本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域,具體涉及一種定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫試紙條及其制備方法。
背景技術(shù):
生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白(ST2)是心肌細(xì)胞受到生物機(jī)械應(yīng)力后產(chǎn)生的一種心肌蛋白,1989年Tominaga等首先發(fā)現(xiàn)了ST2基因,但因未發(fā)現(xiàn)其功能性配體,一直被誤認(rèn)為是孤兒受體。2005年Schmitz等發(fā)現(xiàn)其特異性功能配體白細(xì)胞介素IL-33。ST2基因表達(dá)于肥大細(xì)胞、激活的輔助性T細(xì)胞(Th2)、巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞。人的ST2基因可編碼一種可溶性生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白(sST2)和一種跨膜形式生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白(ST2L),兩者的轉(zhuǎn)錄分別受到不同的啟動(dòng)子調(diào)控。
IL-33屬于IL-1家族,廣泛存在于多種組織細(xì)胞中,是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子之一。正常情況下,IL-33存在于細(xì)胞核中,作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí),IL-33可分泌到胞外,主要通過(guò)結(jié)合受體ST2傳遞信號(hào),作為細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等作用。ST2L/IL-33信號(hào)通路在抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗心肌纖維化和心肌細(xì)胞肥大等的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。心臟成纖維細(xì)胞受到機(jī)械應(yīng)力刺激后可產(chǎn)生IL-33,而IL-33與其受體ST2L結(jié)合后,將活化信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi),經(jīng)過(guò)下游的IL-1相關(guān)蛋白激酶、髓樣分化因子88和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6等一系列信號(hào)分子,激活核轉(zhuǎn)錄核因子(NF)-κB和Map激酶,從而影響基因的轉(zhuǎn)錄,誘發(fā)Th2細(xì)胞效應(yīng)分子IL-4和IL-5等的釋放。當(dāng)心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞受到強(qiáng)壓力負(fù)荷時(shí),這些效應(yīng)分子可使心臟做出保護(hù)性變化,拮抗?fàn)坷^(guò)度導(dǎo)致的心肌肥大并心肌纖維化發(fā)生。而sST2是IL-3的誘騙受體,能夠結(jié)合并中和IL-33,表現(xiàn)為對(duì)ST2L/IL-33信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)。血清中過(guò)多的sST2可以使心肌在受到機(jī)械應(yīng)力損傷時(shí)缺乏足夠的IL-33保護(hù)作用,進(jìn)而發(fā)生心肌重塑和心功能障礙。
與冠脈造影和左心室功能正常人群相比,主動(dòng)脈狹窄患者和充血性心肌病患者的sST2水平顯著增高。急性心衰患者的sST2水平越高,心衰的嚴(yán)重程度越高,sST2與NYHA心功能分級(jí)正相關(guān)。因此,通過(guò)檢測(cè)sST2水平,可鑒別不同風(fēng)險(xiǎn)水平的患者,從而針對(duì)不同風(fēng)險(xiǎn)的患者給予適當(dāng)?shù)闹委煼桨?,進(jìn)而有效降低心衰的發(fā)病率和死亡率。臨床上,sST2的濃度可用于估計(jì)心臟代謝失調(diào),心室重構(gòu)等。sST2可作為心衰的標(biāo)志物,不僅可用于篩查心衰患者,獨(dú)立的對(duì)心力衰竭進(jìn)行診斷,對(duì)心衰患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層;作為急性心力衰竭患者結(jié)構(gòu)和功能惡化的預(yù)測(cè)性指標(biāo),是急性心力衰竭預(yù)后的強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子;sST2能夠很好的預(yù)測(cè)患者在短期、中長(zhǎng)期(三個(gè)月、一年、三至五年)內(nèi)的死亡率,為患者是否進(jìn)行心臟移植提供數(shù)據(jù)支持,有利于提前干預(yù)提供患者的治愈率和成活率。
