本發(fā)明涉及醫(yī)學生物技術與分子診斷領域，具體地，涉及一種實時監(jiān)測蒽環(huán)類化療藥血藥濃度的時間分辨免疫檢測試劑盒。
背景技術：
：蒽環(huán)類藥物(Anthracyclines)是一類常用的廣譜抗腫瘤藥物，主要包括多柔比星、表柔比星、吡柔比星、柔紅霉素和米托蒽醌等，廣泛地用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實體瘤，其中，多柔比星和表柔比星是乳腺癌輔助化療方案的首選藥物。但由于蒽環(huán)類藥物普遍存在心肌毒性和腎毒性，初次使用蒽環(huán)類藥物即可造成心臟損傷，隨著藥物累積劑量的增加毒性更明顯且不可逆，嚴重的毒副作用和心肌毒性使其用藥受限。為了更好發(fā)揮蒽環(huán)類藥物的抗腫瘤作用，盡可能避免此藥物不良反應對機體的損害，因此早期監(jiān)測蒽環(huán)類藥物引起的心臟毒性并及早干預顯得尤為重要。另外，大多數(shù)抗腫瘤藥物具有治療指數(shù)低、毒性大的特點，體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄過程存在廣泛的差異；腫瘤病人中肝、腎損害常見，即使給予相同劑量的抗癌藥物，血藥濃度可相3～10倍；同時抗腫瘤藥物作用存在滯后性。大多數(shù)藥物的療效與該藥到作用部位的濃度或相關受體濃度密切相關，而藥物在受體部位的濃度直接與血藥濃度有關，兩者呈現(xiàn)平行關系，因此，血藥濃度的測定可作為間接衡量藥物在作用部位或受體濃度的指標。而且，等同體重給藥(mg/kg)或體表面積給藥(mg/m2)下的穩(wěn)態(tài)血藥濃度在個體間存在顯著差異，僅僅根據(jù)體表面積給藥，大部分患者未能達到最優(yōu)的藥物暴露量。而基于的藥物劑量選擇，將穩(wěn)態(tài)血藥濃度維持在一定水平，能夠使患者在療效和毒性之間獲得最佳平衡。因此，需要建立一套簡便即時的血藥監(jiān)測方法來控制有效藥物濃度。目前，蒽環(huán)類化療藥血藥監(jiān)測手段主要有紫外-高效液相色譜檢測(UV-HPLC)、高效液相色譜法(HPLC)、和液質(zhì)聯(lián)用色譜(LC-MS/MS)以及利用蒽環(huán)結(jié)構(gòu)自身熒光半定量的紫外分光光度法。色譜質(zhì)譜定量所需血清樣本量大，且檢測前須對樣本前處理，操作復雜繁瑣，檢測時間長，不符合即時監(jiān)測及難以推廣其應用。紫外分光光度法同樣樣品需求量大、靈敏度低、抗干擾能力差、專屬性差，臨床普及意義不大，已逐漸被淘汰。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種實時監(jiān)測蒽環(huán)類化療藥血藥濃度的時間分辨免疫檢測試劑盒。本發(fā)明需要對試劑盒所使用的原料進行制備與篩選，從而確定最佳原料，這一過程包括人工抗原的合成及偶聯(lián)比的確定，多克隆抗體的制備，標記物和抗體的比例，包被抗體的濃度，標記物的稀釋度，包被板的吸附性能和變異大小等。通過反復摸索和比對，確定了小分子人工抗原標記和純化的最佳條件。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的。一種蒽環(huán)類化療藥血藥濃度的時間分辨熒光檢測試劑盒，包括校準品、校準品稀釋液、銪標DOX-OVA抗原、抗DOX/EPI多抗、洗滌液、增強液、分析緩沖液、羊抗鼠IgG包被反應板。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用DOX作為統(tǒng)一檢測蒽環(huán)類化療藥的半抗原，能夠?qū)⒋蠖鄶?shù)的蒽環(huán)類化療藥都能檢測出來，而如果用其他的蒽環(huán)類化療藥作為統(tǒng)一檢測蒽環(huán)類化療藥的半抗原的話，能檢出的蒽環(huán)類化療藥種類比較少，不具有普遍適用性。