本發(fā)明屬于中藥分析領(lǐng)域，尤其涉及一種拉薩大黃指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

背景技術(shù)：

中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，中藥指紋圖譜對于有效控制和評價中藥材或中成藥的質(zhì)量具有重要的意義。

拉薩大黃為蓼科植物拉薩大黃Rheum lhasaense A.J.Li et P.K.Hsiao的干燥根及根莖，收載于《西藏植物志》，具有瀉熱毒，破積滯，行瘀血等功效，用于治療食積腹脹，水火燙傷，口舌生瘡。野生拉薩大黃主產(chǎn)于我國產(chǎn)西藏中部偏東，海拔4200～4600米山坡草地。

現(xiàn)代研究表明，拉薩大黃含有豐富的二苯乙烯苷類化合物，曲札茋苷是其代表性成分和特征性成分(中國專利，授權(quán)公告號CN102659861B)。昆藥集團(tuán)股份有限公司研究證實，曲札茋苷具有抗氧化清除自由基、抗腫瘤、降血脂、抗動脈粥樣硬化、舒張血管等多方面的活性。因此，拉薩大黃有較高的開發(fā)利用價值和廣闊的應(yīng)用前景。

目前為止，針對拉薩大黃的質(zhì)量評價研究尚不充分，標(biāo)準(zhǔn)的缺失成為制約拉薩大黃產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題和瓶頸問題。安利貞等用超高效液相色譜法建立了拉薩大黃中虎杖苷、甲基虎杖苷、曲札茋苷的含量測定方法(安利貞等，超高效液相色譜法測定拉薩大黃中三種化學(xué)成分的含量，云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，36(1)：31-34.)，但其質(zhì)量評價的方法局限于數(shù)個指標(biāo)成分的含量測定，難以全面反映藥材質(zhì)量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種符合拉薩大黃特點的指紋圖譜構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，本發(fā)明提供的指紋圖譜能夠全面、有效的評價拉薩大黃的質(zhì)量。

本發(fā)明提供了一種拉薩大黃指紋圖譜的建立方法，包括：

將拉薩大黃制備的供試品溶液通過高效液相色譜檢測，以曲札茋苷作為參照峰，得到拉薩大黃指紋圖譜；

所述高效液相色譜檢測的色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料。

優(yōu)選的，所述高效液相色譜檢測的流動相包括有機相與水相；所述有機相為乙腈；所述水相為磷酸水溶液、甲酸水溶液或水。

優(yōu)選的，所述磷酸水溶液中磷酸的體積分?jǐn)?shù)為0.01％～3％；所述甲酸水溶液中甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.01％～3％。

優(yōu)選的，所述流動相的洗脫為梯度洗脫；所述梯度洗脫中，以有機相作為A相，以水相作為B相，洗脫程序為：0～18min，15～20％A；18～30min，20～30％A；30～45min，30～50％A；45～50min，50～30％A；50～55min，30～15％A。

優(yōu)選的，所述檢測的流速為0.3～1.5ml/min。

優(yōu)選的，所述檢測的波長為220～390nm。

優(yōu)選的，所述色譜柱的柱溫為10℃～45℃。

本發(fā)明還提供了一種拉薩大黃的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以曲札茋苷作為參照峰，其相對保留時間為1.00，指紋圖譜中其它共有峰的相對保留時間依次為1.157±0.08、1.322±0.08、1.440±0.08、1.467±0.08、1.664±0.08、1.972±0.08、2.059±0.08、2.493±0.08。

優(yōu)選的，以曲札茋苷作為參照峰，其相對峰面積為1.00，指紋圖譜中其它共有峰的相對峰面積依次為0.016～0.627、0.002～0.966、0.007～0.837、0.004～0.450、0.014～0.462、0.129～2.838、0.002～0.693、0.001～0.627。

優(yōu)選的，所述相對保留時間為1.157±0.08與1.972±0.08的峰對應(yīng)的化合物依次為虎杖苷與去氧土大黃苷。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的拉薩大黃指紋圖譜的構(gòu)建方法，即通過十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱對拉薩大黃樣品進(jìn)行高效液相色譜分析，以曲札茋苷作為參照峰構(gòu)建指紋圖譜，在此基礎(chǔ)上對指紋圖譜進(jìn)行評價。該方法符合拉薩大黃組成成分的特點，供試品溶液制備簡單，色譜條件容易實現(xiàn)。得到的拉薩大黃指紋圖譜能夠全面、系統(tǒng)、特征性地反應(yīng)拉薩大黃中的組成成分，能夠全面有效的評價拉薩大黃的質(zhì)量，可客觀地反映產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣，有利于產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控。該方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好。