標(biāo)記免疫分析法是將具有高度敏感性的標(biāo)記示蹤技術(shù)和免疫學(xué)中抗原抗體的高度特異性反應(yīng)相結(jié)合的產(chǎn)物,包括放射免疫(RIA)、酶聯(lián)免疫分析(EIA)、化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)、電化學(xué)發(fā)光免疫分析(ECLIA)和時(shí)間分辨熒光免疫分析(TRFIA)。TRFIA技術(shù)是20世紀(jì)70年代末Wallac公司創(chuàng)立的一種非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)。示蹤物選用的是鑭系元素如銪、鉍、釤和鏑的三價(jià)稀土離子及其螯合物,用以代替熒光物質(zhì)、酶、同位素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)來(lái)標(biāo)記抗體、抗原、激素、多肽、蛋白質(zhì)、核酸探針及生物細(xì)胞等,在一定的反應(yīng)體系(例如常用的抗原抗體反應(yīng)、生物素親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等)內(nèi)發(fā)生反應(yīng)后,用時(shí)間分辨熒光免疫分析檢測(cè)儀測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物中的特異熒光強(qiáng)度,并與相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)熒光曲線比對(duì),判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度,從而達(dá)到定量分析待測(cè)物的目的。
TRFIA的反應(yīng)原理和其他標(biāo)記免疫分析相似。常用的有雙位點(diǎn)夾心法和固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法。雙位點(diǎn)夾心分析法多用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)類大分子化合物。使用針對(duì)被測(cè)物上不同抗原決定簇的兩個(gè)單克隆抗體,一個(gè)用Eu3+標(biāo)記,另一個(gè)包被固相載體,經(jīng)過(guò)免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物后,再將Eu3+從復(fù)合物上完全解離下來(lái),在Eu3+的增強(qiáng)液中與另一種螯合劑結(jié)合,在協(xié)同劑的作用下,形成一個(gè)Eu3+包裹于其內(nèi)部的微膠囊(膠態(tài)分子團(tuán))。它在激發(fā)光作用下能發(fā)射出很強(qiáng)的熒光信號(hào),其強(qiáng)弱與待測(cè)抗原(或抗體)含量相關(guān)。該法用于測(cè)定蛋白質(zhì)類大分子化合物。固相抗體競(jìng)爭(zhēng)法多用于一些小分子半抗原化合物的測(cè)定,因分子質(zhì)量小,不能直接進(jìn)行固相包被,如多肽、甲狀腺激素類和一些藥物等,都必須經(jīng)過(guò)化學(xué)耦聯(lián)劑與載體蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)鍵結(jié)合,然后可包被聚苯乙烯微量滴定條孔壁,制成固相抗原。其原理是:限量固相抗體與Eu3+標(biāo)記抗原和樣品中的待測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,樣品中的抗原濃度越高,固相抗體結(jié)合的Eu3+標(biāo)記抗原量就越少,反之亦然,即固相抗體上的熒光信號(hào)強(qiáng)度與樣品中的抗原濃度成反比。
TRFIA技術(shù)是近年來(lái)新興起來(lái)的一種超微量快速免疫檢測(cè)技術(shù),具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好,而且測(cè)定范圍更寬,實(shí)際壽命長(zhǎng),操作簡(jiǎn)便和非放射性等特點(diǎn),非常適用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)上的分析檢測(cè)。該技術(shù)越來(lái)越受到各領(lǐng)域科研工作者的關(guān)注,應(yīng)用范圍也不斷發(fā)展,是繼放射免疫分析、酶標(biāo)、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光之后的一種更新、更靈敏的檢測(cè)方法。
目前,檢測(cè)sST2的方法主要是采用的是酶聯(lián)免疫法(ELISA)。ELISA技術(shù)存在以下缺點(diǎn):檢測(cè)設(shè)備要求高,成本高;干擾因素較多,重復(fù)性不好;檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。因此酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)可溶性生長(zhǎng)刺激基因2蛋白不適合臨床快速診斷。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷,本發(fā)明提供一種可用于定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條及其制備方法,采用該免疫分析試紙條,不僅能夠提供較高的靈敏度和特異性,操作簡(jiǎn)單,可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè),滿足了臨床檢驗(yàn)的需要,而且降低了成本,滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求。
