本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，尤其涉及一種中藥荊芥抗肺癌活性成分的質(zhì)量控制方法。

背景技術(shù)：

肺癌是目前發(fā)病率和死亡率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。肺癌中80%是非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cell lung cancer，NSCLC），病理上以鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌為主。近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率正在迅速上升，雖然手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、免疫治療及綜合治療等都取得了長足發(fā)展，但肺癌患者5年的生存率僅為15%，因此尋找有效的抗肺癌藥物與方法，徹底攻克肺癌，一直是世界醫(yī)學(xué)界重要的研究課題之一。

在我國，中藥擁有幾千年研究和應(yīng)用歷史，以其獨特的療效和巨大的開發(fā)潛能引起了廣泛的關(guān)注。荊芥，為常用中藥之一。又名“假蘇”，土名“姜芥”，《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為中品，屬于唇形科植物植物荊芥的干燥地上部分，具有解表、透疹等藥理作用。臨床文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)：其主要化學(xué)成分大體可以分為黃酮、多糖、揮發(fā)油、酚酸等幾大類，其中黃酮類化合物具有顯著的抗腫瘤活性。

中藥作為一個復(fù)雜而多元化的體系，對其進(jìn)行全方位的質(zhì)量控制一直屬于一個技術(shù)性難題。而指紋圖譜的出現(xiàn)，從整體上對藥材質(zhì)量提供了有效的控制手段。目前，中藥指紋圖譜已成為國內(nèi)外廣泛接受的全面評價多維組分復(fù)雜樣品質(zhì)量模式的一種方法，美國FDA在植物藥制品指導(dǎo)原則中允許申報者提供產(chǎn)品的色譜指紋圖譜資料，德國藥用植物學(xué)會、英國草藥典、印度草藥典以及加拿大藥用級芳香植物協(xié)會也都把指紋圖譜作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容之一。指紋圖譜反映的是藥材提取物的整體特征，所以在保證整體的前提下，針對其色譜峰與藥效之間建立聯(lián)系具有一定的實際意義。

在荊芥研究過程中，發(fā)現(xiàn)了一種制備高純度荊芥總黃酮的方法，并且在抗腫瘤方面藥效良好（專利號201410397261.1），具有較好的開發(fā)價值。為了更好地控制其在抗肺癌方面的質(zhì)量，保證臨床用藥的安全性和有效性，亟需開發(fā)一種全面、合理、系統(tǒng)和有效的控制中藥荊芥抗肺癌活性成分質(zhì)量的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種中藥荊芥抗肺癌活性成分的質(zhì)量控制方法。該方法可以全面、合理、系統(tǒng)和有效的控制中藥荊芥抗肺癌活性成分的質(zhì)量。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種以藥效學(xué)為導(dǎo)向的中藥荊芥抗肺癌活性成分多指標(biāo)成分的質(zhì)量控制方法，包括步驟如下。

（1）供試品溶液的制備。

分別稱取9批不同產(chǎn)地荊芥藥材粉末（過四號篩），置圓底燒瓶中，精密加入75 %乙醇溶液，回流提取，每次1 h，合并3次濾液（絹布過濾），用水稀釋成生藥所需的藥液，過HPD-400型大孔吸附樹脂，上樣濃度0.8 g/mL（生藥和濕樹脂比），用2倍柱體積（BV）水洗除雜，用70%乙醇洗脫，重復(fù)上柱二次，收集洗脫液，搖勻，經(jīng)濾膜濾過，即得供試品溶液。

（2）高效液相色譜條件。

Agilent poroshell SB-C₁₈色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），流動相：體積分?jǐn)?shù)為0.02%的甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），程序梯度洗脫，流速：1.0 mL·min^-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；檢測波長：330 nm。

（3）特征色譜峰的提取。

根據(jù)對照指紋圖譜（R）中峰面積滿足定性及定量要求的色譜峰進(jìn)行提取，保留時間分別為：8.4 min， 9.7 min，12.7 min，13.2 min，17.1 min，20.2 min，25.6 min，26.3 min，29.8 min，31.5 min，33.9 min，38.1 min，42.5 min，46.6 min，47.0 min，51.0 min，53.2 min，62.2 min，68.9 min。

