本發(fā)明涉及一種測定方法，具體是一種布魯氏菌病的快速測定方法。

背景技術(shù)：

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的，是目前世界上流行最廣、危害最大的人畜共患病之一，引起流產(chǎn)、不孕以及各種組織的局部病灶。布魯氏菌可通過鼻、咽、口腔感染，主要是通過粘膜上皮組織浸入。目前，布魯氏菌屬已有10余個種的布魯氏菌存在，不同種的布魯氏菌具有明顯的宿主危害傾向性，但大多具有不同宿主間的交叉感染能力，可引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。隨著我國近年來，畜牧業(yè)的快速發(fā)展，布魯氏菌病成為了限制我國畜牧業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重病害之一。布魯氏菌包括羊群布魯氏菌、牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌等種源。布魯氏菌檢測技術(shù)主要有虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、乳環(huán)試驗（MRT）、補體結(jié)合試驗（CFT）、ELISA和PCR等方法。常規(guī)方法分離鑒定病原所需條件苛刻，且費力、費時、危險性高、成功率低。PBT和SAT特異性不高、敏感性低；CFT操作繁瑣，實驗條件和技術(shù)水平要求高，實踐應(yīng)用極為不便。PCR檢測方法較前幾種快速也準(zhǔn)確許多，但需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，成本高，不適合基層和現(xiàn)場檢測。LAMP方法具有靈敏性高、特異性好、反應(yīng)時間短、判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等優(yōu)勢，目前多數(shù)建立的LAMP反應(yīng)方法多采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結(jié)果，只能分析LAMP反應(yīng)的最終結(jié)果，且存在氣溶膠污染實驗室的危險，由于缺乏對反應(yīng)的實時監(jiān)控很難排除這些干擾因素，不能對檢測結(jié)果做出準(zhǔn)確的判定。本發(fā)明使用的LAMP方法不僅敏感度高，特異性強，不造成環(huán)境污染，快速得出結(jié)果，并且可實時定量檢測，而且操作簡便，只需按建立的體系加樣即可，為簡便、快捷準(zhǔn)確地檢測布魯氏菌帶來便利。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種布魯氏菌病的快速測定方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種布魯氏菌病的快速測定方法，包括如下步驟：1）表達(dá)片段克隆：將S2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min-60min，之后取1μL-2μL作為PCR擴增目的基因表達(dá)片段的模板，利用引物L(fēng)FGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作為前后引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的純化與回收，回收獲得布魯氏菌Omp19外膜蛋白基因表達(dá)片段溶解液；2）大腸桿菌原核表達(dá)載體的構(gòu)建：取步驟（1）中的回收后的布魯氏菌Omp19外膜蛋白基因表達(dá)片段溶解液和大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒載體溶解液分別進(jìn)行內(nèi)切酶EcoRΙ和XhoΙ雙酶切處理，之后，在16℃金屬浴中進(jìn)行T4DNA連接酶連接10h-12h，獲得連接產(chǎn)物；3）轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α克隆菌株：將步驟（2）中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到固體LB培養(yǎng)基平板；4）陽性克隆子的篩選：挑取步驟3）固體LB培養(yǎng)基表面的單個白色菌落，以前引物L(fēng)FGCGAACCGGCAATACCAG和后引物L(fēng)BGCCGCGTTGAGTACCGT進(jìn)行陽性克隆子的篩選，PCR反應(yīng)的程序為：94℃預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94℃變性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，進(jìn)行37℃過夜10h-12h液體搖菌處理，獲得陽性菌株菌液；5）質(zhì)粒提?。