背景技術(shù)：

酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)最早在1971年由Engvall和Perlmann提出。它是一種將已知抗體或抗原吸附在固相載體(如聚苯乙烯板、微孔濾膜、磁珠等)表面并保持其免疫原性，利用酶標(biāo)抗原抗體間的特異性反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，根據(jù)酶催化底物顯色深淺程度進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的技術(shù)。該方法具有適用范圍廣、靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作規(guī)范及易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測(cè)、水污染防治和臨床疾病診斷等領(lǐng)域成為備受重視并廣泛應(yīng)用的檢測(cè)分析方法。目前，基于免疫反應(yīng)的臨床診斷等主要依賴于光學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)等分析方法。然而這些檢測(cè)手段一般均需大型儀器和專業(yè)操作人員，操作復(fù)雜，耗時(shí)久，且費(fèi)用昂貴。為了克服這些局限性，發(fā)展新型的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、簡(jiǎn)單輸出方法是目前科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)，例如研究者們已發(fā)展了以血糖儀、時(shí)間、氣味等作為信號(hào)輸出方法的便攜式傳感器，用于快速、原位、低成本檢測(cè)，然而這些方法仍然存在操作復(fù)雜、靈敏度低等、集成化程度低等問題(1.Y.J.Song,Y.Q.Zhang,P.E.Bernard,J.M.Reuben,N.T.Ueno,R.B.Arlinghaus,Y.L.Zu,L.D.Qin,Nat.Commun.2012,3,1283.；2.H.Noh,S.T.Phillips,Anal.Chem.2010,82,8071–8078.；4.H.Mohapatra,S.T.Phillips,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,11145–11148；Angew.Chem.2012,124,11307–11310.)。因此，發(fā)展更為高靈敏、高選擇性、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、集成化程度高的新型即時(shí)檢測(cè)技術(shù)，用于生物醫(yī)學(xué)分析，尤其是特定疾病的生物標(biāo)志物的定量檢測(cè)，成為目前生物醫(yī)學(xué)亟待解決的問題。

建立ELSIA作為一個(gè)快速、廉價(jià)以及集成化的檢測(cè)方法用于POCT的檢測(cè)，研究者們做出了很多嘗試。Vashist等嘗試用一步法ELSIA降低整個(gè)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，但其整個(gè)操作過程仍然需要專業(yè)操作，以及專門的信號(hào)讀出儀器(5.S.K.Vashist,E.M.Schneider,E.Lam,S.Hrapovic and J.H.T.Luong,Scientific Reports,2014,4,7.)。Yeh等將三明治ELSIA集成到一塊芯片上，即使用智能手機(jī)可以將信號(hào)讀出方式，但其仍然需要將樣品用槍頭析出然后再進(jìn)行檢測(cè)，不算真正意義的集成(6.Y.-T.Yeh,M.Nisic,X.Yu,Y.Xia and S.-Y.Zheng,Annals of Biomedical Engineering,2014,42,2333-2343.)。Dai-Wen Pang等人用紙芯片實(shí)現(xiàn)了CRP蛋白的檢測(cè)，而熒光作為信號(hào)也限制了其在POCT領(lǐng)域的應(yīng)用(7.Jiao Hu,Zhi-Ling Zhang,Cong-Ying Wen,Man Tang,Ling-Ling Wu,Cui Liu,Lian Zhu,and Dai-Wen Pang.Anal.Chem.,2016,88(12),pp 6577–6584)。所以盡管POC檢測(cè)目前研究者們已經(jīng)做出來大量嘗試，然而建立一種真正集成化、便攜、快速廉價(jià)、高靈敏的檢測(cè)方法迫在眉睫。