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
本發(fā)明一種定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條,包括:包括底板,底板上依次相互交錯(cuò)排列樣品墊、結(jié)合墊、包被膜和吸水紙,包被膜貼合在底板中部,包被膜一側(cè)邊緣上端貼覆結(jié)合墊,另一側(cè)邊緣上端貼合吸水紙,結(jié)合墊遠(yuǎn)離包被膜的一側(cè)邊緣上方貼覆樣品墊;
底板以及底板上依次相互交錯(cuò)排列的樣品墊、結(jié)合墊、包被膜和吸水紙,所述包被膜貼合在底板中部上,所述結(jié)合墊貼合在底板上,一側(cè)壓覆在包被膜一側(cè)邊緣上,所述樣品墊貼合在底板上,一側(cè)壓覆在結(jié)合墊邊緣上,所述吸水紙一側(cè)壓覆在包被膜另一側(cè)邊緣上;
所述結(jié)合墊上包被有稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I,所述稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I為鼠源性sST2單克隆抗體,所述包被膜上包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線,所述檢測(cè)線固定有識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II,所述質(zhì)控線固定有兔抗鼠IgG抗體;
所述包被膜上檢測(cè)線和質(zhì)控線相互平行,所述檢測(cè)線靠近所述結(jié)合墊,所述質(zhì)控線靠近所述吸水紙。
優(yōu)選的,所述結(jié)合墊為聚酯膜。
優(yōu)選的,所包被膜為硝酸纖維素膜。
優(yōu)選的,所述稀土離子微球?yàn)橛糜跇?biāo)記的任何鑭系金屬元素微球。
優(yōu)選的,所述稀土離子微球表面帶有活性基團(tuán),可以連接蛋白、糖類等生物物質(zhì)。
優(yōu)選的,所述稀土離子微球的直徑為100nm-300nm。
優(yōu)選的,本發(fā)明提供定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條,還包括一卡殼,所述試紙條裝入在卡殼內(nèi),露出樣品墊、結(jié)合墊、包被膜上的檢測(cè)線和質(zhì)控線、以及吸水墊。
優(yōu)選的,所述卡殼為塑料卡殼。
本發(fā)明提供上述定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條的制備方法,包括如下步驟:
(1)在包被膜的不同位置分別固定識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體,形成檢測(cè)線和質(zhì)控線;
(2)制備稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I,并噴涂在結(jié)合墊上;
(3)在底板上依次相互交錯(cuò)的黏貼上樣品墊、結(jié)合墊、包被膜和吸水紙,然后切割成寬度為0.4~0.6cm大小,裝入卡殼。
優(yōu)選的,步驟(1)中包被膜的制備方法為:使用含有1%-10%蔗糖的0.01-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液,分別將識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體稀釋到0.5mg/mL-2.0mg/mL的濃度,使用定量噴膜儀以1μL/cm-2μL/cm的量將二者以0.5cm-1.0cm的間隔噴于包被膜上,35-38℃烘干0.5-2.0h,加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
優(yōu)選的,步驟(2)中所述稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I的制備方法為:將sST2單克隆抗體I用0.01mol/L-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的磷酸緩沖液在2~4℃溫度下透析過(guò)夜,之后調(diào)整濃度為1mol/L-1.5mol/L;使用0.02mol/L-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的MES活化緩沖液洗滌微球,加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),終濃度為10mmol/L,室溫反應(yīng)10-20分鐘,充分洗滌稀土離子微球,用0.02mol/L-0.05mol/L的pH為7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后加入透析后的sST2單克隆抗體I,使sST2單克隆抗體I與稀土離子微球的質(zhì)量比為1:50-4:50,室溫反應(yīng)1.5~2.5小時(