準(zhǔn)品的制備：(1)將經(jīng)傳染性法氏囊病毒疫苗強(qiáng)化免疫后獲得的傳染性法氏囊抗體強(qiáng)陽性血清于60℃熱滅活1小時(shí)；(2)將(1)中滅活后的強(qiáng)陽性血清經(jīng)0.2μm的微濾膜過濾，加入0.1％的ProClinTM300；(3)將(2)中的血清進(jìn)行標(biāo)定，按一定濃度稀釋，得到0，3.13，6.25，12.5，25，50，100，200U/mL系列校準(zhǔn)品。質(zhì)控品是經(jīng)標(biāo)定的傳染性法氏囊抗體陽性雞血清。分為低值質(zhì)控品和高值質(zhì)控品，其中低值質(zhì)控品的質(zhì)控范圍為20-30U/mL，高值質(zhì)控品的質(zhì)控范圍為100-150U/mL。質(zhì)控品用于控制試驗(yàn)的有效性，定期檢測(cè)質(zhì)控品，若超出質(zhì)控范圍，則須使用校準(zhǔn)品重新定標(biāo)。質(zhì)控品的制備：(1)選擇10份以上傳染性法氏囊抗體陽性血清，60℃熱滅活1小時(shí)，混合后經(jīng)0.2μm的微濾膜過濾，加入0.1％的ProClinTM300。(2)調(diào)整混合陽性血清至合適的濃度。稀釋液是含有1％BSA，pH為7.4，濃度為0.01mol/L的PBS緩沖液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.05mol/LpH為8.0的Tris緩沖液；發(fā)光底物是以金剛烷及其衍生物為基礎(chǔ)的溶液，此例中的發(fā)光底物為Lumi-Phos530，購于Lumigen公司，貨號(hào)：P-5000。表1為不同濃度的校準(zhǔn)品所對(duì)應(yīng)的發(fā)光值，圖1為繪制的校準(zhǔn)曲線表1制備實(shí)施例2本實(shí)施例制備了一種傳染性法氏囊抗體檢測(cè)的試劑盒，包括包被傳染性法氏囊抗原蛋白的磁性懸浮液，吖啶酯標(biāo)記的山羊抗雞IgG抗體(購自北京索萊寶科技有限公司)溶液，稀釋液，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，清洗液，第一發(fā)光底物和第二發(fā)光底物，反應(yīng)管。包被傳染性法氏囊抗原蛋白的磁性懸浮液的制備：(1)取1mL含磁性微粒的溶液，濃度為10mg/mL，用0.1mol/LpH為9.5的硼酸緩沖液清洗2遍，最后懸浮于1mL0.1mol/LpH為9.5的硼酸緩沖液中；(2)加入純化的傳染性法氏囊抗原蛋白50-500μg，渦旋混勻；(3)加入0.1mol/LpH為9.5的硼酸緩沖液(含有3mol/L硫酸銨)0.5-1mL，37℃下振蕩反應(yīng)20-24小時(shí)；(4)加入0.5mL10％的BSA水溶液，渦旋混勻，37℃振蕩反應(yīng)6-12小時(shí)；(5)磁鐵吸附，去上清液，用0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后懸浮在0.01mol/LpH7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。所述的磁性微粒為含有甲苯磺?；鶊F(tuán)的磁性微粒。吖啶酯標(biāo)記山羊抗雞IgG抗體溶液的制備：(1)取1mg山羊抗雞IgG抗體，用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液在2-8℃下透析過夜；(2)取含有0.2mg吖啶酯的吖啶酯溶液加入到(1)中，常溫避光反應(yīng)2小時(shí)；(3)加入100μL0.1g/mL賴氨酸溶液，常溫避光反應(yīng)2小時(shí)；(4)用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液在2-8℃下避光透析20-24小時(shí)；(5)將(4)中的抗體溶液用含有1％BSA的pH為7.00.05mol/L的MOPS緩沖液稀釋備用。校準(zhǔn)品的制備方法與制備實(shí)施例一相同。質(zhì)控品的制備方法與制備實(shí)施例一相同。稀釋液是含有1％BSA，pH為7.4，濃度為0.01mol/L的PBS緩沖液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.01mol/LpH為7.0的PBS緩沖液；第一發(fā)光底物為含有0.1mol/L硝酸、0.1％過氧化氫的溶液，第二發(fā)光底物為含有2％Tween-20、0.25mol/LNaOH的溶液。表2為不同校準(zhǔn)品濃度所對(duì)應(yīng)的發(fā)光值，圖2為繪制的校準(zhǔn)曲線。