綜上所述，在未來的科學(xué)研究中，如何發(fā)展一種高靈敏、高選擇性、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、集成化程度高的新型即時(shí)檢測(cè)技術(shù)，用于生物醫(yī)學(xué)分析，尤其是特定疾病的生物標(biāo)志物的定量檢測(cè)，可應(yīng)用于即時(shí)診斷的的定量檢測(cè)分析方法是亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有高靈敏定量檢測(cè)分析方法及其儀器設(shè)備價(jià)格昂貴、實(shí)驗(yàn)方法成本高、免疫反應(yīng)操作復(fù)雜、耗時(shí)等缺點(diǎn)，發(fā)展了一種基于距離檢測(cè)靶標(biāo)的集成化ELISA芯片方法。該方法采用分子識(shí)別引入信號(hào)放大分子如酶或納米粒子，通過信號(hào)放大分子或粒子催化底物釋放出大量氣體分子，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，因而可以用于實(shí)驗(yàn)室中高靈敏度、高選擇性的無機(jī)離子、小分子、生物大分子例如蛋白質(zhì)、DNA、甚至病毒、細(xì)菌、細(xì)胞等多種靶標(biāo)的高靈敏度定量。另外，將繁瑣的免疫反應(yīng)以及距離信號(hào)輸出集成在一起，所有實(shí)驗(yàn)方法均在芯片內(nèi)完成，不需任何外接儀器的即時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)，能用于集成化地、高靈敏度POC定量檢測(cè)分析。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于距離檢測(cè)靶標(biāo)的集成化ELISA芯片，其設(shè)有多個(gè)水相腔和油相腔，該水相腔和油相腔交替排列為一行，且前后的腔體互相連通，水相腔設(shè)有水相進(jìn)口，油相腔設(shè)有油相進(jìn)口，行末的水相腔和一染料腔連接，該染料腔另設(shè)有第三進(jìn)口；染料腔和一染料氣柱通道連通，染料氣柱通道旁設(shè)有刻度。

在較佳的實(shí)施例中，水相腔的數(shù)量和油相腔的數(shù)量分別為5-15個(gè)。

在較佳的實(shí)施例中，水相腔中至少包括過氧化氫溶液，PtNPs溶液，鏈霉親和素溶液和生物素化抗體溶液，每種溶液獨(dú)立設(shè)于一水相腔內(nèi)。

在較佳的實(shí)施例中，油相腔中含有礦物油。

在酶聯(lián)免疫吸附法體系中，基于距離檢測(cè)靶標(biāo)的定量檢測(cè)方法包括如下步驟：(1)根據(jù)要檢測(cè)的抗原選擇相對(duì)應(yīng)的捕獲抗體及檢測(cè)抗體；(2)對(duì)信號(hào)放大分子進(jìn)行修飾，使其與檢測(cè)抗體分子偶聯(lián)結(jié)合，或使其能夠特異性的與檢測(cè)抗體結(jié)合；(3)在磁珠或微球表面進(jìn)行包被，加入捕獲抗體使其結(jié)合于包被后的固相表面，之后進(jìn)行封閉液封閉。(4)將以下試劑載入芯片：檢測(cè)抗原與捕獲抗體包被的磁珠，檢測(cè)抗體、信號(hào)放大分子，洗去多余試劑的洗滌緩沖液，底物以及染料，其中；水相從水相進(jìn)口進(jìn)入水相腔；油相從油相進(jìn)口進(jìn)入各油相腔，染料加入染料腔，磁珠和樣品加入第一個(gè)水相腔；(5)密封加樣孔，磁移動(dòng)，利用磁鐵對(duì)磁珠拉動(dòng)，將磁珠和樣品從第一個(gè)水相腔拉至最后一個(gè)水相腔，完成每一步反應(yīng)，信號(hào)放大分子催化底物分子，生成大量氣體分子，氣體推動(dòng)染料前進(jìn)產(chǎn)生距離信號(hào)；(6)根據(jù)距離信號(hào)，記錄數(shù)據(jù)，進(jìn)而建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)現(xiàn)未知樣品中靶標(biāo)分子的定量檢測(cè)。

本發(fā)明一種基于距離檢測(cè)靶標(biāo)的集成化ELISA芯片方法，將繁瑣的免疫實(shí)驗(yàn)步驟、清洗步驟、距離信號(hào)輸出集成到一塊微流控氣動(dòng)芯片上，利用分子識(shí)別引入信號(hào)放大分子或粒子，通過信號(hào)放大分子或粒子催化底物釋放出氣體分子，導(dǎo)致氣體推動(dòng)染料前進(jìn)，并最終通過讀取染料移動(dòng)的距離，實(shí)現(xiàn)高靈敏定量集成化檢測(cè)。

其中，所述的集成，是將繁瑣的免疫反應(yīng)以及距離信號(hào)輸出集成在一起，所有實(shí)驗(yàn)方法均在芯片內(nèi)完成，組成一個(gè)不需任何外接儀器的即時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)。