shí),加入含有1%-10%BSA的0.01-0.05mol/L的pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液,室溫反應(yīng)25~35分鐘,洗滌稀土離子微球,用含有0.05%-1%BSA,0.05%-0.1%Tween-20,0.01-0.05mol/L的pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液保存液復(fù)溶至原體積,使用定量噴膜儀以3μL/cm-5μL/cm噴涂于結(jié)合墊上,避光,在35-38℃烘干0.5~1.5小時(shí),加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):將時(shí)間分辨免疫層析技術(shù)引入可溶性生長(zhǎng)刺激基因2蛋白的檢測(cè)中,結(jié)合時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀,實(shí)現(xiàn)了可溶性生長(zhǎng)刺激基因2蛋白的單人份定量檢測(cè),且靈敏度高,批內(nèi)、批間差小,為臨床使用提供了極大便利;本發(fā)明操作簡(jiǎn)便,具有良好的穩(wěn)定性,檢測(cè)時(shí)間短,且靈敏度高、準(zhǔn)確性好,標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值接近1,線性穩(wěn)定,由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合出的回歸方程準(zhǔn)確,便于樣品濃度計(jì)算;無(wú)輻射污染,適合大規(guī)模生產(chǎn),對(duì)于可溶性生長(zhǎng)刺激基因2蛋白的定量檢測(cè)有著積極的意義。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明中定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨免疫分析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖;
圖2是本發(fā)明包含卡殼的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖;
其中,1、底板,2、樣品墊,3、結(jié)合墊,4、包被膜,5、吸水紙,6、檢測(cè)線,7、質(zhì)控線,8、殼體。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白,以下結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解,此處所描述的具體實(shí)施方式僅僅用以解釋本發(fā)明,但并不用于限定本發(fā)明。
如圖1所示,一種快速檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條,包括底板1,底板1上依次相互交錯(cuò)排列樣品墊2、結(jié)合墊3、包被膜4和吸水紙5,包被膜4貼合在底板1中部,包被膜4一側(cè)邊緣上端貼覆結(jié)合墊3,另一側(cè)邊緣上端貼合吸水紙5,結(jié)合墊3遠(yuǎn)離包被膜4的一側(cè)邊緣上方貼覆樣品墊2;
結(jié)合墊3上包被有稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I,包被膜3上包被有檢測(cè)線6和質(zhì)控線7,檢測(cè)線6固定有識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II,質(zhì)控線7固定有兔抗鼠IgG抗體;
包被膜4上檢測(cè)線6和質(zhì)控線7相互平行,檢測(cè)線6靠近結(jié)合墊3,質(zhì)控線7靠近吸水紙5。
結(jié)合墊3為聚酯膜,能夠負(fù)載足量的稀土離子微球,并且在遇到樣品時(shí)能夠迅速釋放微球。
包被膜4為硝酸纖維素膜。
稀土離子微球?yàn)橛糜跇?biāo)記的任何鑭系金屬元素微球,稀土離子微球表面帶有活性基團(tuán),可以連接蛋白、糖類等生物物質(zhì),稀土離子微球的直徑為100nm-300nm。
如圖2所示,定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條,還包括一卡殼8,試紙條裝入在卡殼內(nèi),露出樣品墊2、結(jié)合墊3、包被膜4上的檢測(cè)線6和質(zhì)控線7、以及吸水墊5。
卡殼8為塑料卡殼。
實(shí)施例1
定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條的制備方法,包括如下步驟:
(1)在包被膜4的不同位置分別固定識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體,形成檢測(cè)線和質(zhì)控線;
(2)制備稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I,并噴涂在結(jié)合墊3上;
(3)在底板1上依次相互交錯(cuò)的黏貼上樣品墊2、結(jié)合墊3、包被膜4和吸水紙5,然后切割成寬度為0.5cm大小,裝入卡殼8。