本發(fā)明提供的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜以曲札茋苷作為參照峰，即使其相對保留時間為1.00，進(jìn)而確定指紋圖譜中其它共有峰的相對保留時間依次為1.157±0.08、1.322±0.08、1.440±0.08、1.467±0.08、1.664±0.08、1.972±0.08、2.059±0.08、2.493±0.08，以曲札茋苷作為參照峰，其相對峰面積為1.00，指紋圖譜中其它共有峰的相對峰面積依次為0.016～0.627、0.002～0.966、0.007～0.837、0.004～0.450、0.014～0.462、0.129～2.838、0.002～0.693、0.001～0.627，使得得到的指紋圖譜能夠全面有效的評價拉薩大黃的質(zhì)量。

附圖說明

圖1為本發(fā)明提供的16批拉薩大黃藥材指紋圖譜；

圖2為本發(fā)明提供的拉薩大黃的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；

圖3為曲札茋苷對照品、虎杖苷對照品、去氧土大黃苷對照品與拉薩大黃供試品色譜圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種拉薩大黃指紋圖譜的建立方法，包括：

將拉薩大黃制備的供試品溶液通過高效液相色譜檢測，以曲札茋苷作為參照峰，得到拉薩大黃指紋圖譜；其中，所述高效液相色譜檢測的色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料。

按照本發(fā)明，所述拉薩大黃制備的供試品溶液優(yōu)選按照以下方法制備：將拉薩大黃用提取液提取，過濾后，得到供試品溶液；所述提取液為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的提取液即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選提取溶劑為甲醇水溶液、乙醇水溶液或水；所述甲醇水溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為50％～100％，更優(yōu)選為70％～80％，再優(yōu)選為75％；所述乙醇水溶液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為50％～100％，更優(yōu)選為70％～80％，再優(yōu)選為75％；所述拉薩大黃與提取液的比例優(yōu)選為1g：(10～1000)ml，更優(yōu)選為1g：(100～800)ml，再優(yōu)選為1g：(300～700)ml，最優(yōu)選為1g：(400～600)ml；所述提取的時間優(yōu)選為20min～8h，更優(yōu)選為20min～4h，再優(yōu)選為20min～2h，再優(yōu)選為20min～60min，再優(yōu)選為30min～50min，最優(yōu)選為30min～40min；所述提取的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為超聲提取。本發(fā)明提供的供試品溶液制備簡單。

將拉薩大黃的供試品溶液通過高效液相色譜檢測，以曲札茋苷作為參照峰，得到拉薩大黃指紋圖譜；其中，所述高效液相色譜檢測的色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，優(yōu)選為Grace Apollo C₁₈column、Phenomenex Luna Su C₁₈(2)column或Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈column；所述色譜柱的規(guī)格優(yōu)選為250mm×4.6mm,5μm；所述高效液相色譜檢測的進(jìn)樣量優(yōu)選為0.5～40μl，更優(yōu)選為1～20μl，再優(yōu)選為5～20μl，再優(yōu)選為10～20μl，最優(yōu)選為10～15μl。

在本發(fā)明中，所述高效液相色譜檢測的流動相優(yōu)選包括有機相與水相；所述有機相為乙腈；所述水相為磷酸水溶液、甲酸水溶液或水。其中，所述磷酸水溶液中磷酸的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為0.01％～3％，更優(yōu)選為0.01％～2％，再優(yōu)選為0.05％～1％，再優(yōu)選為0.05％～0.5％，最優(yōu)選為0.1％～0.5％；在本發(fā)明提供的一些實施例中，所述磷酸水溶液中磷酸的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為0.1％；所述甲酸水溶液中甲酸的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為0.01％～3％，更優(yōu)選為0.01％～2％，再優(yōu)選為0.05％～1％，再優(yōu)選為0.05％～0.5％，最優(yōu)選為0.1％～0.5％。