其中，基于距離的可視化定量方法是將不同濃度的待測(cè)物作為信號(hào)輸入，經(jīng)過特定的反應(yīng)后以不同長(zhǎng)度的有色條帶作為輸出信號(hào)。用戶只需要通過讀取條帶的長(zhǎng)度,即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的可視化定量檢測(cè)。

其中，所述的分子識(shí)別包括，利用具有特異性識(shí)別功能的分子對(duì)所述靶標(biāo)進(jìn)行識(shí)別或標(biāo)記，并通過將該識(shí)別分子將信號(hào)放大分子或粒子引入檢測(cè)體系中。

其中，所述信號(hào)放大分子包括能夠催化底物產(chǎn)生氣體的催化劑或酶，其催化底物為受催化后產(chǎn)生氣體分子的物質(zhì)，氣體分子為底物受催化后的產(chǎn)物。

其中，所述的信號(hào)放大分子包括過氧化氫酶、金納米粒子、鉑納米粒子、金鉑納米粒子、錳氧化物納米粒子或其他可以催化底物產(chǎn)生氣體的催化劑或酶。

其中，檢測(cè)探針上偶聯(lián)有能夠催化底物產(chǎn)生大量氣體的信號(hào)放大分子，例如酶或納米粒子。

其中，使用的檢測(cè)探針通過化學(xué)或生物的偶聯(lián)方法與信號(hào)放大分子(酶或納米粒子)偶聯(lián)，通過檢測(cè)探針的特異性引入酶或納米粒子。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：首先，該方法在設(shè)計(jì)上符合ASSURED(Martinez A.，Phillips S.，Whitesides G.，et.al.，Diagnostics for the Developing World:Microfluidic Paper-Based Analytical Devices,Analytical Chemistry[J].2010,82.3-10.)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，它靈敏度高、選擇性好，檢測(cè)結(jié)果可靠；其次，整個(gè)反應(yīng)過程簡(jiǎn)單、快速，只需移動(dòng)磁珠完成整個(gè)免疫過程，時(shí)間在2個(gè)小時(shí)內(nèi)，集成化程度高；再者，將產(chǎn)生O₂的體積量轉(zhuǎn)化為距離，并與免疫反應(yīng)集成在一張微流控芯片上，能用于集成化地、高靈敏度POC定量檢測(cè)分析。該發(fā)明是以距離作為信號(hào)輸出，ELSIA過程一體化，即將不同濃度的待測(cè)物作為信號(hào)輸入，經(jīng)過特定的反應(yīng)后以不同長(zhǎng)度的有色條帶作為輸出信號(hào)，用戶只需要通過讀取條帶的長(zhǎng)度,即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的可視化定量檢測(cè)。此類芯片設(shè)計(jì)靈活，通用性強(qiáng)，可以針對(duì)不同靶標(biāo)達(dá)到相應(yīng)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍。該方法不需任何外接儀器,檢測(cè)結(jié)果不受用戶個(gè)體差異和環(huán)境的影響，并且易于集成，在醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用價(jià)值。鑒于成本低廉，檢測(cè)快速，用戶友好、集成化以及基于距離檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，我們提出的基于距離檢測(cè)靶標(biāo)的集成化ELSIA芯片方法有可能發(fā)展成為公眾用于廣泛的靶標(biāo)定量檢測(cè)工具。

本發(fā)明利用油水互不相容的原理，將水相試劑以及磁珠物理的隔開，再通過磁鐵拉動(dòng)磁珠完成每一步反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的集成；利用納米粒子催化雙氧水生成大量氣體，將檢測(cè)靶標(biāo)分子的信號(hào)轉(zhuǎn)換為氣體信號(hào)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，氣體推動(dòng)染料前進(jìn)，并最終通過讀取染料移動(dòng)的距離，實(shí)現(xiàn)高靈敏定量集成化檢測(cè)。本發(fā)明中，以具有廣泛臨床意義的C-反應(yīng)蛋白(C-reaction protein,CRP)作為靶標(biāo)，證明了該發(fā)明的可行性、適用性、及可靠性。并以通過對(duì)腫瘤標(biāo)志物前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen,PSA)的檢測(cè)，證明該發(fā)明的體系通用性。

本發(fā)明方法檢測(cè)靈敏度高，且具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、反應(yīng)快速、集成化程度高，且通用性好，可用于血液、唾液等各種復(fù)雜體系中蛋白靶標(biāo)的快速、高靈敏定量檢測(cè)。