步驟(1)中包被膜4的制備方法為:使用含有1%蔗糖的0.01mol/L的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液,分別將識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體稀釋到0.5mg/mL的濃度,使用定量噴膜儀以1μL/cm的量將二者以0.5cm的間隔噴于包被膜4上,35℃烘干2h,加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
步驟(2)中稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I的制備方法為:將sST2單克隆抗體I用0.01mol/L的pH為7.2的磷酸緩沖液在2℃溫度下透析過(guò)夜,之后調(diào)整濃度為1mol/L;使用0.02mol/L的pH為7.2的MES活化緩沖液洗滌微球,加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),終濃度為10mmol/L,室溫反應(yīng)10分鐘,充分洗滌稀土離子微球,用0.02mol/L的pH為7.2的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后加入透析后的sST2單克隆抗體I,使sST2單克隆抗體I與稀土離子微球的質(zhì)量比為1:50,室溫反應(yīng)1.5小時(shí),加入含有1%BSA的0.01mol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液,室溫反應(yīng)25分鐘,洗滌稀土離子微球,用含有0.05%BSA,0.05%Tween-20,0.01mol/L的pH7.2的磷酸鹽緩沖液保存液復(fù)溶至原體積,使用定量噴膜儀以3μL/cm噴涂于結(jié)合墊3上,避光,在35℃烘干1.5小時(shí),加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2
定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條的制備方法,包括如下步驟:
(1)在包被膜4的不同位置分別固定識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體,形成檢測(cè)線和質(zhì)控線;
(2)制備稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I,并噴涂在結(jié)合墊3上;
(3)在底板1上依次相互交錯(cuò)的黏貼上樣品墊2、結(jié)合墊3、包被膜4和吸水紙5,然后切割成寬度為0.5cm大小,裝入卡殼8。
步驟(1)中包被膜4的制備方法為:使用含有5.5%蔗糖的0.03mol/L的pH為7.4的磷酸鹽緩沖液,分別將識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體稀釋到1.25mg/mL的濃度,使用定量噴膜儀以1.5μL/cm的量將二者以0.75cm的間隔噴于包被膜4上,37℃烘干1.25h,加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
步驟(2)中稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I的制備方法為:將sST2單克隆抗體I用0.03mol/L的pH為7.4的磷酸緩沖液在3℃溫度下透析過(guò)夜,之后調(diào)整濃度為1.25mol/L;使用0.03mol/L的pH為7.4的MES活化緩沖液洗滌微球,加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),終濃度為10mmol/L,室溫反應(yīng)15分鐘,充分洗滌稀土離子微球,用0.03mol/L的pH為7.4的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后加入透析后的sST2單克隆抗體I,使sST2單克隆抗體I與稀土離子微球的質(zhì)量比為2.5:50,室溫反應(yīng)2小時(shí),加入含有5.5%BSA的0.03mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液,室溫反應(yīng)30分鐘,洗滌稀土離子微球,用含有0.55%BSA,0.55%Tween-20,0.03mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液保存液復(fù)溶至原體積,使用定量噴膜儀以4μL/cm噴涂于結(jié)合墊3上,避光,在37℃烘干1小時(shí),加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例3
定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條的制備方法,包括如下步驟:
(1)在包被膜4的不同位置分別固定識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體,形成檢測(cè)線和質(zhì)控線;
(2)制備稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I,并噴涂在結(jié)合墊3上;
(3)在底板1上依次相互交錯(cuò)的黏貼上樣品墊2、結(jié)合墊3、包被膜4和吸水紙5,然后切割成寬度為0.5cm大小,裝入卡殼8。