所述流動相的洗脫優(yōu)選為梯度洗脫；所述梯度洗脫的時間優(yōu)選為20～180min，更優(yōu)選為30～150min，再優(yōu)選為40～120min，再優(yōu)選為40～100min，最優(yōu)選為40～60min；在本發(fā)明中，所述梯度洗脫中，以有機相作為A相，以水相作為B相，洗脫程序優(yōu)選為：0～18min，15～20％A；18～30min，20～30％A；30～45min，30～50％A；45～50min，50～30％A；50～55min，30～15％A；所述檢測的流速優(yōu)選為0.3～1.5ml/min，更優(yōu)選為0.5～1.5ml/min，再優(yōu)選為0.8～1.5ml/min，再優(yōu)選為0.8～1.2ml/min，最優(yōu)選為1.0ml/min；所述檢測優(yōu)選采用紫外檢測器檢測；所述檢測的波長優(yōu)選為220～390nm，更優(yōu)選為254～365nm，更優(yōu)選為270～325nm，更優(yōu)選為315～325nm，最優(yōu)選為319nm；所述檢測時色譜柱的柱溫優(yōu)選為10℃～45℃，更優(yōu)選為10℃～40℃，再優(yōu)選為20℃～35℃，再優(yōu)選為20℃～30℃，最優(yōu)選為20℃～25℃；在本發(fā)明提供的一些實施例中，所述檢測時色譜柱的柱溫優(yōu)選為20℃。

其中，洗脫程序中，％A指的是體積比，如15～20％A是指每100ml洗脫劑中含有15～20ml的A。

按照本發(fā)明，所述參照峰曲札茋苷的確定優(yōu)選為與曲札茋苷對照品溶液色譜圖對照保留時間的方法確定；所述曲札茋苷對照品溶液優(yōu)選按照以下方法制備：將曲札茋苷與甲醇水溶液混合，得到曲札茋苷對照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為50％～100％，更優(yōu)選為50％～90％，再優(yōu)選為60％～80％，再優(yōu)選為70％～80％，最優(yōu)選為75％；所述曲札茋苷對照品溶液中曲札茋苷的濃度優(yōu)選為10～1000μg/ml，更優(yōu)選為10～800μg/ml，再優(yōu)選為50～500μg/ml，再優(yōu)選為50～200μg/ml，再優(yōu)選為50～150μg/ml，最優(yōu)選為100μg/ml。

為提高拉薩大黃指紋圖譜的準(zhǔn)確性，優(yōu)選還加入虎杖苷對照品溶液和/或去氧土大黃苷對照品溶液。

所述虎杖苷對照品溶液優(yōu)選按照以下方法制備：將虎杖苷與甲醇水溶液混合，得到虎杖苷對照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為50％～100％，更優(yōu)選為50％～90％，再優(yōu)選為60％～80％，再優(yōu)選為70％～80％，最優(yōu)選為75％；所述虎杖苷對照品溶液中虎杖苷的濃度優(yōu)選為10～1000μg/ml，更優(yōu)選為10～800μg/ml，再優(yōu)選為50～500μg/ml，再優(yōu)選為50～200μg/ml，再優(yōu)選為50～150μg/ml，最優(yōu)選為100μg/ml。

所述去氧土大黃苷對照品溶液優(yōu)選按照以下方法制備：將去氧土大黃苷與甲醇水溶液混合，得到去氧土大黃苷對照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)優(yōu)選為50％～100％，更優(yōu)選為50％～90％，再優(yōu)選為60％～80％，再優(yōu)選為70％～80％，最優(yōu)選為75％；所述去氧土大黃苷對照品溶液中去氧土大黃苷的濃度優(yōu)選為10～1000μg/ml，更優(yōu)選為10～800μg/ml，再優(yōu)選為50～500μg/ml，再優(yōu)選為50～200μg/ml，再優(yōu)選為50～150μg/ml，最優(yōu)選為100μg/ml。

此外，本發(fā)明優(yōu)選根據(jù)10批次以上代表性供試品的檢測結(jié)果，采用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》生成拉薩大黃的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；本發(fā)明優(yōu)選將供試品指紋圖譜采用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》進(jìn)行相似度評價。

按照本發(fā)明，優(yōu)選地，所述拉薩大黃指紋圖譜按照以下方法建立：

(1)對照品溶液的制備：

曲札茋苷對照品溶液的制備：精密稱取曲札茋苷對照品適量，用50％～100％甲醇(體積百分比，以下甲醇濃度均為體積百分比)，優(yōu)選75％甲醇，配制成每1ml含曲札茋苷10～1000μg的溶液，優(yōu)選每1ml含曲札茋苷100μg。