附圖說明

圖1為在室溫下，不同濃度生物素化的PtNPs的距離響應(yīng)情況可行性考察。

圖2為在室溫下，不同濃度的Tween20對(duì)磁珠滯留及免疫實(shí)驗(yàn)的影響考察。

圖3為在室溫下，氣柱深度對(duì)實(shí)驗(yàn)靈敏度以及重現(xiàn)性的影響。

圖4為在室溫下，不同濃度生物素化的PtNPs的距離響應(yīng)情況考察。

圖5為在室溫下，不同濃度生物素化的PtNPs的距離線性響應(yīng)情況。

圖6為在室溫下，免疫體系中，信號(hào)分子為生物素化的PtNPs，在10min時(shí)間內(nèi)，用于C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)，考察體系的可行性。

圖7為在室溫下，免疫體系中，信號(hào)分子為生物素化的PtNPs，在10min時(shí)間內(nèi)，用于C-反應(yīng)蛋白(CRP)的檢測(cè)，進(jìn)行工作標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，時(shí)間為5min。

圖8為在室溫下，免疫體系中，以人血清白蛋白(HSA)、羊抗鼠二抗(IgG)、凝血酶(Thr)為負(fù)對(duì)照，考察該體系對(duì)C-反應(yīng)蛋白(CRP)的選擇性，圖為對(duì)于0.05μg/ml HSA、IgG、Thr、PSA的響應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為5min。

圖9為在室溫下，免疫體系中，使用芯片方法，將不同濃度靶標(biāo)蛋白加入到血清中排除基質(zhì)效應(yīng)，考察C-反應(yīng)蛋白(CRP)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，時(shí)間為5min。

圖10為在室溫下，免疫體系中，以常規(guī)免疫比濁為標(biāo)準(zhǔn)方法，將不同濃度靶標(biāo)蛋白加入到血清中排除基質(zhì)效應(yīng)，考察C-反應(yīng)蛋白(CRP)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，時(shí)間為5min。

圖11為在室溫下，對(duì)未知臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較臨床標(biāo)準(zhǔn)方法和芯片方法的準(zhǔn)確性。

圖12為在室溫下，以人前列腺特異性抗原(PSA)作為靶標(biāo)，考察芯片的體系通用性。

圖13為芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中A為上層結(jié)構(gòu)示意圖，B為中層結(jié)構(gòu)示意圖，C為下層結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：芯片的制作

根據(jù)計(jì)算機(jī)中Auto CAD的芯片設(shè)計(jì)，在PMMA材料上激光刻蝕產(chǎn)生所要的微結(jié)構(gòu)與微通道，中間一層包含11個(gè)圓形孔，9個(gè)橢圓孔，以及氣柱通道。上面一層為水相加入通道以及加樣孔，最下層為油相加入通道。三層芯片的厚度均為2.2mm。光切割好的PMMA片利用熱鍵和的方式將三層鍵合在一起。為了防止毛細(xì)作用，鍵合后的芯片通道用氟油孵化，過夜氟油揮發(fā)后，芯片待用。

具體的，參見圖13，該芯片包括上層1、中層2和下層3，其中，中層2中間設(shè)有一行由圓形孔和橢圓形孔交替設(shè)置的腔，其中圓形孔為水相腔21，橢圓形孔為油相腔22，且這些孔是互相連通的。在最左側(cè)的圓形孔側(cè)面設(shè)有染料腔23，該最左側(cè)的圓形孔和染料腔23連通。該中層設(shè)有S形彎折排列的染料氣柱通道24，染料氣柱通道24的側(cè)面設(shè)刻度25.染料氣柱通道24的起點(diǎn)和染料腔23連通，終點(diǎn)為出氣孔26。中層的右上角設(shè)多個(gè)油相通孔27，其數(shù)量和油相腔22的數(shù)量一致或更多。

上層左上角設(shè)有多個(gè)水相進(jìn)樣孔12，該每個(gè)水相進(jìn)樣孔12分別和一水相槽11連接，每條水相槽11設(shè)于上層的下表面，起點(diǎn)位于水相進(jìn)樣孔12，終點(diǎn)位于中層水相腔21的對(duì)應(yīng)位置。上層的右上角設(shè)有多個(gè)油相進(jìn)樣孔17，其位置和數(shù)量分別中層右上角的油相通孔27的位置和數(shù)量對(duì)應(yīng)，數(shù)量也可更多。上層還設(shè)有連通染料腔23的第三進(jìn)樣孔13，用于加可視化的紅色染料。