步驟(1)中包被膜4的制備方法為:使用含有10%蔗糖的0.05mol/L的pH為7.6的磷酸鹽緩沖液,分別將識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體稀釋到2.0mg/mL的濃度,使用定量噴膜儀以2μL/cm的量將二者以1.0cm的間隔噴于包被膜4上,38℃烘干0.5h,加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
步驟(2)中稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I的制備方法為:將sST2單克隆抗體I用0.05mol/L的pH為7.6的磷酸緩沖液在4℃溫度下透析過(guò)夜,之后調(diào)整濃度為1.5mol/L;使用0.05mol/L的pH為7.6的MES活化緩沖液洗滌微球,加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),終濃度為10mmol/L,室溫反應(yīng)20分鐘,充分洗滌稀土離子微球,用0.05mol/L的pH為7.6的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后加入透析后的sST2單克隆抗體I,使sST2單克隆抗體I與稀土離子微球的質(zhì)量比為4:50,室溫反應(yīng)2.5小時(shí),加入含有10%BSA的0.05mol/L的pH7.6的磷酸鹽緩沖液,室溫反應(yīng)35分鐘,洗滌稀土離子微球,用含有1%BSA,0.1%Tween-20,0.05mol/L的pH7.6的磷酸鹽緩沖液保存液復(fù)溶至原體積,使用定量噴膜儀以5μL/cm噴涂于結(jié)合墊3上,避光,在38℃烘干0.5小時(shí),加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例4
定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條的制備方法,包括如下步驟:
(1)在包被膜4的不同位置分別固定識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體,形成檢測(cè)線和質(zhì)控線;
(2)制備稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I,并噴涂在結(jié)合墊3上;
(3)在底板1上依次相互交錯(cuò)的黏貼上樣品墊2、結(jié)合墊3、包被膜4和吸水紙5,然后切割成寬度為0.5cm大小,裝入卡殼8。
步驟(1)中包被膜4的制備方法為:使用含有5.5%蔗糖的0.03mol/L的pH為7.6的磷酸鹽緩沖液,分別將識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體稀釋到1.25mg/mL的濃度,使用定量噴膜儀以1.5μL/cm的量將二者以0.75cm的間隔噴于包被膜4上,37℃烘干1.25h,加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
步驟(2)中稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I的制備方法為:將sST2單克隆抗體I用0.03mol/L的pH為7.6的磷酸緩沖液在3℃溫度下透析過(guò)夜,之后調(diào)整濃度為1.25mol/L;使用0.03mol/L的pH為7.6的MES活化緩沖液洗滌微球,加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),終濃度為10mmol/L,室溫反應(yīng)15分鐘,充分洗滌稀土離子微球,用0.03mol/L的pH為7.6的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后加入透析后的sST2單克隆抗體I,使sST2單克隆抗體I與稀土離子微球的質(zhì)量比為2.5:50,室溫反應(yīng)2小時(shí),加入含有5.5%BSA的0.03mol/L的pH7.6的磷酸鹽緩沖液,室溫反應(yīng)30分鐘,洗滌稀土離子微球,用含有0.55%BSA,0.55%Tween-20,0.03mol/L的pH7.6的磷酸鹽緩沖液保存液復(fù)溶至原體積,使用定量噴膜儀以4μL/cm噴涂于結(jié)合墊3上,避光,在37℃烘干1小時(shí),加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例5
定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條的制備方法,包括如下步驟:
(1)在包被膜4的不同位置分別固定識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體,形成檢測(cè)線和質(zhì)控線;
(2)制備稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I,并噴涂在結(jié)合墊3上;
(3)在底板1上依次相互交錯(cuò)的黏貼上樣品墊2、結(jié)合墊3、包被膜4和吸水紙5,然后切割成寬度為0.5cm大小,裝入卡殼8。
步驟(1)中包被膜4的制備方法為:使用含有7.5%蔗糖的0.02mol/L的pH為7.4的磷酸鹽緩沖液,分別將識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II和兔抗鼠IgG抗體稀釋到1.5mg/mL的濃度,使用定量噴膜儀以1.5μL/cm的量將二者以0.5cm的間隔噴于包被膜4上,37℃烘干1.25h,加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