喝〔襟E（4）中的陽性菌株菌液1mL，利用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，得到陽性重組質(zhì)粒；6）轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)菌株：將步驟（5）中提取到的陽性重組質(zhì)粒，利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，得到固體LB培養(yǎng)基平板；7）陽性克隆子的篩選：次日，用無菌牙簽挑取步驟（6）中的固體LB培養(yǎng)基表面的單個白色菌落，以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物，進(jìn)行陽性表達(dá)菌株的篩選，PCR反應(yīng)的程序為：94℃預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94℃變性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行過夜液體搖菌處理，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為：37℃，180rpm-200rpm，培養(yǎng)12h-14h，獲得表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液；8）誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化：將步驟（7）中液體搖瓶培養(yǎng)的表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液作為誘導(dǎo)表達(dá)的母液，從中取0.5mL表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)接到一瓶50mL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為50μg/mL，在37℃、180rpm-200rpm條件培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的最終物質(zhì)的量濃度為0.1mmol/L-1.0mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的條件為在37℃、180rpm-200rpm條件下誘導(dǎo)3h-4h。之后，5000rpm-6000rpm低速離心收集菌體，用20mL1×PBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進(jìn)行菌體沉淀的超聲波破碎40min-60min，結(jié)束后10000rpm-12000rpm高速離心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的親和純化，收集獲得純化洗脫液；9）聚丙烯酰胺凝膠電泳：取步驟（8）的親和純化后的布魯氏菌Omp19外膜蛋白的純化洗脫液，對蒸餾水透析20h-24h，并且12h期間更換一次蒸餾水，利用PEG8000進(jìn)行濃縮，取50μL濃縮液作為蛋白電泳的樣品進(jìn)行質(zhì)量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，同時，以常見的BSA蛋白作為對照進(jìn)行試驗，試驗直到電泳指示劑剛剛?cè)颗艹瞿z低端為止，獲得蛋白質(zhì)凝膠電泳膠片；10）“半干法”轉(zhuǎn)膜：利用半干式印跡轉(zhuǎn)膜儀，將布魯氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝膠電泳的蛋白質(zhì)膠片轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素薄膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：電壓8v-10v，時間40min-50min，獲得轉(zhuǎn)膜后的醋酸纖維素薄膜；11）免疫印跡試驗：將轉(zhuǎn)膜后的醋酸纖維素薄膜用10mL質(zhì)量體積比為1%的脫脂奶粉溶液孵育10-20min，再用10mL1×PBS緩沖液洗膜40min-60min，然后用家畜或者人的血清100μL-200μL孵育醋酸纖維素薄膜10h-12h，次日，利用10mL1×PBS緩沖液洗膜40min-60min之后，用加有1μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗的10mL質(zhì)量體積比為1%的脫脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用10mL1×PBS緩沖液洗膜20-30min，最后在不見光的環(huán)境中利用由3%的4-氯-1-萘酚發(fā)色液1mL、30%雙氧水10μL、1×PBS緩沖液9mL組成的混合液進(jìn)行發(fā)色，發(fā)色時間為5min-10min，直到出現(xiàn)清晰可見的灰褐色條帶。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：將布魯氏菌Omp19外膜蛋白的質(zhì)量體積比為10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳膠片轉(zhuǎn)到醋酸纖維素薄膜的孔徑為0.2μm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明能克服傳統(tǒng)的檢測方法存在的檢測周期長、步驟繁瑣、費時費力等缺點，使檢測時間大大縮短，操作步驟和勞動強度也大為縮減，達(dá)到省時省力、快速靈敏的要求。