下層上表面設(shè)有多道油相槽37，每個(gè)水相槽37起點(diǎn)分別為中層的油相通孔27對(duì)應(yīng)的位置，終點(diǎn)為中層的油相腔22對(duì)應(yīng)的位置。

在使用時(shí)，油相從上層的各油相進(jìn)樣孔17進(jìn)入，然后分別經(jīng)過中層的油相通孔27，再經(jīng)過下層的油相槽37進(jìn)入各油相腔22；水相從上層的水相進(jìn)樣孔12進(jìn)入，經(jīng)過水相槽11分別進(jìn)入各水相腔21。染料腔23的原料從第三進(jìn)樣孔13進(jìn)入。

在其它的實(shí)施例中，油相槽37和水相槽11也可分別設(shè)于中層的上下表面，或是兩者之一設(shè)在中層。

實(shí)施例2：biotin基團(tuán)及巰基基團(tuán)修飾的核酸分子的合成與純化

以普通CPG作為固相載體，以DNA單體堿基為原料，在DNA合成儀上由3′端向5′端合成表1中的序列DNA，具體合成的序列見表1。以biotin修飾的CPG作為固相載體，以DNA單體堿基為原料，在DNA合成儀上由3′端向5′端合成，最后5′端修飾修飾巰基。合成結(jié)束后，將上述CPG轉(zhuǎn)移至2mL潔凈滅菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺：氨水＝1:1的溶液，在65℃下氨解30min，使DNA從CPG上切割下來。氨解完畢后提取上清，并用少量超純水清洗CPG，合并上清。向體系中加入2.5倍體積的冰凍無水乙醇和0.1倍體積的3mol/L NaCl，于-20℃冰箱進(jìn)行酒精沉淀30min。酒精沉淀完畢后，在14,000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10min，棄上清。將得到的粗產(chǎn)物溶解在pH 8的0.1mol/L的醋酸三乙胺(TEAA)中，使用反相高效液相色譜儀進(jìn)行純化。將通過反相-HPLC純化后的產(chǎn)品進(jìn)行真空干燥。除巰基修飾DNA外，其余DNA溶于80％乙酸中脫DMT，反應(yīng)30min后，抽干再用超純水后溶解，使用凝膠過濾柱進(jìn)行脫鹽處理。使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定260nm處核酸的吸光度，根據(jù)DNA的消光系數(shù)計(jì)算出其相應(yīng)的物質(zhì)的量和濃度值。定量后真空濃縮。5’巰基修飾DNA在HPLC純化后，加入pH 6.5的0.1M TEAA溶解DNA，測(cè)A260，將其稀釋至A260＝100，記錄總體積為V；之后加入0.15V的1M AgNO3，混勻，室溫反應(yīng)30min；再加入0.20V的1M DTT(二硫蘇糖醇)，混勻，室溫反應(yīng)5min；離心，取上清(DTT絡(luò)合物)，沉淀用1V 0.1M TEAA洗滌，合并洗滌液；使用凝膠過濾柱進(jìn)行脫鹽處理。使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定260nm處核酸的吸光度，根據(jù)DNA的消光系數(shù)計(jì)算出其相應(yīng)的物質(zhì)的量和濃度值。定量后真空濃縮。

表1實(shí)施例2中所用DNA序列

實(shí)施例3：PtNPs的合成及修飾

將100μL新鮮配置的0.4M抗壞血酸溶液加至含有1mL濃度為1mM的氯鉑酸溶液中，并迅速放置于80℃恒溫干浴鍋中反應(yīng)30min，即得30nm大小的PtNPs。為將PtNPs用于后續(xù)免疫反應(yīng)，需對(duì)其進(jìn)行生物分子修飾。文中利用SH-PEG-biotin linker修飾PtNPs獲取生物素化的PtNPs(biotin-PtNPs)。具體操作為，將10μL 1％的Tween-20和5μL 100μM的mPEG-SH(MW～5KD)加至1mL 4.5nM的PtNPs中，渦旋混勻后加入10μL 120μM的SH-PEG-biotin linker和50μL 0.2M的H3PO4溶液，渦旋混勻后于37℃條件下反應(yīng)1h。反應(yīng)結(jié)束后，用含有0.1％Tween-20和0.5％BSA的PBS溶液(pH7.4)在13000rpm轉(zhuǎn)速下離心洗滌3次，每次4min，最后重懸在1mL上述溶液中即得終濃度為2.5nM的biotin-PtNPs，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4：生物素化辣根過氧化物酶(HRP)的制備