步驟(2)中稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I的制備方法為:將sST2單克隆抗體I用0.03mol/L的pH為7.4的磷酸緩沖液在3℃溫度下透析過(guò)夜,之后調(diào)整濃度為1.3mol/L;使用0.04mol/L的pH為7.4的MES活化緩沖液洗滌微球,加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS),終濃度為10mmol/L,室溫反應(yīng)15分鐘,充分洗滌稀土離子微球,用0.04mol/L的pH為7.4的磷酸鹽緩沖液復(fù)溶后加入透析后的sST2單克隆抗體I,使sST2單克隆抗體I與稀土離子微球的質(zhì)量比為3:50,室溫反應(yīng)2小時(shí),加入含有7.5%BSA的0.04mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液,室溫反應(yīng)30分鐘,洗滌稀土離子微球,用含有0.5%BSA,0.5%Tween-20,0.02mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液保存液復(fù)溶至原體積,使用定量噴膜儀以4μL/cm噴涂于結(jié)合墊3上,避光,在37℃烘干1小時(shí),加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明的使用方法:使用本發(fā)明提供的定量檢測(cè)sST2的時(shí)間分辨熒光免疫分析試紙條,在樣品墊2上加入樣品液,在毛細(xì)作用下,樣品液向吸水紙5一端泳動(dòng),至結(jié)合墊3時(shí),如果待測(cè)樣本中含有sST2時(shí),樣品液中的sST2與結(jié)合墊3上的稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I形成抗原-抗體復(fù)合物,隨著層析作用,抗原-抗體復(fù)合物向前移動(dòng),到達(dá)包被膜4的檢測(cè)線6處時(shí),抗原-抗體復(fù)合物與檢測(cè)線6上的能夠識(shí)別不同抗原表位的sST2單克隆抗體II形成抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物,聚集在檢測(cè)線6處,而未結(jié)合sST2單克隆抗體II的稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I繼續(xù)前行,到達(dá)質(zhì)控線時(shí),兔抗鼠IgG抗體與稀土離子微球標(biāo)記的的鼠源性sST2單克隆抗體I結(jié)合,在C線處出現(xiàn)稀土離子微球的聚集。整個(gè)反應(yīng)在10-15分鐘內(nèi)完成,并進(jìn)行上機(jī)讀卡。檢測(cè)線6和質(zhì)控線7都會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的熒光信號(hào),熒光檢測(cè)儀會(huì)根據(jù)定標(biāo)卡上的信息將實(shí)際檢測(cè)值帶入預(yù)設(shè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出定量的結(jié)果;樣品液中不含有sST2時(shí),則只在質(zhì)控線處產(chǎn)生熒光信號(hào)。
如果待測(cè)標(biāo)本中不含有sST2時(shí),樣品液隨著層析作用向前移動(dòng),到達(dá)結(jié)合墊3時(shí),樣品液帶動(dòng)結(jié)合墊3上的稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I向前繼續(xù)移動(dòng),經(jīng)過(guò)包被膜4上的檢測(cè)線6時(shí),沒有形成抗體-抗原-抗體夾心復(fù)合物,檢測(cè)線6處不出現(xiàn)熒光;含有稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I的樣品液繼續(xù)前行,到達(dá)質(zhì)控線7時(shí),質(zhì)控線7處的兔抗鼠IgG抗體與稀土離子微球標(biāo)記的sST2單克隆抗體I結(jié)合,在質(zhì)控線7處會(huì)出現(xiàn)稀土離子微球的聚集并產(chǎn)生相應(yīng)的熒光。
試紙條使用時(shí),待測(cè)標(biāo)本中不含有sST2,只會(huì)在質(zhì)控線7處出現(xiàn)熒光;待測(cè)標(biāo)本中含有sST2,則檢測(cè)線6和質(zhì)控線7處均會(huì)出現(xiàn)熒光。因此,當(dāng)質(zhì)控線7處未出現(xiàn)熒光,即使檢測(cè)線6處出現(xiàn)熒光,也判定檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。
盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例,可以理解的是,上述實(shí)施例是示例性的,不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。