優(yōu)選地，所述銪標DOX-OVA中DOX-OVA與Eu3+標記物的質(zhì)量比為5:1，所述DOX-OVA中DOX與OVA的偶聯(lián)質(zhì)量比為12:1。優(yōu)選地，所述抗DOX/EPI多抗制備使用的抗原為DOX-KLH，所述DOX-KLH中DOX與KLH偶聯(lián)摩爾比為1:5。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，上述校準品的制備步驟如下：用校準品稀釋液，將DOX校準品配制成0、10、50、100、1000及2000ng/mL系列濃度的校準溶液，按每瓶1mL分裝凍干，4℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，校準品稀釋液成分包括2mg/mlBSA及0.1％NaN3的50mM,pH7.8Tris-HCl緩沖液根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，包被反應板為按每孔0.5ug羊抗鼠IgG，100ul包被緩沖液加入96孔透明微孔板，并封閉凍干制備而成。其中封閉液成分為50mMTris-HCl，0.1％BSA、4％海藻糖、0.05％NaN3，pH7.2。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，多柔比星人工合成抗原的制備是通過DOX上的氨基與經(jīng)過EDC/NHS活化的載體蛋白(KLH/OVA)偶聯(lián)并純化得到，DOX與OVA的最佳偶聯(lián)比為12:1。銪標記抗CEA抗體的制備步驟為：選用DOX-OVA作檢測抗原進行Eu3+標記，抗原與Eu3+標記物的比例為5:1(質(zhì)量比)為最佳比例。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，抗DOX/EPI多抗以DOX-KLH偶聯(lián)物作完全抗原免疫Balb/c小鼠制備得到，純化后抗DOX/EPI多抗用磷酸鹽緩沖液(0.1M,pH7.4)稀釋濃度為1mg/ml，每瓶100ul分裝，真空冷凍干燥。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，分析緩沖液配方為：Tris-HCl(50Mm,pH7.8)、PEG6000(1.5％)、BSA(0.2％)、Proclin300(0.1％)、牛IgG(0.02％)、Tween20(0.1％)和NaCl(0.84％)。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，洗滌液配方為：Tris-HCl(1.25mmol/L,pH7.8)、Tween20(2.5％)和NaCl(21％)。根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案，增強液配方由β2二酮體、三辛基氧化磷(TOPO)、Triton200、醋酸和鄰苯二甲酸氫鉀(pH2.0～3.2)組成。根據(jù)本發(fā)明所述的抗DOX/EPI鼠源多克隆抗體的制備步驟如下：(1)DOX-KLH完全抗原的制備:將5mg血藍蛋白(KLH)溶解于0.5ml磷酸鹽緩沖液中(pH7.2,0.1M),分別配制10mg/mlEDC和NHS溶液，往KLH溶液中加入10ulEDC溶液和6.7ulNHS溶液，室溫條件下活化30min。配制2mg/mlDOX水溶液，取1mg的DOX加入活化的KLH中，37℃避光反應過夜。反應后，用磷酸鹽緩沖液(pH7.2,0.1M)透析24小時?？乖?mg分裝凍干，-20℃貯存。DOX-OVA完全抗原的制備同上。