利用Biotin-NHS與蛋白-NH2之間發(fā)生酯交換反應(yīng)制備生物素化的抗體(biotin-antibody)。用pH 9.0的0.1M NaHCO3緩沖液稀釋抗體得1mg/mL HRP溶液，向其中緩慢滴加1/8體積的含有1mg/mL Biotin-NHS的DMF溶液，渦旋混勻后，4℃冰箱過夜反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在30k大小的超濾離心管中，用含有0.1％Tween-20，pH 7.4的PBS緩沖液，14000rpm，4℃下離心洗滌3次，每次30min。最后重懸于500μL含有0.1％Tween-20，0.5％BSA，pH 7.4的PBS緩沖液中，得1mg/mL的biotin-HRP，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例5：試劑載入芯片

依次將可視化的紅色染料、過氧化氫，PtNPs，鏈霉親和素，生物素化抗體，以及洗液PBST加入到圓形孔中(可視化的紅色染料通過第三進(jìn)樣孔13加入染料腔23，其余通過進(jìn)樣孔12加入，加樣順序從左至右，每個(gè)圓形孔加一種樣品；在ELISA每一步之間加入一步PBST用于清洗,鏈霉親和素和PtNPs之間加入兩步PBST，用于徹底清洗)。然后通入礦物油至橢圓孔(油相進(jìn)樣孔17加入，加樣順序從左至右)，；然后將樣品和磁珠混合物加至最右邊第一個(gè)圓形孔，最后在最右邊第一個(gè)油相孔中加入礦物油。

樣品和磁珠混合物的制備過程：2mg/mL的磁珠吸去上清，加入一系列濃度的CRP樣品，混勻。

實(shí)施例6：磁移動(dòng)及數(shù)據(jù)記錄

利用直徑20mm/厚1mm的超薄磁鐵片，連續(xù)5-10個(gè)，將磁微珠從一個(gè)圓形孔拖到另一個(gè)圓形孔。反應(yīng)時(shí)間依次為，樣品反應(yīng)30min，抗體反應(yīng)30min，鏈霉親和素反應(yīng)15min，PtNPs反應(yīng)15min，每一孔洗滌時(shí)間5min，用superglue粘蓋玻片，保證氣密性，將磁珠轉(zhuǎn)移至過氧化氫孔中，產(chǎn)氣記錄數(shù)據(jù)。

其結(jié)果見圖1至圖13。

圖1結(jié)果表明：隨著產(chǎn)氣時(shí)間的延長(zhǎng)，不同濃度的PtNPs具有不同的距離響應(yīng)。

圖2結(jié)果表明：不同濃度的tween20對(duì)ELISA的結(jié)果沒有影響，1％的tween20條件下，磁珠沒有殘留。

圖3結(jié)果表明：不同高度的氣柱通道條件下，氣柱通道為600微米時(shí)，距離響應(yīng)具有很好的穩(wěn)定性和靈敏度。

圖4結(jié)果表明：不同濃度的PtNPs在10min內(nèi)具有不同的距離響應(yīng)。

圖5結(jié)果表明：不同濃度的PtNPs對(duì)距離具有良好的線性響應(yīng)。

圖6結(jié)果表明：0.05μg/mL的CRP在5min產(chǎn)氣情況下，具有一定的距離響應(yīng)。

圖7結(jié)果表明：不同濃度的CRP對(duì)距離具有良好的線性響應(yīng)。

圖8結(jié)果表明：本發(fā)明方法具有良好的特異性。

圖9結(jié)果表明：以血清作為基質(zhì)，不同濃度的CRP對(duì)距離具有良好的線性響應(yīng)。

圖10結(jié)果表明：臨床標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)CRP的檢測(cè)的響應(yīng)曲線。

圖11結(jié)果表明：通過對(duì)16例臨床標(biāo)本的檢測(cè)，本發(fā)明的方法和臨床標(biāo)準(zhǔn)方法具有很好的一致性，

圖12結(jié)果表明：通過對(duì)PSA的檢測(cè)，本發(fā)明的方法具有很好的通用性。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍。