專利名稱:用于防治奶牛乳房炎的基因藥物的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一種疾病的基因治療藥物。
背景技術:
乳房炎是奶牛場危害最大、藥費最多、防治最難的疾病之一。特別是隱性乳房炎,在臨床上無明顯的癥狀表現(xiàn),需要用特殊的檢測方法根據(jù)乳汁的性狀變化才能變化。乳房炎對奶牛業(yè)的危害主要表現(xiàn)為以下幾點(1)感染率和發(fā)病率高,根據(jù)世界奶協(xié)統(tǒng)計,隱性奶牛乳房炎的發(fā)病率高達50%左右;(2)不僅降低奶產(chǎn)量(平均降低奶量10-15%),而且延長產(chǎn)后發(fā)情和妊娠時間;(3)降低牛奶的營養(yǎng)成份和品質,影響人體健康,因為病牛乳汁中含有大量的病原微生物及其毒素,食用后可引起發(fā)燒、嘔吐、腹瀉、脫水、過敏等;(4)增加醫(yī)藥費用,揚報道,每例乳腺炎平均需藥費23元,若久治不愈,導致奶牛淘汰,損失更大。
奶牛乳房炎的病因十分復雜,主要原因是病原微生物感染,誘發(fā)因素包括不規(guī)范的飼養(yǎng)管理、擠奶操作、惡劣環(huán)境和外傷等。引起奶牛乳腺炎的病原菌多達150多種,主要包括兩大類,一類是傳染性病原菌,如金色葡萄球菌、無乳鏈球菌等,約70%的乳房炎是由有這些革蘭氏陽性細菌引起;另一類是條件性病原菌,如大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、乳房鏈球菌等。上述兩類病原菌約占乳房炎病原菌的90%以上。
目前治療奶牛乳房炎的主要方法有抗菌素治療法、中藥治療法和疫苗免疫法。其中抗菌素治療是最為普遍的乳房炎治療方法,常用的藥物有青霉菌、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、土霉素、新霉素、環(huán)丙沙星以及黃胺類藥物等。由于這些藥物都具有一定的抗菌譜和乳房炎致病菌的種類復雜,通常需將這些藥物進行組合和超量使用,治療效果一般在50-90%不等。該療法的主要問題除治療效果不夠確實外,還包括治療后的牛奶中殘留大量抗菌素,根據(jù)國家衛(wèi)生標準抗菌素治療5天內的牛奶不能飲用;長期使用抗菌素容易導致耐藥菌株的出現(xiàn),不僅治療效果下降,而且對人類健康不利;多數(shù)抗菌素的半衰期不長,需反復用藥,治療成本較高。
隨著“無抗奶”運動的興起,中藥治療奶牛乳房炎顯示出較好的前景。目前獸醫(yī)臨床上使用較多的有乳炎康、乳炎消、乳炎必治、消炎醌和綠草素等,治療方法主要是乳池內注射,治療效果與抗菌素接近或稍低。中藥治療奶牛乳房炎雖然沒有抗菌素殘留和耐藥菌株等嚴重問題,但由于使用的中藥劑量較大(如每牛每天肌肉注射30~40毫升或每乳區(qū)注射400毫克),奶中殘留的高濃度中藥對牛奶的品質、品味、后加工、人體健康等都有待進一步研究。其次是治療成本較高,如乳炎康的治療成本為30~80元/頭。
疫苗免疫預防奶牛乳房炎的設想雖好,但實際效果不佳,目前尚處于研究階段。有人對國外進口的疫苗進行過試驗,結論是只有中等程序的防治效果。國內也有預防奶牛乳房炎的疫苗出售,據(jù)報道在6個月的試驗期內3次注射疫苗,免疫組(22%)的乳房炎發(fā)病率僅較對照組(41.38%)下降19.38%。由于奶牛乳房炎的致病菌種類復雜,加之乳腺的特殊生理結構和特點,研制安全有效的疫苗將是長期和艱巨的任務。
技術方案本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種價格適中、安全、有效、無有害殘留的用以防治奶牛乳房炎的基因藥物。
本發(fā)明為包括表達人溶菌酶基因構件的注射劑。
本發(fā)明的理論依據(jù)是人溶菌酶為人奶中正常的營養(yǎng)、抗菌和非特異免疫因子,對革蘭氏陽性菌具有直接的殺滅作用,在補體和抗體的參與下對革蘭氏陰性菌也有溶解作用,此外還有消炎和促進組織修復等作用,特別適合病原復雜的奶牛乳房炎的防治。發(fā)明的基因藥物能代替抗菌素使用,使奶牛隱性乳房炎得到有效預防和治療,臨床型乳房炎的發(fā)生率顯著降低,治療后的乳汁中不存在有害殘留,也不會產(chǎn)生抗藥菌株等問題。
上述基因構件的載體為真核細胞表達載體或山羊β-乳球蛋白基因控制的乳腺特異表達載體,前者適用于任何時期的防治,更適合于干奶期的預防;后者更適合于產(chǎn)奶期治療。
考慮到基因構件注射后不應對奶牛乳腺組織造成損害、進入乳汁后不影響飲用和降低治療成本,基因藥物的注射不使用商品化基因轉染脂質體,而是溶解于適當濃度的磷酸鹽溶液中,因此注射劑為人溶菌酶基因構件與磷酸鹽的混合溶液。
具體實施例基因藥物的制備1、先從細菌培養(yǎng)中提取和純化質粒DNA,其OD260/OD280比值達到1∶1.7以上,RNA、基因組DNA和類毒素等含量符合國家基因治療有關標準。
2、以人溶菌酶基因分別與真核細胞表達載體、山羊β-乳球蛋白基因控制的乳腺特異表達載體形成兩種不同的基因構件A和B。
3、分別將150~200微克基因構件A、B與2m1 0.15M磷酸鹽溶液均勻混合,制成基因注射劑C、D。
治療方案及治療效果1、分別對兩個表達人溶菌酶基因的基因構件的治療效果進行初步評估。將7個CMT試驗為+++以上的乳區(qū)分為2組,I組為4個乳區(qū),用注射劑C,即以真核細胞表達載體形成的表達人溶菌酶基因的基因構件(pTLYZ)治療,II組為3個乳區(qū),用注射劑D,即以山羊β-乳球蛋白基因控制的乳腺特異表達載體形成的表達人溶菌酶基因的基因構件(p205CLYZ3)治療,每乳池每天1次注射150微克基因構件,連續(xù)3天。治療后第10、20和45天時,兩組的治療有效率分別為4/4和3/3。
2、對基因治療、抗菌素和中藥治療的效果進行了對比,療效判定主要以CMT試驗為依據(jù)。其中,5個乳區(qū)為基因治療組,每乳區(qū)3次共注射450微克p205CLYZ3基因構件;4個乳區(qū)為抗菌素治療組,每乳區(qū)3次共300萬單位青霉素和75微克鏈霉素;3個乳區(qū)為中藥治療組,每乳區(qū)3次3次共注射45毫升乳炎消。在治療后第20天時,3個治療組的有效率分別為4/5、3/4和3/3。
3、擴大試驗,療效判定除CMT外,還對乳汁中的細菌總數(shù)和致病菌數(shù)進行了系統(tǒng)測定,并對治療前后的產(chǎn)奶量進行了統(tǒng)計比較。其中,基因治療組又分為乳池注射組(I組)和乳區(qū)基部注射組(II組),每乳區(qū)3次共注射450微克p205CLYZ3基因構件??咕刂委熃M每乳池3次共注射300萬單位青霉素和75微克鏈霉素;中藥治療組每乳池3次共注射45毫升乳炎消。以CMT試驗結果為判定依據(jù),在治療后第2天時,基因治療組的CMT結果變化不明顯,而抗菌素治療組和中藥治療組的CMT結果變化明顯。到治療后第6天時,基因治療I組和II組的有效率分別為8/8和6/6,治愈率分別為4/8和4/6;抗菌素治療組的有效率和治愈率均 為5/5,中藥治療組的有效率和治愈率分別為8/10和5/10。到治療后第10天時,基因治療I組和II組的有效率分別為6/10。上述各組治療后的細菌總數(shù)及致病菌數(shù)也呈明顯下降趨勢,并與CMT結果相一致。在治療期間(7天),乳池基因注射組、乳區(qū)基部基因注射組、抗菌素治療組和中藥治療組的日均奶產(chǎn)量分別較治療前(7天)增長了3.75、2.91、2.73和1.93公斤,治療后(7天)分別較治療前增長了1.51、2.79、2.79和0.33公斤。
經(jīng)過1個療程治療后,患病乳區(qū)的紅腫和乳汁凝乳塊等現(xiàn)象消失,不需進一步處理和治療。若以CMT結果為依據(jù)總結上述試驗結果,基因治療組、抗菌素治療組和中藥治療組的1療程有效率分別為86.4%、88.9%和69.2%,基因治療組和抗菌素治療組的有效率接近,并明顯高于中藥治療組。
4、在上述試驗所獲結果的基礎上,對基因治療的療程作進一步摸索,從而進一步提高隱性奶牛乳房炎的治愈率。對CMT試驗為陽性和弱陽性的奶牛進行治療試驗,一方面減少臨床型乳房炎的發(fā)生,另一方面提高奶牛的產(chǎn)奶量。在干奶期,對CMT陽性奶牛進行隱性乳房炎預防試驗。
1)采用對乳腺組織損傷較輕、容易被臨床獸醫(yī)掌握的乳池注射法,每天于擠奶后用5%碳酸氫鈉溶液清洗乳池,然后每乳池注射250微克基因構件,連續(xù)用藥2天為1個療程;以后每隔15天,進行第2和第3療程。除用CMT試驗外,還用體細胞直接計數(shù)法檢測乳汁中的體細胞數(shù),從而更加客觀地評價基因治療的實際效果,使治愈率達到80%以上。
2)在1)的基礎上,對CMT陽性和弱陽性的乳區(qū)進行較大規(guī)模的治療,除跟蹤檢測治療后的CMT指標外,重點統(tǒng)計治療后的產(chǎn)奶量變化和臨床及隱性乳房炎發(fā)生情況,使治療奶牛的日均奶產(chǎn)量增加2公斤,臨床及隱性乳房炎的發(fā)病率控制在10%以內。
3)選擇乳房炎高發(fā)奶牛群,在干奶期進行基因注射,注射途徑為乳腺基部注射,每次注射pTLYZ基因構件200微克,連續(xù)2天為1個療程。20天后進行第2個療程。然后在產(chǎn)奶期,以CMT試驗和直接體細胞計數(shù)為依據(jù),統(tǒng)計臨床型和隱性乳房炎的發(fā)生率,使其控制在10%以內。
權利要求
1.用于防治奶牛乳房炎的基因藥物,其特征在于,所述基因藥物為包括表達人溶菌酶基因構件的注射劑。
2.根據(jù)權利要求1所述藥物,其特征在于,所述基因構件的載體為真核細胞表達載體或山羊β-乳球蛋白基因控制的乳腺特異表達載體。
3.根據(jù)權利要求1所述藥物,其特征在于,所述注射劑中含有磷酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疾病的基因治療藥物,為包括表達人溶菌酶基因構件的注射劑,能安全、有效、無殘留地防治奶牛乳房炎,治療成本低。
文檔編號A61K31/7088GK1424044SQ0214854
公開日2003年6月18日 申請日期2002年12月11日 優(yōu)先權日2002年12月11日
發(fā)明者孫懷昌 申請人:揚州大學