（4）灰色關(guān)聯(lián)分析。

將提取得到的特征色譜峰峰面積作為子序列，肺癌細(xì)胞的凋亡壞死率（%）作為母序列進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)軟件分析，得到不同色譜峰抗肺癌作用的關(guān)聯(lián)系數(shù)。

（5）對照品溶液的制備。

分別精密稱取香葉木素對照品、木犀草苷對照品、槲皮苷對照品、橙皮苷對照品、木犀草素對照品、芹菜素對照品、迷迭香酸甲酯對照品2.47 mg、1.48 mg、11.08 mg、17.84 mg、2.91 mg、2.68 mg、8.73 mg，置于10 mL容量瓶中，加純甲醇定容至10 mL刻度，搖勻制成儲備液，精密吸取儲備液1 mL置于10 mL容量瓶中，加純甲醇定容至10 mL刻度，搖勻，即得香葉木素、木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、迷迭香酸甲酯濃度分別為0.0247 mg·mL^-1、0.0148 mg·mL^-1、0.1108 mg·mL^-1、0.1784 mg·mL^-1、0.0291 mg·mL^-1、0.0268 mg·mL^-1、0.0873 mg·mL^-1的混合對照品溶液。

（6）色譜峰指認(rèn)。

利用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)手段對特征峰進(jìn)行色譜峰歸屬，并通過質(zhì)譜中保留時間、分子離子峰、碎片離子峰的分子量匹配得出以下信息：6號峰為木犀草苷，10號峰為槲皮苷，11號峰為橙皮苷，12號峰為迷迭香酸甲酯，16號峰為木犀草素，18號峰為芹菜素，19號峰為香葉木素。

以上色譜峰構(gòu)成了荊芥醇提物的指紋圖譜特征，可以對荊芥中所含主要黃酮類成分做出色譜鑒定。

（7）中藥荊芥醇提物中抗肺癌活性成分的含量測定。

分別稱取9種不同來源荊芥藥材粉末約2.0 g，精密稱定（按藥典規(guī)定稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所取重量的千分之一），按上述制備供試品溶液及色譜條件測定峰面積，采用外標(biāo)法計算樣品中木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、香葉木素及迷迭香酸甲酯的含量。

本發(fā)明具備的有益效果。

本發(fā)明是在前期研究的基礎(chǔ)上作進(jìn)一步的研究。首先，以肺癌細(xì)胞A549的凋亡壞死率為評價指標(biāo)，對9批不同來源的荊芥藥材醇提物進(jìn)行體外藥效試驗研究；其次，采用高效液相色譜儀，梯度洗脫的方式，建立了荊芥醇提物的HPLC指紋圖譜，并采用灰色關(guān)聯(lián)分析軟件將藥效指標(biāo)與提取的色譜峰峰面積進(jìn)行相關(guān)性分析篩選出關(guān)聯(lián)系數(shù)較大的色譜峰；并采用液質(zhì)聯(lián)用的技術(shù)(UPLC-Q-TOF/MS)對荊芥醇提物HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中抗肺癌活性關(guān)聯(lián)度較大的7種色譜峰進(jìn)行成分指認(rèn)，并采用高效液相色譜法對7種化學(xué)成分進(jìn)行含量檢測，為其發(fā)揮更好抗肺癌的效果提供實驗依據(jù)。為抗肺癌藥效方向上的質(zhì)量控制提供了更全面、更系統(tǒng)的信息。

利用高效液相色譜技術(shù)，梯度洗脫，得到荊芥醇提物HPLC指紋圖譜。一方面，指紋圖譜所提供的化學(xué)信息豐富，能夠表達(dá)該產(chǎn)品的特征，具有良好的專屬性，以荊芥醇提物中所含成分的指紋圖譜作為一個整體看待避免了只測定單一成分而判定荊芥整體質(zhì)量的片面性；另一方面，采用UPLC-Q-TOF/MS串聯(lián)技術(shù)，對荊芥醇提物HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中抗肺癌關(guān)聯(lián)度較大的7種成分進(jìn)行了指認(rèn)，有利于對中藥荊芥質(zhì)量的全方面監(jiān)控，并一次性測定所指認(rèn)的7種成分含量，方法簡單、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握。