表2制備實(shí)施例3本實(shí)施例制備了一種傳染性法氏囊抗體檢測(cè)的試劑盒，包括包被傳染性法氏囊抗原蛋白的磁性懸浮液，辣根過氧化物酶標(biāo)記的傳染性法氏囊抗原溶液，稀釋液，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，清洗液，第一發(fā)光底物和第二發(fā)光底物，反應(yīng)管。包被傳染性法氏囊抗原蛋白的磁性懸浮液的制備：(1)取1mL含磁性微粒的溶液，濃度為10mg/mL，用0.01mol/LpH為7.4的磷酸鹽(PBS)緩沖液清洗2遍，最后懸浮于1mL0.01mol/LpH為7.4的PBS緩沖液中；(2)加入0.1mL25％(v/v)的戊二醛溶液，37℃振蕩反應(yīng)2小時(shí)；(3)用1mL0.01mol/LpH為7.4的PBS緩沖液清洗3遍；(4)加入純化的傳染性法氏囊抗原重組抗原50-500μg，37℃振蕩反應(yīng)20-24小時(shí)；(5)加入0.5mL10％牛血清白蛋白(BSA)水溶液，渦旋混勻，37℃振蕩反應(yīng)2小時(shí)；(6)用0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后懸浮在0.01mol/LpH7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。所述的磁性微粒為含有氨基基團(tuán)的磁性微粒。辣根過氧化物酶標(biāo)記傳染性法氏囊抗原的制備：(1)取1mg辣根過氧化物酶，用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液稀釋至10mg/mL；(2)稱取NaIO4并用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液溶解，使NaIO4的濃度為12.5mg/mL；(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振蕩混勻，于2-8℃下避光反應(yīng)1小時(shí)；(4)取10μL乙二醇，加入1mL0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液，獲得乙二醇溶液；(5)取(4)中乙二醇溶液1mL加入(3)中，于2-8℃避光反應(yīng)1小時(shí)；(6)取傳染性法氏囊抗原0.5-1mg加入(5)中，混勻后用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液于2-8℃下避光透析20-24小時(shí)；(7)稱取NaBH4溶于純水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2-8℃避光反應(yīng)2小時(shí)；(9)過分子篩純化；(10)將(9)中純化后的抗原溶液用含有1％BSA的pH7.00.05mol/L的MOPS緩沖液稀釋備用。校準(zhǔn)品的制備方法與制備實(shí)施例一相同。質(zhì)控品的制備方法與制備實(shí)施例一相同。稀釋液是含有1％BSA，pH為7.4，濃度為0.01mol/L的PBS緩沖液；清洗液是含0.1％Tween-20的0.01mol/LpH7.0的PBS緩沖液；第一發(fā)光底物為0.5g/L魯米諾、0.1g/L對(duì)碘酚的溶液，第二發(fā)光底物為0.625g/L過氧化脲溶液。表3為校準(zhǔn)品不同濃度對(duì)應(yīng)的發(fā)光值，圖3為繪制的校準(zhǔn)曲線。表3制備實(shí)施例4本實(shí)施例制備了一種傳染性法氏囊抗體檢測(cè)的試劑盒，包括包被鏈霉親和素的磁性懸浮液，堿性磷酸酶標(biāo)記的傳染性法氏囊病毒抗原，生物素化抗原，校準(zhǔn)品，質(zhì)控品，清洗液，發(fā)光底物和反應(yīng)管。包被鏈霉親和素的磁性懸浮液的制備：(1)取1mL含磁性微粒的溶液，濃度為10mg/mL，用0.1mol/LpH為5.0的1-嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液清洗2遍，最后懸浮于1mL0.1mol/LpH為5.0的MES緩沖液中；(2)加入鏈霉親和素50-500μg；(3)稱取EDC，用0.1mol/LpH為5.0的MES緩沖液溶解，使EDC的濃度為10mg/mL；(4)取(3)中的EDC溶液100μL加入(2)中，37℃下振蕩反應(yīng)2小時(shí)；(5)磁鐵吸附，去上清液，用0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含0.1％的Tween-20)清洗3遍，最后懸浮在0.01mol/LpH為7.4的PBS溶液(含1％BSA)中，并加入0.1％的ProClinTM300。所述的磁性微粒為含有羧基基團(tuán)的磁性微粒。堿性磷酸酶標(biāo)記的傳染性法氏囊病毒抗原溶液的制備：(1)取1mg堿性磷酸酶，用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液稀釋至10mg/mL；(2)稱取NaIO4并用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液溶解，使NaIO4的濃度為12.5mg/mL；(3)取(2)中NaIO4溶液100μL，加入(1)中，振蕩混勻，于2-8℃下避光反應(yīng)1小時(shí)；(4)取10μL乙二醇，加入1mL0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液，獲得乙二醇溶液；(5)取(4)中乙二醇溶液1mL加入(3)中，于2-8℃避光反應(yīng)1小時(shí)；(6)取傳染性法氏囊病毒抗原0.5-1mg加入(5)中，混勻后用0.05mol/LpH為9.5的CB緩沖液于2-8℃下避光透析20-24小時(shí)；(7)稱取NaBH4溶于純水中，配制2mg/mL的NaBH4溶液；(8)取(7)中NaBH4溶液10μL，加入(6)中，于2-8℃避光反應(yīng)2小時(shí)；(9)過分子篩純化；(10)將(9)中純化后的抗體溶液用含有1％BSA的pH為7.00.05mol/L的MOPS緩沖液稀釋備用。生物素抗原的制備：(1)取1mg傳染性法氏囊病毒抗原，用0.01mol/LpH為7.4的PBS緩沖液在2-8℃下透析過夜；(2)將預(yù)活化的生物素溶于純水中，制備50mmol/L的生物素溶液；(3)取(2)中生物素溶液20μL加入(1)中，常溫反應(yīng)1小時(shí)；(4)將(3)中加入100μL0.1g/mL賴氨酸溶液，常溫反應(yīng)1小時(shí)；(5)將(4)中溶液用0.01mol/LpH為7.4的PBS緩沖液在2-8℃下透析20-24小時(shí)。(6)將(5)中溶液用含有1％BSA的pH為7.00.05mol/L的MOPS緩沖液稀釋備用。校準(zhǔn)品的制備方法與制備實(shí)施例一相同。質(zhì)控品的制備方法與制備實(shí)施例一相同。清洗液是含0.1％Tween-20的0.05MpH8.0的Tris緩沖液；發(fā)光底物是以金剛烷及其衍生物為基礎(chǔ)的溶液。此例中的發(fā)光底物為Lumi-Phos530，購于Lumigen公司，貨號(hào)：P-5000。表4為校準(zhǔn)品不同濃度對(duì)應(yīng)的發(fā)光值，圖4為繪制的校準(zhǔn)曲線。表4實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1傳染性法氏囊病毒抗原或其片段對(duì)磁性微粒的比例研究本實(shí)施例采用了3種傳染性法氏囊病毒抗原或其片段(SEQIDNO.:1-3)、2種磁性微粒((購于日本JSR公司，貨號(hào)：MagnosphereTMMS300/Caboxyl)和含有甲苯磺酰基的磁性微粒(購于日本JSR公司，貨號(hào)：MagnosphereTMMS300/Tosyl))包被，制備過程如下：本實(shí)驗(yàn)實(shí)施例先采用了制備實(shí)施例1中所制備的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白偶聯(lián)磁性微粒，其中傳染性法氏囊病毒VP2蛋白全長的加入量為15.7、31.3、62.5、125、250、500μg，對(duì)應(yīng)物質(zhì)的量為0.28、0.55、1.1、2.19、4.39、8.77nmol；傳染性法氏囊病毒VP2蛋白片段的加入量為4.7、9.4、18.8、37.5、75、150μg，對(duì)應(yīng)物質(zhì)的量為0.28、0.55、1.11、2.21、4.41、8.82nmol；傳染性法氏囊病毒VP2蛋白多肽的加入量為1.6、3.2、6.3、12.5、25、50μg，對(duì)應(yīng)物質(zhì)的量為0.29、0.58、1.15、2.27、4.55、9.09nmol。本實(shí)驗(yàn)實(shí)施例還采用了制備實(shí)施例2中所制備的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白偶聯(lián)磁性微粒，其中傳染性法氏囊病毒VP2蛋白全長的加入量為15.7、31.3、62.5、125、250、500μg，對(duì)應(yīng)物質(zhì)的量為0.28、0.55、1.1、2.19、4.39、8.77nmol；傳染性法氏囊病毒VP2蛋白片段的加入量為4.7、9.4、18.8、37.5、75、150μg，對(duì)應(yīng)物質(zhì)的量為0.28、0.55、1.11、2.21、4.41、8.82nmol；傳染性法氏囊病毒VP2蛋白多肽的加入量為1.6、3.2、6.3、12.5、25、50μg，對(duì)應(yīng)物質(zhì)的量為0.29、0.58、1.15、2.27、4.55、9.09nmol。配以堿性磷酸酶標(biāo)記的傳染性法氏囊病毒溶液、清洗液、發(fā)光底物和反應(yīng)管進(jìn)行試驗(yàn)。1.1羧基磁珠的最適蛋白用量用本實(shí)施例傳染性法氏囊抗體陽性血清，結(jié)果如表5所示，圖5為包被蛋白用量與其發(fā)光值對(duì)應(yīng)的曲線。結(jié)果表明，隨蛋白用量增加，發(fā)光值上升速度逐漸變緩，說明磁珠結(jié)合蛋白接近飽和；而蛋白用量繼續(xù)增加，發(fā)光值反而有所降低，說明蛋白過量，出現(xiàn)了較多的蛋白自身交聯(lián)。因此，對(duì)于羧基磁珠，傳染性法氏囊VP2蛋白全長、片段、多肽的最適用量為1.1-9.09nmol/10mg磁珠，在0.5-10nmol/10mg的范圍內(nèi)也可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。三種蛋白雖然氨基酸數(shù)量、分子量差別很大，但按物質(zhì)的量計(jì)算，最佳包被蛋白用量相差不大，都在0.5-10nmol/10mg磁珠范圍內(nèi)。其中，1.1-2.27nmol/10mg磁珠效果最好。表5羧基磁珠的最適蛋白用量1.2甲苯磺?；胖榈淖钸m蛋白用量用本實(shí)施例檢測(cè)傳染性法氏囊抗體陽性血清，結(jié)果如表6所示，圖6為包被蛋白用量與其發(fā)光值對(duì)應(yīng)的曲線。隨蛋白用量增加，發(fā)光值上升速度逐漸變緩，說明磁珠結(jié)合蛋白接近飽和。因此，對(duì)于甲苯磺?；胖?，傳染性法氏囊VP2蛋白全長、片段、多肽的最適用量為1.1nmol/10mg磁珠以上。三種蛋白雖然氨基酸數(shù)量、分子量差別很大，但按物質(zhì)的量計(jì)算，最佳包被蛋白用量相差不大，考慮成本因素，蛋白用量不宜過多，結(jié)合羧基磁珠的結(jié)果，確定三種蛋白的最佳用量范圍為1.1-9.09nmol/10mg磁珠。表6甲苯磺?；胖榈淖钸m蛋白用量實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2靈敏度實(shí)驗(yàn)分別采用制備實(shí)施例1、2、3、4中的試劑盒分別進(jìn)行靈敏度測(cè)試，國外知名廠家生產(chǎn)的傳染性法氏囊抗體檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，以下簡(jiǎn)稱為ELISA試劑盒)同時(shí)檢測(cè)不同稀釋倍數(shù)的傳染性法氏囊抗體血清，其中，本實(shí)施例的試劑盒對(duì)每份血樣均做10個(gè)重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算變異系數(shù)(CV％＝10個(gè)測(cè)試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差/算術(shù)平均值)。以CV％<20％的最大稀釋倍數(shù)作為靈敏度結(jié)果。結(jié)果分別見表7、8、9、10，可見本試劑靈敏度均優(yōu)于ELISA試劑盒，其中表7可見本發(fā)明試劑盒靈敏度<2.38U/mL；表8可見本發(fā)明試劑盒靈敏度<0.57U/mL；表9可見本發(fā)明試劑盒靈敏度<0.60U/mL；表10可見本發(fā)明試劑盒靈敏度<1.41U/mL。表7表8表9表10實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取3例傳染性法氏囊抗體陽性血清，分別采用制備實(shí)施例1、2、3、4中的試劑盒分別進(jìn)行重復(fù)性測(cè)試，每天分2批檢測(cè)，每批3份血清各做2個(gè)測(cè)試，兩批試驗(yàn)至少間隔2小時(shí)，連續(xù)檢測(cè)5天。每份血清各得到20個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)，計(jì)算其濃度的變異系數(shù)，結(jié)果如表11、12、13、14。結(jié)果證明，3份血清檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性良好。