(2)小鼠免疫:將DOX-KLH完全抗原，用1ml純水溶解，免疫方式采用皮下多點注射免疫，每只Balb/c小鼠接種劑量為50μg，三周后同樣用1ml純水溶解DOX-KLH完全抗原凍干粉，對小鼠皮下多點注射，每只小鼠接種劑量為50μg，加強免疫2次。(3)血清效價測定：取小鼠尾靜脈血，9000rpm，離心10min，將上清轉(zhuǎn)入新的EP管中，對小鼠血清的效價測定采用時間分辨熒光免疫分析法，將DOX-OVA抗原溶于包被液中，配成5ug/ml包被液，每孔加入100μl，37℃振蕩孵育1小時。棄液，拍干，加入封閉液，每孔200μl，4℃封閉過夜。次日，棄液，拍干。往包被好的反應孔內(nèi)加入倍比稀釋好的小鼠血清100μl/孔，并設陽性對照、陰性對照和空白對照，37℃孵育2小時。用洗滌液洗4次，加入用分析緩沖液以1:10000倍稀釋銪標羊抗鼠IgG，100μl/孔，置37℃孵育1小時。用洗滌液洗6次，加入增強液，200μl/孔，37℃孵育5min，測值。(4)血清效價高于1/10000時，收集小鼠血清，分裝，-20℃貯存。根據(jù)本發(fā)明所述的銪標記DOX-OVA合成抗原的制備步驟如下：(1)抗原純化和濃縮：1mgDOX-OVA合成抗原，用市售的帶有濾膜的G-10離心管9000rpm離心5min，棄濾液，并加入200ul標記緩沖液(50mmol/L,Na2CO3,pH9.0)重復洗滌6次，倒轉(zhuǎn)G-10離心管，1500rpm離心2min收集抗原。(2)抗原標記：往純化好的DOX-OVA抗原中加入0.2mgEu3+標記試劑，充分混勻，25℃振蕩過夜。(3)上樣與洗脫：用SephadexG-50層析柱(1×30cm)分離純化,洗脫液(含0.9％NaCl的50mmol/LTris-HCl)洗脫，同時收集流出液(1ml/管)，逐管測量吸光度(A280),合并峰管，測蛋白含量并計算標記率。(4)確定稀釋度：并管后的銪標記物，進行稀釋度摸索，選擇線性較好，靈敏度較好的稀釋度；優(yōu)選稀釋度為1/200，以此為基準稀釋并管后的標記物。(5)分裝標記物：分裝體積為1.0ml/瓶，真空冷凍干燥。(6)保存：凍干后在2～8℃條件下保存。本發(fā)明的試劑盒的工作原理如下：羊抗鼠二抗包被的96孔微孔板，作為反應中的固相介質(zhì)，通過包被抗體捕獲鼠源抗多柔比星多克隆抗體，通過競爭的反應模式，銪標記的多柔比星人工抗原與多柔比星校準品競爭結(jié)合抗蒽環(huán)類藥物的鼠源多抗，洗滌后，加入增強液解離銪原子增大熒光信號，用時間分辨熒光檢測儀測值。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的試劑盒是以血清樣本作為檢測樣本，以多柔比星與KLH完全抗原進行免疫，自制針對蒽環(huán)結(jié)構(gòu)特異性多克隆抗體，能識別互為同分異構(gòu)體的DOX和EPI，而在化療用藥組合中蒽環(huán)類藥物是單一選擇配伍其他類型化療藥物，且蒽環(huán)類藥物屬于外源性物質(zhì)，體內(nèi)物質(zhì)對其檢測的影響小。因此，本試劑盒可分別測定蒽環(huán)類藥物中代表藥物DOX和EPI的血藥濃度。利用本發(fā)明的試劑盒進行檢測，具有靈敏度高、特異性強、操作簡便、檢測范圍寬、無放射性污染等特點，適合用于臨床蒽環(huán)類藥物血藥監(jiān)測，指導臨床用藥。附圖說明圖1為多柔比星與表柔比星結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本試劑盒多柔比星的劑量反應曲線(雙對數(shù)擬合)。圖3為本發(fā)明的試劑盒與液質(zhì)聯(lián)用色譜方法(LC-MS/MS)測定臨床樣本多柔比星測值的相關性分析(回歸分析)。