綜上所述，本發(fā)明制作該指紋圖譜的方法簡單、準(zhǔn)確可靠、能更全面地反映荊芥醇提物的質(zhì)量，適用于荊芥醇提物在抗肺癌作用方面的質(zhì)量控制，其測定方法也具有一定的穩(wěn)定性以及準(zhǔn)確性，適用于進(jìn)一步的質(zhì)量研究，具有良好的實用性。

附圖說明

圖1 9批不同來源荊芥藥材醇提物的指紋圖譜。

圖2 橙皮苷二級質(zhì)譜圖。

圖3木犀草素二級質(zhì)譜圖。

圖4芹菜素二級質(zhì)譜圖。

圖5 木犀草苷二級質(zhì)譜圖。

圖6香葉木素二級質(zhì)譜圖。

圖7槲皮苷二級質(zhì)譜圖。

圖8 迷迭香酸甲酯二級質(zhì)譜圖。

圖9混合對照品的液相色譜圖（其中：1-木犀草苷；2-槲皮苷；3-橙皮苷；4-迷迭香酸甲酯；5-木犀草素；6-芹菜素；7-香葉木素）。

圖10供試品溶液的液相色譜圖（其中：1-木犀草苷；2-槲皮苷；3-橙皮苷；4-迷迭香酸甲酯；5-木犀草素；6-芹菜素；7-香葉木素）。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實施例1。

中藥荊芥抗肺癌活性成分的質(zhì)量控制方法，具體為荊芥醇提物HPLC指紋圖譜的構(gòu)建方法。

1.儀器與試藥。

1.1 儀器：NUAIRETM US AUTOFLOW型CO₂培養(yǎng)箱（德國NUAIRE公司）；細(xì)胞凋亡與壞死檢測試劑盒（Hoechst 33342和PI，碧云天生物技術(shù)研究所，批號：C1056-3）；Nikon ECLIPSE TI倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Agilent 1290 型快速高效液相色譜儀（安捷倫公司）；Agilent 6550 iFunnel Q-TOF質(zhì)譜（安捷倫公司）。

1.2 試藥：荊芥藥材來源于不同地區(qū)的藥房，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定本品為才唇形科植物荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分。實驗中液相色譜和質(zhì)譜所用試劑為色譜純和質(zhì)譜純，其余所用試劑均為分析純，水為超純水。

2. 方法與結(jié)果。

2.1供試品溶液制備。

稱取荊芥藥材粉末40.0g（誤差范圍39.95-40.05 g），精密加入600 mL 75 %乙醇溶液回流提取3次（誤差±0.5 mL），合并濾液，稀釋成生藥濃度為0.1 g·mL^-1的藥液，過HPD-400型大孔吸附樹脂，上樣濃度0.8 g·mL^-1（生藥和濕樹脂比），用2 倍柱體積（BV）水洗除雜，用9 BV 70%乙醇洗脫，重復(fù)上柱二次，收集洗脫液，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2 體外藥效評價試驗。

人肺癌細(xì)胞 A549，常規(guī)培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5 % CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于芯片，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)前期研究的相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果IC₅₀值，用10%胎牛牛血清的DMEM培養(yǎng)液將9種不同來源的荊芥醇提取物分別配制成1.0 mg·mL^-1的濃度，以0.2 μL·min^-1的流速經(jīng)蠕動泵灌注入芯片作用24 h，檢測不同來源藥材的藥效差異，結(jié)果見表1。