虎杖苷對照品溶液的制備：精密稱取虎杖苷對照品適量，用50％～100％甲醇，優(yōu)選75％甲醇，配制成每1ml含和虎杖苷10～1000μg的溶液，優(yōu)選每1ml含曲札茋苷100μg。

去氧土大黃苷對照品溶液的制備：精密稱取去氧土大黃苷對照品適量，用50％～100％甲醇，優(yōu)選75％甲醇，配制成每1ml含去氧土大黃苷10～1000μg的溶液，優(yōu)選每1ml含曲札茋苷100μg。

(2)供試品溶液的制備：精密稱取拉薩大黃0.01～5g，用甲醇-水或乙醇-水或水提取，藥材與提取液的比例為1g：(10～1000)ml，提取時間為20分鐘～8小時，提取液濾過，濾液作為供試品溶液。

(3)高效液相色譜儀進(jìn)樣量0.5～40μl，采用高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜；其中色譜條件為：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；采用梯度洗脫，梯度洗脫的流動相A為乙腈，流動相B為0.01％～3％(體積百分比)磷酸水溶液或0.01％～3％(體積百分比)甲酸水溶液或水；梯度洗脫時間為20～180min，流速0.3～1.5ml/min；柱溫10℃～45℃；紫外檢測波長220～390nm。

(4)標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立：根據(jù)10批次以上代表性供試品的檢測結(jié)果，采用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》生成拉薩大黃的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。所述的代表性供試品需為專家鑒定質(zhì)量合格且相互獨立的藥材樣本。

(5)相似度評價：供試品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度需大于0.90。

更優(yōu)選地，上述步驟(2)按照以下方法進(jìn)行：取拉薩大黃粉末置具塞錐形瓶中，按照拉薩大黃與提取液1g：500ml的比例精密加入75％甲醇，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用75％甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

更優(yōu)選地，上述步驟(3)中梯度洗脫程序如表1所示進(jìn)行。

表1梯度洗脫程序表

更優(yōu)選地，所述拉薩大黃指紋圖譜按照以下方法建立：

(1)對照品溶液的制備：

曲札茋苷對照品溶液的制備：精密稱取曲札茋苷對照品適量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀釋配制成每1ml含0.1mg的溶液，即為曲札茋苷對照品溶液。

虎杖苷對照品溶液的制備：精密稱取虎杖苷對照品適量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀釋配制成每1ml含0.1mg的溶液，即為虎杖苷對照品溶液。

去氧土大黃苷對照品溶液的制備：精密稱取去氧土大黃苷對照品適量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀釋配制成每1ml含0.1mg的溶液，即為去氧土大黃苷對照品溶液。

(2)供試品溶液的制備：精密稱取拉薩大黃粉末(過三號篩)0.1g，置具塞錐形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，超聲處理(功率250w，頻率35kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用75％甲醇補足減失重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

(3)采用高效液相色譜法進(jìn)行測定：分別精密吸取各對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄55分鐘色譜圖，即得。色譜條件：色譜柱：Grace Apollo C₁₈column(250mm×4.6mm,5μm)；以乙腈為流動相A，以0.1％磷酸為流動相B；流速：1.0ml/min；紫外檢測波長：319nm；柱溫：20℃；按表1的洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫。

用前述拉薩大黃指紋圖譜的實驗方法建立12批次代表性拉薩大黃樣品的HPLC指紋圖譜，采用國家藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》生成拉薩大黃標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其中有9個共有峰，峰號依次記為1～9號。在標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，以1號峰(曲札茋苷)為參照峰S峰，計算各共有峰與S峰的相對保留時間，所述相對保留時間在第一規(guī)定值的±0.08之內(nèi)，所述第一規(guī)定值分別為：1.000(1號峰)、1.157(2號峰)、1.322(3號峰)、1.440(4號峰)、1.467(5號峰)、1.664(6號峰)、1.972(7號峰)、2.059(8號峰)、2.493(9號峰)。其中1號峰為曲札茋苷，2號峰為虎杖苷，7號峰為去氧土大黃苷。這些共有特征峰構(gòu)成了拉薩大黃的HPLC指紋圖譜，可作為拉薩大黃的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