具體實施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實施例1一種實時監(jiān)測蒽環(huán)類化療藥血藥濃度的時間分辨免疫檢測試劑盒，試劑盒的組成為：(1)校準品1套，分別編號A-F；(2)銪標抗原1瓶，為凍干品；(3)抗DOX/EPI鼠源多克隆抗體1瓶，為凍干品，(4)洗滌液1瓶，50ml，(5)增強液1瓶，50ml，(6)分析緩沖液1瓶，50ml，(7)羊抗鼠IgG包被的反應板1塊，96孔/塊，(8)封片3片，(9)說明書1份。其中，抗DOX/EPI鼠源多克隆抗體的制備步驟如下：DOX-KLH完全抗原的制備：將5mg血藍蛋白(KLH)溶解于0.5ml磷酸鹽緩沖液中(pH7.2,0.1M)，分別配制10mg/ml的EDC和NHS溶液，往KLH溶液中加入10ulEDC溶液和6.7ulNHS溶液，室溫條件下活化30min。配制2mg/mlDOX水溶液，取1mg的DOX加入活化的KLH中，37℃避光反應過夜。反應后，用磷酸鹽緩沖液(pH7.2,0.1M)透析24小時?？乖?mg分裝凍干，-20℃貯存。小鼠免疫：將DOX-KLH完全抗原，用1ml純水溶解，免疫方式采用皮下多點注射免疫，每只Balb/c小鼠接種劑量為50μg，三周后同樣用1ml純水溶解DOX-KLH完全抗原凍干粉，對小鼠皮下多點注射，每只小鼠接種劑量為50μg，加強免疫2次。血清效價測定：取小鼠尾靜脈血，9000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)入新的EP管中，對小鼠血清的效價測定采用時間分辨熒光免疫分析法，將DOX-OVA抗原溶于包被液中，配成5ug/ml包被液，每孔加入100μl，37℃振蕩孵育1小時。棄液，拍干，加入封閉液，每孔200μl，4℃封閉過夜。次日，棄液，拍干。往包被好的反應孔內(nèi)加入倍比稀釋好的小鼠血清100μl/孔，并設陽性對照、陰性對照和空白對照，37℃孵育2小時。用洗滌液洗4次，加入用分析緩沖液以1:10000倍稀釋的銪標羊抗鼠IgG，100μl/孔，置37℃孵育1小時。用洗滌液洗6次，加入增強液，200μl/孔，37℃孵育5min，測值。血清效價高于1/10000時，收集小鼠血清，分裝，-20℃貯存。DOX-OVA抗原的制備：將5mg卵清白蛋白(OVA)溶解于0.5ml磷酸鹽緩沖液中(pH7.2,0.1M)，分別配制10mg/ml的EDC和NHS溶液，往OVA溶液中加入10ulEDC溶液和6.7ulNHS溶液，室溫條件下活化30min。配制2mg/mlDOX水溶液，取1mg的DOX加入活化的OVA中，37℃避光反應過夜。反應后，用磷酸鹽緩沖液(pH7.2,0.1M)透析24小時?？乖?mg分裝凍干，-20℃貯存。銪標記DOX-OVA抗原的制備步驟如下：(1)抗原純化和濃縮：1mgDOX-OVA合成抗原，用市售的帶有濾膜的G-10離心管9000rpm離心5min，棄濾液，并加入200ul標記緩沖液(50mmol/L,Na2CO3,pH9.0)重復洗滌6次，倒轉(zhuǎn)G-10離心管，1500rpm離心2min收集抗原。(2)抗原標記：往純化好的DOX-OVA抗原中加入0.2mg的Eu3+標記試劑，充分混勻，25℃振蕩過夜。(3)上樣與洗脫：用SephadexG-50層析柱(1×30cm)分離純化,洗脫液(含0.9％NaCl的50mmol/LTris-HCl)洗脫，同時收集流出液(1ml/管)，逐管測量吸光度(A280),合并峰管，測蛋白含量并計算標記率。(4)確定稀釋度：并管后的銪標記物，進行稀釋度摸索，選擇線性較好，靈敏度較好的稀釋度；優(yōu)選稀釋度為1/200，以此為基準稀釋并管后的標記物。(5)分裝標記物：分裝體積為1.0ml/瓶，真空冷凍干燥。(6)保存：凍干后在2-8℃條件下保存。試劑盒的使用方法如下：樣本收集：采靜脈血1～2ml于凝血管中，4℃放置2小時以上，待血清析出后取25ml血清即可。血清樣品在2～8℃可以保存7天，如果需要長期保存，請在-20℃保存，避免反復凍融。樣品需要在含干冰的保溫瓶或其它裝置條件下運輸。試劑的準備：洗滌液：將50ml的25×洗滌液和1200ml去離子水混合，作為工作洗滌液。銪標抗原工作液：使用前一小時將每瓶銪標抗原用1ml無菌去離子水溶解，用分析緩沖液按1:25倍稀釋作為銪標工作液。抗體工作液：抗DOX/EPI多抗凍干品，用100ul去離子水重溶，按測試用量以分析緩沖液1/2000稀釋，作為抗體工作液。校準品使用前用1ml去離子水溶解，4℃保存。具體操作步驟如下：(1)首先將包被反應板置室溫平衡(23～28℃，30min)，然后往反應孔中每孔加入100ul抗體工作液，室溫振蕩孵育1小時。(2)洗滌液洗4次，拍干。(3)依次分別加入校準品A-F，制定標準曲線，每孔50ul，然后每孔加入銪標抗原工作液50ul，37℃振蕩孵育1小時。(4)洗滌液洗6次，拍干(5)每孔加入200ul增強液，37℃振蕩孵育5分鐘(6)使用時間分辨免疫熒光檢測儀，在激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長613nm是測定銪的熒光值。分別以校準品中DOX濃度的Log值為橫坐標，測定的熒光值扣除本底后的Log值為縱坐標，繪制DOX/EPI的劑量-反應曲線，得出標準方程，帶入測值計算出血樣中DOX/EPI的具體濃度。實施例2按照本領域中常規(guī)的制造和檢定規(guī)程對通過上述制備的試劑盒進行檢定，結(jié)果如下：分析靈敏度和線性范圍：以零參考標準品當作樣品測量10次，計算其熒光值及標準差。以該點熒光測定平均值減去2倍標準差所得的熒光值代入標準方程計算得出的濃度值為其分析靈敏度，經(jīng)測定本試劑分析靈敏度為3.8ng/ml。將抗原稀釋成不同濃度進行測定，測得標準曲線線性范圍為3.8～2000ng/ml。精密度(CV％)：用本發(fā)明的試劑盒對自制DOX質(zhì)控品(質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，預期濃度分別為10、100、1000ng/ml)進行測定，各設10個復孔。結(jié)果本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)(CV％)為3.5％～6.5％和批間變異系數(shù)(CV％)為5.4％～8.8％。表1批內(nèi)精密度測試結(jié)果(n＝10)表2批間精密度測試結(jié)果(三批，n＝3*10)測定值DOX(ng/mL)CV％質(zhì)控品I9.89±0.616.1質(zhì)控品II102.62±5.625.4質(zhì)控品III989.47±87.208.8穩(wěn)定性實驗：取一批本發(fā)明的試劑盒，分別在37℃條件下放置7天或者在4℃條件下放置三個月，觀察各階段試劑的物理外觀，鑒定保存期間標準品活性變化，評價其最低檢測量、準確度、線性、精密度指標。測定結(jié)果表明，各項指標均符合質(zhì)量標準，試劑盒穩(wěn)定可靠。實施例3本發(fā)明的試劑盒與液質(zhì)聯(lián)用色譜法(LC-MS/MS)臨床血樣測值比較用本發(fā)明的試劑盒和液質(zhì)聯(lián)用色譜法(LC-MS/MS)同時對220份血清樣本進行檢測。以本發(fā)明方法測定血樣的DOX濃度結(jié)果為橫坐標，以LC-MS/MS法測定的DOX濃度結(jié)果為縱坐標做回歸分析，相關方程為：Y＝2.606+0.986X，相關系數(shù)r＝0.996(圖3)。經(jīng)統(tǒng)計學處理結(jié)果表明，本發(fā)明方法與LC-MS/MS法臨床血樣測值均具有顯著相關性。當前第1頁1 2 3