具體實施方式

下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。

本發(fā)明實施例中，一種布魯氏菌病的快速測定方法，包括如下步驟：1）表達(dá)片段克?。簩2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min-60min，之后取1μL-2μL作為PCR擴增目的基因表達(dá)片段的模板，利用引物L(fēng)FGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作為前后引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的純化與回收，回收獲得布魯氏菌Omp19外膜蛋白基因表達(dá)片段溶解液；2）大腸桿菌原核表達(dá)載體的構(gòu)建：取步驟（1）中的回收后的布魯氏菌Omp19外膜蛋白基因表達(dá)片段溶解液和大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒載體溶解液分別進(jìn)行內(nèi)切酶EcoRΙ和XhoΙ雙酶切處理，之后，在16℃金屬浴中進(jìn)行T4DNA連接酶連接10h-12h，獲得連接產(chǎn)物；3）轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α克隆菌株：將步驟（2）中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到固體LB培養(yǎng)基平板；4）陽性克隆子的篩選：挑取步驟3）固體LB培養(yǎng)基表面的單個白色菌落，以前引物L(fēng)FGCGAACCGGCAATACCAG和后引物L(fēng)BGCCGCGTTGAGTACCGT進(jìn)行陽性克隆子的篩選，PCR反應(yīng)的程序為：94℃預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94℃變性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，進(jìn)行37℃過夜10h-12h液體搖菌處理，獲得陽性菌株菌液；5）質(zhì)粒提取：取步驟（4）中的陽性菌株菌液1mL，利用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，得到陽性重組質(zhì)粒；6）轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)菌株：將步驟（5）中提取到的陽性重組質(zhì)粒，利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，得到固體LB培養(yǎng)基平板；7）陽性克隆子的篩選：次日，用無菌牙簽挑取步驟（6）中的固體LB培養(yǎng)基表面的單個白色菌落，以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物，進(jìn)行陽性表達(dá)菌株的篩選，PCR反應(yīng)的程序為：94℃預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94℃變性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行過夜液體搖菌處理，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為：37℃，180rpm-200rpm，培養(yǎng)12h-14h，獲得表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液；8）誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化：將步驟（7）中液體搖瓶培養(yǎng)的表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液作為誘導(dǎo)表達(dá)的母液，從中取0.5mL表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)接到一瓶50mL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為50μg/mL，在37℃、180rpm-200rpm條件培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的最終物質(zhì)的量濃度為0.1mmol/L-1.0mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的條件為在37℃、180rpm-200rpm條件下誘導(dǎo)3h-4h。之后，5000rpm-6000rpm低速離心收集菌體，用20mL1×PBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進(jìn)行菌體沉淀的超聲波破碎40min-60min，結(jié)束后10000rpm-12000rpm高速離心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的親和純化，收集獲得純化洗脫液；9）聚丙烯酰胺凝膠電泳：取步驟（8）的親和純化后的布魯氏菌Omp19外膜蛋白的純化洗脫液，對蒸餾水透析20h-24h，并且12h期間更換一次蒸餾水，利用PEG8000進(jìn)行濃縮，取50μL濃縮液作為蛋白電泳的樣品進(jìn)行質(zhì)量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，同時，以常見的BSA蛋白作為對照進(jìn)行試驗，試驗直到電泳指示劑剛剛?cè)颗艹瞿z低端為止，獲得蛋白質(zhì)凝膠電泳膠片；10）“半干法”轉(zhuǎn)膜：利用半干式印跡轉(zhuǎn)膜儀，將布魯氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝膠電泳的蛋白質(zhì)膠片轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素薄膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：電壓8v-10v，時間40min-50min，獲得轉(zhuǎn)膜后的醋酸纖維素薄膜；11）免疫印跡試驗：將轉(zhuǎn)膜后的醋酸纖維素薄膜用10mL質(zhì)量體積比為1%的脫脂奶粉溶液孵育10-20min，再用10mL1×PBS緩沖液洗膜40min-60min，然后用家畜或者人的血清100μL-200μL孵育醋酸纖維素薄膜10h-12h，次日，利用10mL1×PBS緩沖液洗膜40min-60min之后，用加有1μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗的10mL質(zhì)量體積比為1%的脫脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用10mL1×PBS緩沖液洗膜20-30min，最后在不見光的環(huán)境中利用由3%的4-氯-1-萘酚發(fā)色液1mL、30%雙氧水10μL、1×PBS緩沖液9mL組成的混合液進(jìn)行發(fā)色，發(fā)色時間為5min-10min，直到出現(xiàn)清晰可見的灰褐色條帶。將布魯氏菌Omp19外膜蛋白的質(zhì)量體積比為10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳膠片轉(zhuǎn)到醋酸纖維素薄膜的孔徑為0.2μm。