本發(fā)明提供的拉薩大黃指紋圖譜的構(gòu)建方法，通過在高效液相色譜檢測時以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料的色譜柱，以曲札茋苷作為參照峰構(gòu)建指紋圖譜，使得得到的拉薩大黃指紋圖譜能夠全面、系統(tǒng)、特征性地反應(yīng)拉薩大黃中的組成成分，能夠全面有效的評價拉薩大黃的質(zhì)量，可客觀的反映產(chǎn)品的真?zhèn)蝺?yōu)劣，有利于產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控。該方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好。

本發(fā)明還提供了一種拉薩大黃標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以曲札茋苷作為參照峰，其相對保留時間為1.00，指紋圖譜中其它共有峰的相對保留時間依次為1.157±0.08、1.322±0.08、1.440±0.08、1.467±0.08、1.664±0.08、1.972±0.08、2.059±0.08、2.493±0.08；優(yōu)選的，指紋圖譜中其它共有峰的相對保留時間依次為1.157±0.03、1.322±0.03、1.440±0.03、1.467±0.03、1.664±0.03、1.972±0.03、2.059±0.03、2.493±0.03；更優(yōu)選的，指紋圖譜中其它共有峰的相對保留時間依次為1.157±0.01、1.322±0.01、1.440±0.01、1.467±0.01、1.664±0.01、1.972±0.01、2.059±0.01、2.493±0.01；在本發(fā)明的一些實施例中，指紋圖譜中其它共有峰的相對保留時間依次為1.157、1.322、1.440、1.467、1.664、1.972、2.059、2.493。

以曲札茋苷作為參照峰，其相對峰面積為1.00，指紋圖譜中其它共有峰的相對峰面積依次為0.016～0.627、0.002～0.966、0.007～0.837、0.004～0.450、0.014～0.462、0.129～2.838、0.002～0.693、0.001～0.627；優(yōu)選的，指紋圖譜中其它共有峰的相對峰面積依次為0.024～0.418、0.003～0.644、0.010～0.558、0.006～0.300、0.021～0.308、0.193～1.892、0.003～0.462、0.002～0.418；更優(yōu)選的，指紋圖譜中其它共有峰的相對峰面積依次為0.048～0.209、0.006～0.322、0.020～0.279、0.011～0.150、0.042～0.154、0.386～0.946、0.005～0.231、0.004～0.209；在本發(fā)明的一些實施例中，指紋圖譜中其它共有峰的相對峰面積依次為0.048～0.209、0.006～0.322、0.020～0.279、0.011～0.150、0.042～0.154、0.386～0.946、0.005～0.231、0.004～0.209。

優(yōu)選的，所述相對保留時間為1.157±0.08與1.972±0.08的峰對應(yīng)的化合物依次為虎杖苷與去氧土大黃甘。

本發(fā)明提供的指紋圖譜通過選擇以曲札茋苷作為參照峰，即使其相對保留時間為1.00，進(jìn)而確定指紋圖譜中其它共有峰的相對保留時間依次為1.157±0.08、1.322±0.08、1.440±0.08、1.467±0.08、1.664±0.08、1.972±0.08、2.059±0.08、2.493±0.08，以曲札茋苷作為參照峰，其相對峰面積為1.00，指紋圖譜中其它共有峰的相對峰面積依次為0.016～0.627、0.002～0.966、0.007～0.837、0.004～0.450、0.014～0.462、0.129～2.838、0.002～0.693、0.001～0.627，使得得到的指紋圖譜能夠全面有效的評價拉薩大黃的質(zhì)量。

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實施例

1儀器與材料

1.1主要儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(包括在線脫氣機、四元泵、自動進(jìn)樣器、DAD檢測器)(安捷倫公司)、CP225D分析天平(Sartorius公司)、BP221S分析天平(Sartorius公司)、Milli-Q超純水機(Millipore公司)、5510E-DTH超聲波清洗器(美國必能信公司)、BuchiR-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi公司)。

1.2實驗材料

試劑：色譜純乙腈(德國默克股份兩合公司)、色譜純甲醇(德國默克股份兩合公司)、色譜純乙醇(賽默飛世爾科技有限公司)、甲酸(分析純)、磷酸(分析純)、超純水、曲札茋苷(昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院自制，純度≥98％)、虎杖苷(昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院自制，純度≥98％)、去氧土大黃苷(昆藥集團(tuán)股份有限公司藥物研究院自制，純度≥98％)。

色譜柱：

Grace Apollo C₁₈column(250mm×4.6mm,5μm)

Phenomenex Luna Su C₁₈(2)column(250mm×4.60mm,5μm)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C₁₈column(250mm×4.60mm,5μm)

