專利名稱：促黃體生成素時(shí)間分辨免疫熒光分析法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促黃體生成素(LH)定量檢測試劑盒，屬于時(shí)間分辨免疫熒光 分析法檢測領(lǐng)域。
技術(shù)背景-
促黃體生成素(Luteinizing Hormone, LH)是一種由垂體前葉分泌的糖蛋 白，由兩條多肽鏈通過非共價(jià)鍵結(jié)合而成。LH的分泌主要受下丘腦GnRH的調(diào) 節(jié)，同時(shí)還受月經(jīng)周期的影響。其生理作用主要是促進(jìn)女性排卵和黃體生成，以 促進(jìn)黃體分泌雌激素和孕激素。在男性主要是促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生，促進(jìn)睪酮 的合成和分泌。
目前血清LH檢測主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、免疫放射法(IRMA)。由于 受示蹤劑性狀的限制，ELISA的靈敏度不高，檢測范圍有限，IRMA試劑盒受同位 素半衰期的影響，有效期短，此外還有一定的放射性污染。
時(shí)間分辨免疫熒光分析(time-resolved fluoroi隱noassay, TRFIA)利用 具有獨(dú)特?zé)晒馓匦缘蔫|系元素，代替酶、同位素等，做為發(fā)光免疫分析中的一種 重要方法，具有靈敏度高、示蹤物穩(wěn)定、不受樣品自然熒光干擾、無放射性污染 等許多優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于LH檢測的時(shí)間分辨免疫熒光分析法及試劑盒， 主要解決現(xiàn)有技術(shù)存在的靈敏度低、穩(wěn)定性差、操作煩瑣及污染環(huán)境等技術(shù)問題。 本發(fā)明采用銪標(biāo)記技術(shù)，提供銪標(biāo)記試劑盒，以提高方法的靈敏度及穩(wěn)定性。
本發(fā)明的技術(shù)方案是在進(jìn)行時(shí)間分辨免疫熒光分析檢測法前需完成下列準(zhǔn) 備工作-
首先制備包被板，所用的包被板為特異性抗體包被的板，LH包被板條的制備 包括以下步驟-
(1)將純化的LH單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液稀釋，然后加入包被板條各孔內(nèi)， 經(jīng)吸附、洗滌、封閉、干燥后獲得LH單克隆抗體包被板條；
3(2)將LH單克隆抗體包被板條裝入專用的鋁箔包裝袋，封口并冷藏備用。 其次是LH銪標(biāo)記的制備，包括以下步驟
(1) 取待標(biāo)記抗體加入透析袋中，放入配制好的ra9.5的碳酸鹽緩沖液中，室
溫透析過夜(其間多次換透析液)；
(2) 次日，取出抗體，稀釋至0.2-5/mL，按質(zhì)量比為2:1的比例(DTTA-Eu : 抗體)邊振蕩邊加入DTTA-Eu，室溫下在振板機(jī)上慢速振蕩1小時(shí)，然后在黑暗 中靜置48小時(shí)；
(3) 標(biāo)記好的抗體與游離DTTA-Eu通過S印hadex G50 (8cm) +3印[^『036 6B (38cm) 色譜柱(1.5X50cm)分離，分離過程用核酸蛋白儀監(jiān)控；
(4) 用小試管依次分段接受流出物，用分光光度計(jì)，在280nni處測吸光度，同 時(shí)測熒光強(qiáng)度，計(jì)算出Eu標(biāo)抗體濃度；
(5) 用0.2um的過濾器過濾；
(6) 加入O. 3。/。優(yōu)級(jí)純BSA， 2-8。C保存。 促黃體生成素時(shí)間分辨免疫熒光分析法，包括下列步驟
① 固相抗體制備將抗促黃體生成素單克隆抗體用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至 l-10ug/mL作為包被液，包被反應(yīng)板，并用封閉液封閉；
② 鑭系元素離子標(biāo)記抗體制備選用配對(duì)抗促黃體生成素單克隆抗體用常規(guī)方法 進(jìn)行鑭系元素離子標(biāo)記；
③ 在步驟①制得的具有固相抗體的反應(yīng)板上，每孔加入促黃體生成素標(biāo)準(zhǔn)品或待 測樣品，以及用反應(yīng)緩沖液稀釋的標(biāo)記抗體進(jìn)行孵育，最后進(jìn)行熒光測定。 步驟①中包被液中單克隆抗體的濃度為l一10ug/mL，步驟②中標(biāo)記抗體用反應(yīng) 緩沖液以體積比為1 : 20稀釋。步驟②中的鑭系元素離子優(yōu)選為Eu:i+。步驟③中 的反應(yīng)緩沖液為PH 7. 8的50畫1/L Tris-HC1,內(nèi)含0. 9% NaCl， 1% BSA, 0. 05% 牛IgG' 20uM DTPA， 0. 08% Tween20和0. l%NaN3;且該步驟③在時(shí)間分辨熒光免 疫分析儀器上自動(dòng)完成。所用增強(qiáng)液為熒光增強(qiáng)液。
促黃體生成素定量檢測試劑盒，其特征是試劑盒包括:包被抗體的緩沖液、 封閉液、反應(yīng)緩沖液、洗液、增強(qiáng)液，以及作為包被抗體的抗促黃體生成素單克 隆抗體，鑭系元素離子標(biāo)記的抗促黃體生成素單克隆抗體和促黃體生成素標(biāo)準(zhǔn)所述LH標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法為先分別將LH凍干抗原溶解并稀釋至所需的 最高濃度，再采用倍比稀釋法稀釋至所需濃度，獲得LH標(biāo)準(zhǔn)品。
標(biāo)準(zhǔn)品為用含6% BSA， 4%糖，0. 1%歸,，50mmol/L Tris-HCl緩沖液將促 黃體生成素蛋白配制成標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明使用雙抗體夾心法，反應(yīng)步驟包括試劑準(zhǔn)備、加樣反應(yīng)、洗滌拍 干、加增強(qiáng)液、測熒光值。
本發(fā)明的有益效果是分析靈敏度高(0.1mlU/mL)，檢測時(shí)間短(80min)， 特異性好，與干擾物質(zhì)的交叉反應(yīng)小。


圖1為本發(fā)明的反應(yīng)原理圖
本發(fā)明采用雙抗體夾心二步法?？谷薒H單抗包被于96孔熒免板，校準(zhǔn)品或樣 品中的LH與包被單抗于微孔內(nèi)表面發(fā)生免疫反應(yīng)；洗滌后，加入銪離子(Ei^+) 標(biāo)記的抗LH單抗，免疫反應(yīng)后，微孔表面的夾心免疫復(fù)合物與游離標(biāo)記單抗通 過洗滌分離。微孔表面免疫復(fù)合物中的Eu"被熒光增強(qiáng)液解離后形成穩(wěn)定的熒光 配合物，熒光強(qiáng)度與校準(zhǔn)品或樣品中的LH濃度呈正比例，通過劑量一反應(yīng)曲線 可得出樣品中LH濃度。
圖2為本發(fā)明操作流程圖
第一步復(fù)融校準(zhǔn)品，第二步稀釋銪標(biāo)記物，第三步加入校準(zhǔn)品和待 測樣品，第四步加入稀釋后的銪標(biāo)記，第五步孵育，第六步洗板，第七步 加入稀釋后銪標(biāo)記物，第八步孵育，第九步洗板，第十步加入增強(qiáng)液，第 十一步檢測。
具體實(shí)施例方式
下面參照?qǐng)D1、 2通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。 實(shí)施例促黃體生成素(LH)測定
1、 標(biāo)準(zhǔn)品配制
用含6% BSA， 4%糖，0. 1% NaN3， 50國ol/L Tris-HCl緩沖液將LH蛋白配制 成0、 3、 10、 30、 100、 300mIU/mL標(biāo)準(zhǔn)液，以國家LH標(biāo)準(zhǔn)品校正。分裝，于
+2 +8°(:保存。
2、 操作步驟
1)試劑的準(zhǔn)備
5a) 洗滌液將40mL濃縮洗液和960mL去離子水在干凈的洗液瓶中混合，作 為工作洗滌液備用。
b) 銪標(biāo)記使用前一小時(shí)內(nèi)，用分析緩沖液按l :20稀釋銪標(biāo)記物。
c) 將試劑盒分析緩沖液、待測樣品、校準(zhǔn)品和和所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條平 衡至室溫(20 25°C)。
2) 吸取25ul的校準(zhǔn)品或樣品，按順序加入相應(yīng)微孔底部。
3) 在各微孔內(nèi)加入100y 1已稀釋的銪標(biāo)記溶液，室溫下于慢檔振動(dòng)60分鐘。
4) 洗板6次，將板條在潔凈的吸水紙上拍干。
5) 在每個(gè)微孔內(nèi)加入200iU的增強(qiáng)液，室溫下于慢檔振動(dòng)5分鐘。
6) 用時(shí)間分辨熒光測定儀檢測。 促黃體生成素(LH)測定流程見表1
表l促黃體生成素(LH)測定流程
復(fù)融校準(zhǔn)品0. 5ml去離子水，至少20分鐘稀釋銪標(biāo)記物(見表格)條銪標(biāo)記物(u 1)分析緩沖液(ml)
-11503
23006
34509
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加入校準(zhǔn)品和待測樣品25 u 1加入分析緩沖溶液100 u 1孵育常溫下于慢檔振動(dòng)60分鐘洗板洗板4次加入稀釋后的銪標(biāo)記150 u 1孵育常溫下于慢檔振動(dòng)15分鐘洗板洗板6次加入增強(qiáng)液200 于慢檔振動(dòng)5分鐘檢測LH kit3、特異性見表2
表2 LH TRIFMA與FSH、 HCG、 TSH的交叉反應(yīng)
交叉反應(yīng)物質(zhì)濃度表觀LH濃度
人促卵泡成熟激素(FSH， Fitzgrald)270mIU/mL0.1 mlU/mL
人絨毛膜促性腺激素(HCG)22800mIU/mL1.5 mlU/mL
促甲狀腺激素(TSH， Biodesign)130mIU/L0.2 mlU/mL
表觀LH濃度為上表所示濃度的交叉反應(yīng)物質(zhì)用本試劑檢測所得到的LH濃度。
權(quán)利要求
1、促黃體生成素時(shí)間分辨免疫熒光分析法，其特征是包括下列步驟①固相抗體制備將抗促黃體生成素單克隆抗體用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至1-10ug/mL作為包被液，包被反應(yīng)板，并用封閉液封閉；②鑭系元素離子標(biāo)記抗體制備選用配對(duì)抗促黃體生成素單克隆抗體用常規(guī)方法進(jìn)行鑭系元素離子標(biāo)記；③在步驟①制得的具有固相抗體的反應(yīng)板上，每孔加入促黃體生成素標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，以及用反應(yīng)緩沖液稀釋的標(biāo)記抗體進(jìn)行孵育，最后進(jìn)行熒光測定。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述促黃體生成素時(shí)間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟 ②中標(biāo)記抗體用反應(yīng)緩沖液以體積比為1 : 20稀釋。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述促黃體生成素時(shí)間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟② 中的鑭系元素離子為EiT'+。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述促黃體生成素時(shí)間分辨免疫熒光分析法，其特征是步驟③ 中的反應(yīng)緩沖液為PH7. 8的50隱ol/LTris-HC1,內(nèi)含O. 9%NaCl， 1%BSA， 0. 05%牛IgG， 200uM DTPA， 0. 08% Tween20和0. l%NaN:i;且該歩驟③在時(shí)間 分辨熒光免疫分析儀器上自動(dòng)完成。
5、 促黃體生成素定量檢測試劑盒，其特征是試劑盒包括:包被抗體的緩沖液、封 閉液、反應(yīng)緩沖液、洗液、增強(qiáng)液，以及作為包被抗體的抗促黃體生成素單 克隆抗體，鑭系元素離子標(biāo)記的抗促黃體生成素單克隆抗體和促黃體生成素 標(biāo)準(zhǔn)品。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的促黃體生成素定量檢測試劑盒，其特征是標(biāo)準(zhǔn)品為用 含6% BSA， 4%糖，0. 1% NaN:,， 50醒ol/L Tris-HCl緩沖液將促黃體生成素 蛋白配制成標(biāo)準(zhǔn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了促黃體生成素(LH)的時(shí)間分辨免疫熒光分析法及試劑盒，其選用抗LH單克隆抗體作為包被抗體，用碳酸鈉緩沖溶液稀釋至1-10ug/ml作為包被液；配對(duì)抗LH單克隆抗體用鑭系元素離子標(biāo)記作為標(biāo)記抗體；實(shí)驗(yàn)時(shí)用反應(yīng)緩沖液按1∶20稀釋使用；在包被抗體的反應(yīng)板上，每孔依次加入25ul的LH的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品、以及稀釋的標(biāo)記抗體，孵育后進(jìn)行熒光檢測。本發(fā)明還提供相應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明具有較高的靈敏度、特異性及穩(wěn)定性；且分析系統(tǒng)高度自動(dòng)化，可提高臨床檢驗(yàn)結(jié)果的速度，可大幅度降低人為誤差和增加檢出結(jié)果的可靠性。
文檔編號(hào)G01N33/74GK101614749SQ20081004355
公開日2009年12月30日 申請(qǐng)日期2008年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者吳馮波, 君 沈 申請(qǐng)人:上海新波生物技術(shù)有限公司