實施例1：

本發(fā)明布魯氏菌病的快速測定方法，包括如下步驟：1）表達(dá)片段克?。簩2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min，之后取1μL-2μL作為PCR擴增目的基因表達(dá)片段的模板，利用引物L(fēng)FGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作為前后引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)，利用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段的純化與回收，回收獲得布魯氏菌Omp19外膜蛋白基因表達(dá)片段溶解液；2）大腸桿菌原核表達(dá)載體的構(gòu)建：取步驟（1）中的回收后的布魯氏菌Omp19外膜蛋白基因表達(dá)片段溶解液和大腸桿菌pET-28a質(zhì)粒載體溶解液分別進(jìn)行內(nèi)切酶EcoRΙ和XhoΙ雙酶切處理，之后，在16℃金屬浴中進(jìn)行T4DNA連接酶連接12h，獲得連接產(chǎn)物；3）轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α克隆菌株：將步驟（2）中的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用“熱激法”進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到固體LB培養(yǎng)基平板；4）陽性克隆子的篩選：挑取步驟3）固體LB培養(yǎng)基表面的單個白色菌落，以前引物L(fēng)FGCGAACCGGCAATACCAG和后引物L(fēng)BGCCGCGTTGAGTACCGT進(jìn)行陽性克隆子的篩選，PCR反應(yīng)的程序為：94℃預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94℃變性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，進(jìn)行37℃過夜10h-12h液體搖菌處理，獲得陽性菌株菌液；5）質(zhì)粒提?。喝〔襟E（4）中的陽性菌株菌液1mL，利用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，得到陽性重組質(zhì)粒；6）轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)菌株：將步驟（5）中提取到的陽性重組質(zhì)粒，利用“熱激法”轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，得到固體LB培養(yǎng)基平板；7）陽性克隆子的篩選：次日，用無菌牙簽挑取步驟（6）中的固體LB培養(yǎng)基表面的單個白色菌落，以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作為菌落PCR反應(yīng)的一對引物，進(jìn)行陽性表達(dá)菌株的篩選，PCR反應(yīng)的程序為：94℃預(yù)變性5min，之后是35圈循環(huán)，每圈循環(huán)為94℃變性30s，59℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸10min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量體積比1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并且將能夠擴增出目的條帶的陽性菌落進(jìn)行菌種保存的同時，利用3mL-5mL液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行過夜液體搖菌處理，液體搖瓶培養(yǎng)的條件為：37℃，180rpm，培養(yǎng)12h，獲得表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液；8）誘導(dǎo)表達(dá)與親和純化：將步驟（7）中液體搖瓶培養(yǎng)的表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液作為誘導(dǎo)表達(dá)的母液，從中取0.5mL表達(dá)菌株培養(yǎng)菌液在無菌條件下轉(zhuǎn)接到一瓶50mL新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，卡那霉素的最終質(zhì)量體積濃度為50μg/mL，在37℃、180rpm條件培養(yǎng)3h-4h之后，在無菌條件下加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的最終物質(zhì)的量濃度為0.1mmol/L-1.0mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的條件為在37℃、180rpm條件下誘導(dǎo)3h-4h。之后，5000rpm低速離心收集菌體，用20mL1×PBS緩沖液重新懸起菌體沉淀，在冰浴中進(jìn)行菌體沉淀的超聲波破碎40min，結(jié)束后10000rpm高速離心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝膠親和純化柱進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的親和純化，收集獲得純化洗脫液；9）聚丙烯酰胺凝膠電泳：取步驟（8）的親和純化后的布魯氏菌Omp19外膜蛋白的純化洗脫液，對蒸餾水透析20h，并且12h期間更換一次蒸餾水，利用PEG8000進(jìn)行濃縮，取50μL濃縮液作為蛋白電泳的樣品進(jìn)行質(zhì)量體積比為15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，同時，以常見的BSA蛋白作為對照進(jìn)行試驗，試驗直到電泳指示劑剛剛?cè)颗艹瞿z低端為止，獲得蛋白質(zhì)凝膠電泳膠片；10）“半干法”轉(zhuǎn)膜：利用半干式印跡轉(zhuǎn)膜儀，將布魯氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝膠電泳的蛋白質(zhì)膠片轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素薄膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：電壓8v，時間40min，獲得轉(zhuǎn)膜后的醋酸纖維素薄膜；11）免疫印跡試驗：將轉(zhuǎn)膜后的醋酸纖維素薄膜用10mL質(zhì)量體積比為1%的脫脂奶粉溶液孵育10min，再用10mL1×PBS緩沖液洗膜40min，然后用家畜或者人的血清100μL孵育醋酸纖維素薄膜10h-12h，次日，利用10mL1×PBS緩沖液洗膜40min之后，用加有1μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗的10mL質(zhì)量體積比為1%的脫脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用10mL1×PBS緩沖液洗膜20-30min，最后在不見光的環(huán)境中利用由3%的4-氯-1-萘酚發(fā)色液1mL、30%雙氧水10μL、1×PBS緩沖液9mL組成的混合液進(jìn)行發(fā)色，發(fā)色時間為5min-10min，直到出現(xiàn)清晰可見的灰褐色條帶。將布魯氏菌Omp19外膜蛋白的質(zhì)量體積比為10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳膠片轉(zhuǎn)到醋酸纖維素薄膜的孔徑為0.2μm。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。