數(shù)據(jù)處理軟件：

國家藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版)。

2藥材的收集與鑒定

共收集拉薩大黃藥材16批，樣品情況見表2。

表2 16批拉薩大黃藥材信息表

3供試品溶液和對照品溶液的制備

以主要色譜峰的提取率為指標(biāo)，對提取方法(超聲提取40分鐘、回流提取5小時、索氏提取8小時)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明用超聲作為提取方法的提取率較高，且前處理時間較短，故優(yōu)選超聲作為提取方式。

以主要色譜峰的提取率為指標(biāo)，對提取溶劑(水、50％乙醇、75％乙醇、90％乙醇、乙醇、50％甲醇、75％甲醇、90％甲醇、甲醇)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明用含甲醇的溶劑提取率較高，為兼顧不同極性成分的提取效率，優(yōu)選75％甲醇作為提取溶劑。

以主要色譜峰的提取率為指標(biāo)，對超聲提取時間(20分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明四種不同提取時間得到的結(jié)果無明顯差異，為確保提取完全，兼顧提取效率，優(yōu)選超聲提取30分鐘。

以主要色譜峰的提取率為指標(biāo)，對超聲提取溶劑(75％甲醇)體積進(jìn)行了考察(25ml、50ml和75ml)，結(jié)果顯示對于0.1g藥材，50ml溶劑提取一次即可提取完全，優(yōu)選75％的甲醇50ml提取一次。

基于以上研究，規(guī)定供試品溶液制備條件如下：

取本品粉末(過三號篩)約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，超聲處理(功率250W，頻率35kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用75％甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對照品溶液的制備：曲札茋苷、虎杖苷、去氧土大黃苷可溶于不同比例的50％～100％甲醇，考慮到與藥材提取溶劑一致，優(yōu)選75％甲醇。不同對照品溶液濃度(10～1000μg/ml)配合不同進(jìn)樣量(0.5～40μl)均可滿足分析要求。兼顧信號強度與對照品用量，優(yōu)選曲札茋苷、虎杖苷、去氧土大黃苷對照品溶液濃度均為100μg/ml(即0.1mg/ml)。曲札茋苷、虎杖苷、去氧土大黃苷對光照敏感，優(yōu)選棕色容量瓶。因此規(guī)定對照品溶液的制備方法：精密稱取曲札茋苷對照品適量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀釋配制成每1ml含0.1mg的溶液，即為曲札茋苷對照品溶液。精密稱取虎杖苷對照品適量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀釋配制成每1ml含0.1mg的溶液，即為虎杖苷對照品溶液。精密稱取去氧土大黃苷對照品適量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀釋配制成每1ml含0.1mg的溶液，即為去氧土大黃苷對照品溶液。

4色譜條件

色譜柱考察：為保證分析方法的通用性，本發(fā)明采用以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的(C₁₈)色譜柱，對多個廠家(Grace、Phenomenex、Agilent等)的C₁₈色譜柱進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示不同廠家的C₁₈色譜柱均能滿足分析要求，方法重現(xiàn)性良好，以Grace Apollo C₁₈column(250mm×4.6mm，5μm)為最佳。

流動相選擇：對流動相組成進(jìn)行了考察(乙腈-水、乙腈-磷酸-水、乙腈-甲酸-水)，因拉薩大黃成分復(fù)雜，梯度洗脫效果好于等度洗脫，磷酸和甲酸的加入有利于改善峰形。在此基礎(chǔ)上，考察了不同濃度(0.01％～3％，體積百分比)的磷酸-水和甲酸-水對分離效果的影響，以0.1％磷酸-水為最佳。

檢測波長的選擇：本研究采用二極管陣列紫外檢測器對檢測波長(210～400nm)進(jìn)行了考察，220～390nm各主要色譜峰均有一定的吸收，319nm的色圖譜中峰面積普遍較大，色譜峰較多，同時各色譜峰分離較好，因此優(yōu)選319nm作為檢測波長。

此外對流速(0.3～1.5ml/min)、柱溫(10℃～45℃)、進(jìn)樣量(0.5～40μl)進(jìn)行了考察和優(yōu)化。

綜合以上研究，規(guī)定色譜條件為：

Grace Apollo C₁₈column(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以乙腈為流動相A，以0.1％磷酸為流動相B；流速：1.0ml/min；紫外檢測波長：319nm；柱溫：20℃；按表1的洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫。

分別精密吸取各對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，記錄55分鐘色譜圖，即得。

5方法學(xué)考察

5.1精密度考察

取同一批號樣品(批號：S16)，根據(jù)供試品溶液制備方法的規(guī)定制備供試品溶液，按照色譜條件規(guī)定的分析方法連續(xù)進(jìn)樣6次，將所得的色譜圖輸入相似度評價軟件進(jìn)行相似度比較，采用中數(shù)法生成參照指紋圖譜(R)，以參照指紋圖譜計算各色譜圖的相似度。各色譜圖的相似度均大于0.98，且RSD小于0.5％，方法的精密度良好。

5.2重復(fù)性考察

取同一批號樣品(批號：S16)，根據(jù)供試品溶液制備方法的規(guī)定平行制備6份供試品溶液，按照色譜條件規(guī)定的分析方法進(jìn)樣分析，將所得的色譜圖輸入相似度評價軟件進(jìn)行相似度比較，采用中數(shù)法生成參照指紋圖譜(R)，以參照指紋圖譜計算各色譜圖的相似度，各色譜圖的相似度均大于0.98，且RSD小于0.5％，方法的重復(fù)性良好。

5.3穩(wěn)定性考察

取同一份批號樣品(批號：S16)，根據(jù)供試品溶液制備方法的規(guī)定制備供試品溶液，分別于制備后的0、1、2、3、9、22、26、39h按照色譜條件規(guī)定的分析方法進(jìn)樣分析，采將所得的色譜圖輸入相似度評價軟件進(jìn)行相似度比較，采用中數(shù)法生成參照指紋圖譜(R)，以參照指紋圖譜計算各色譜圖的相似度，各色譜圖的相似度均大于0.98，且RSD小于0.5％，樣品于39h內(nèi)穩(wěn)定。

以上方法學(xué)考察表明：目前建立的指紋圖譜操作方法可行，適合拉薩大黃藥材指紋圖譜的建立和分析。

6拉薩大黃藥材對照圖譜的建立

取不同批次拉薩大黃藥材共16批(樣品詳情見表2)，分別按照已建立的拉薩大黃指紋圖譜分析方法進(jìn)行分析，得到各批藥材的HPLC指紋圖譜，結(jié)果見圖1。

上述16批拉薩大黃藥材中，批次S1～S5、S7～S12和S16的樣品(共12批)來源確切，經(jīng)專家鑒定質(zhì)量合格，且為相互獨立的藥材樣本，可作為代表性樣品。因此以上述12批次樣品的色譜指紋圖譜為基礎(chǔ)，使用藥典會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2012.130723進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得到共有模式指紋圖譜，即為拉薩大黃標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，如圖2所示。

通過比較12批藥材的色譜圖，確定了9個共有峰。在標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中，以1號峰(曲札茋苷)為參照峰S峰，計算各共有峰與S峰的相對保留時間，分別為：1.000(1號峰)、1.157(2號峰)、1.322(3號峰)、1.440(4號峰)、1.467(5號峰)、1.664(6號峰)、1.972(7號峰)、2.059(8號峰)、2.493(9號峰)。通過與對照品對照保留時間，確定1號峰為曲札茋苷，2號峰為虎杖苷，7號峰為去氧土大黃苷。

16批拉薩大黃藥材指紋圖譜共有峰的相對保留時間和相對峰面積分別見表3和表4。

表3 16批拉薩大黃藥材指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表4 16批拉薩大黃藥材指紋圖譜共有峰的相對峰面積

以拉薩大黃標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜為參照，分別計算16批藥材的相似度，結(jié)果見表2。所有代表性樣品(S1～S5、S7～S12和S16，共12批)與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度均在0.90以上。

批次S6、S13～S15(共4批)為引種栽培樣品，為綜合評價其質(zhì)量，以拉薩大黃標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜為參照，對批次S6、S13～S15樣品的指紋圖譜進(jìn)行了相似度分析，分析結(jié)果見表5。結(jié)果顯示上述樣品的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度均在0.90以上，和代表性樣品的化學(xué)成分相似，具有較好的化學(xué)等同性。

表5 16批拉薩大黃藥材指紋圖譜的相似度分析結(jié)果

R為拉薩大黃標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

以上研究表明本發(fā)明有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，有良好的實用性，能夠用于拉薩大黃的綜合質(zhì)量控制。

以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。