表11表12表13表14實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4符合率實(shí)驗(yàn)分別采用制備實(shí)施例1、2、3、4中的試劑盒與ELISA試劑盒同時(shí)檢測(cè)多份雞血清，檢測(cè)結(jié)果如表15-18。結(jié)果顯示，四次實(shí)驗(yàn)中，本試劑與ELISA試劑盒陽性符合率分別為93.8％、92.0％、94.3％、92.6％，陰性符合率分別為94.5％、92.4％、93.2％、92.0％，總體符合率分別為94.2％、92.3％、93.7％、92.3％。表15表16表17表18實(shí)驗(yàn)實(shí)施例5傳染性法氏囊病毒疫苗的免疫監(jiān)測(cè)濃度<8.0U/mL判定為陰性，濃度≥8.0U/mL判定為陽性；Elisa試劑盒S/P≤0.20判定為陰性，S/P＞0.20判定為陽性。在用傳染性法氏囊病毒疫苗免疫后，隨機(jī)抽取3只，分別于免疫后0、7、10、14、21、35天抽取血樣檢測(cè)傳染性法氏囊抗體，采用制備實(shí)施例1、2、3、4中試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表19-22。結(jié)果顯示，在免疫后10天至35天，傳染性法氏囊病毒抗體由陰轉(zhuǎn)陽，且濃度逐漸上升；兩種試劑檢測(cè)結(jié)果一致。表19表20表21表22實(shí)驗(yàn)實(shí)施例6特異性實(shí)驗(yàn)分別采用制備實(shí)施例1、2、3、4中的試劑盒檢測(cè)多種相關(guān)病毒抗體強(qiáng)陽性血清，包括H9亞型禽流感病毒抗體(AIV-H9-Ab)、新城疫病毒抗體(NDV-Ab)、傳染性支氣管炎抗體(IBV-Ab)、禽白血病病毒J亞型抗體(ALV-J-Ab)、雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒抗體(REV-Ab)。檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果均低于8.0U/mL，均為陰性，未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)，見表23、24、25、26。表23相關(guān)病毒抗體AIV-H9-AbNDV-AbIBV-AbALV-J-AbREV-Ab濃度(U/mL)2.522.233.432.112.36表24相關(guān)病毒抗體AIV-H9-AbNDV-AbIBV-AbALV-J-AbREV-Ab濃度(U/mL)1.482.061.731.991.61表25相關(guān)病毒抗體AIV-H9-AbNDV-AbIBV-AbALV-J-AbREV-Ab濃度(U/mL)1.251.331.861.231.75表26相關(guān)病毒抗體AIV-H9-AbNDV-AbIBV-AbALV-J-AbREV-Ab濃度(U/mL)3.013.12.463.133.06在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>上海鳴捷生物科技有限公司<120>傳染性法氏囊病毒抗原偶聯(lián)磁性微粒及其制備方法和應(yīng)用<130>P2016-1201<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>469<212>PRT<213>傳染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus；IBDV）<220><221>misc_feature<223>VP2全長<400>1GlnThrGlnGlnIleValProPheIleArgSerLeuLeuMetProThr151015ThrGlyProAlaSerIleProAspAspThrLeuGluLysHisThrLeu202530ArgSerGluThrSerThrTyrAsnLeuThrValGlyAspThrGlySer354045GlyLeuIleAlaPhePheProGlyPheProGlySerIleValGlyAla505560HisTyrThrLeuGlnSerAsnGlyAsnTyrLysPheAspGlnMetLeu65707580LeuThrAlaGlnAsnLeuProAlaSerTyrAsnTyrCysArgLeuVal859095SerArgSerLeuThrValArgSerSerThrLeuProGlyGlyValTyr100105110AlaLeuAsnGlyThrValAsnAlaValThrPheGlnGlySerLeuSer115120125GluLeuThrAspValSerTyrAsnGlyLeuMetSerAlaThrAlaAsn130135140IleAsnAspLysIleGlyAsnValLeuIleGlyGluGlyValThrVal145150155160LeuSerLeuProThrSerTyrAspLeuGlyTyrValArgLeuGlyAsp165170175ProIleProAlaIleGlyLeuAspProLysMetValAlaThrCysAsp180185190SerSerAspArgProArgValTyrThrIleThrAlaAlaAspAspTyr195200205GlnPheSerSerGlnTyrGlnSerGlyGlyValThrIleThrLeuPhe210215220SerAlaAsnIleAspAlaIleThrSerLeuSerValGlyGlyGluLeu225230235240ValPheGlnThrSerValGlnSerLeuValLeuGlyAlaThrIleTyr245250255LeuIleGlyPheAspGlyThrThrValThrThrArgThrValAlaAla260265270AsnThrGlyLeuThrAlaGlyThrAspAsnProIleProPheAsnLeu275280285ValPheProThrAsnGluIleThrGlnProIleThrSerIleLysLeu290295300GluIleValThrSerLysSerGlyGlyGlnAlaGlyAspGlnMetSer305310315320TrpSerAlaSerGlyArgLeuAlaValThrIleHisGlyGlyAsnTyr325330335ProGlyAlaLeuArgProValThrLeuValAlaTyrGluArgValAla340345350LysGlySerValValThrValAlaGlyValSerAsnPheGluLeuIle355360365ProAsnProGluLeuAlaLysAsnLeuValThrGluTyrGlyArgPhe370375380AspProGlyAlaMetAsnTyrThrLysLeuIleLeuSerGluArgAsp385390395400ArgLeuGlyIleLysThrValTrpProThrArgGluTyrThrAspPhe405410415ArgGluTyrPheMetGluValAlaAspLeuAsnSerProLeuLysIle420425430AlaGlyAlaPheGlyPheLysAspIleIleArgAlaIleArgArgIle435440445AlaValProValValSerThrLeuPheProProAlaAlaProLeuAla450455460HisAlaIleGlyGlu465<210>2<211>134<212>PRT<213>傳染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus；IBDV）<220><221>misc_feature<223>VP2片段<400>2IleGlyLeuAspProLysMetValAlaThrCysAspSerSerAspArg151015ProArgValTyrThrIleThrAlaAlaAspAspTyrGlnPheSerSer202530GlnTyrGlnSerGlyGlyValThrIleThrLeuPheSerAlaAsnIle354045AspAlaIleThrSerLeuSerValGlyGlyGluLeuValPheGlnThr505560SerValGlnSerLeuValLeuGlyAlaThrIleTyrLeuIleGlyPhe65707580AspGlyThrThrValThrThrArgThrValAlaAlaAsnThrGlyLeu859095ThrAlaGlyThrAspAsnProIleProPheAsnLeuValPheProThr100105110AsnGluIleThrGlnProIleThrSerIleLysLeuGluIleValThr115120125SerLysSerGlyGlyGln130<210>3<211>50<212>PRT<213>傳染性法氏囊病毒（Infectiousbursaldiseasevirus；IBDV）<220><221>misc_feature<223>VP2片段<400>3ValPheGlnThrSerValGlnSerLeuValLeuGlyAlaThrIleTyr151015LeuIleGlyPheAspGlyThrThrValThrThrArgThrValAlaAla202530AsnThrGlyLeuThrAlaGlyThrAspAsnProIleProPheAsnLeu354045ValPhe50當(dāng)前第1頁1 2 3