表1 為9個不同來源的荊芥醇提取物的藥效差異。

注：細(xì)胞凋亡壞死率%=（凋亡細(xì)胞數(shù)+壞死細(xì)胞數(shù)）/全部細(xì)胞數(shù)×100%。

2.3 指紋圖譜的建立。

高效液相色譜條件：精密吸取供試品溶液2 μL，采用Agilent poroshell SB-C₁₈色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.7 μm），流速：1.0 mL·min^-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：330 nm；流動相：體積分?jǐn)?shù)為0.02%的甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），進(jìn)行程序梯度洗脫，如下表2。

表2 為程序梯度洗脫對應(yīng)表。

2.3.1精密度試驗。

密吸取同一供試品溶液2 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積值。結(jié)果表明，本方法精密度良好，相對保留時間的RSD在0.18~0.23%之間，相對峰面積的RSD在1.28~2.93%之間，RSD均小于5%，說明儀器性能良好，符合指紋圖譜的要求。

2.3.2穩(wěn)定性試驗。

制備供試品溶液一份，于室溫放置0，3，6，12，24，48 h，按上述色譜條件，以峰面積為指標(biāo)進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜，計算各色譜峰的相對峰面積的RSD。各色譜峰的相對保留時間的RSD在0.13~0.22%之間，相對峰面積的RSD在2.28~3.91 %之間，結(jié)果表明，RSD均小于5%，樣品制備方法穩(wěn)定性較好，符合指紋圖譜的要求。

2.3.3重復(fù)性試驗。

取同一批藥材粉末6份，精密稱定（按藥典規(guī)定稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所取重量的千分之一），制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行分析。記錄指紋圖譜，計算各色譜峰的相對峰面積的RSD。各色譜峰的相對保留時間的RSD在0.58~0.93%之間，相對峰面積的RSD在2.86~3.37%之間結(jié)果表明，RSD均小于5%，樣品制備方法重復(fù)性較好，符合指紋圖譜的要求。

取供試品溶液按“2.3”項下色譜條件，進(jìn)行分析檢測，得到 9 個不同來源荊芥藥材的指紋圖譜，如圖1所示。

2.4 特征色譜峰的提取。

根據(jù)對照指紋圖譜（R）中峰面積滿足定性及定量要求的色譜峰進(jìn)行提取，保留時間分別為：8.4 min， 9.7 min，12.7 min，13.2 min，17.1 min，20.2 min，25.6 min，26.3 min，29.8 min，31.5 min，33.9 min，38.1 min，42.5 min，46.6 min，47.0 min，51.0 min，53.2 min，62.2 min，68.9 min。

2.5 灰色關(guān)聯(lián)分析。

將提取得到的特征色譜峰峰面積作為子序列，肺癌細(xì)胞的凋亡壞死率（%）作為母序列進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)軟件分析。具體的將藥效指標(biāo)與 19 個色譜峰的峰面積進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，得到其對應(yīng)的關(guān)聯(lián)系數(shù)，如表3所示。

表3為19 個色譜峰面積的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)。

在此基礎(chǔ)上，對關(guān)聯(lián)系數(shù)較大的色譜峰進(jìn)行成分指認(rèn)及含量測定。

2.6 對照品溶液制備。

分別精密稱取香葉木素對照品、木犀草苷對照品、槲皮苷對照品、橙皮苷對照品、木犀草素對照品、芹菜素對照品、迷迭香酸甲酯對照品2.47 mg、1.48 mg、11.08 mg、17.84 mg、2.91 mg、2.68 mg、8.73 mg，置于10 mL容量瓶中，加純甲醇定容至10 mL刻度，搖勻制成儲備液，精密吸取儲備液1 mL置于10 mL容量瓶中，加純甲醇定容至10 mL刻度，搖勻，即得香葉木素、木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、木犀草素、芹菜素、迷迭香酸甲酯濃度分別為0.0247 mg·mL^-1、0.0148 mg·mL^-1、0.1108 mg·mL^-1、0.1784 mg·mL^-1、0.0291 mg·mL^-1、0.0268 mg·mL^-1、0.0873 mg·mL^-1的混合對照品溶液。

2.7色譜峰的指認(rèn)。

通過UPLC-Q-TOF-MS質(zhì)譜獲得的二級數(shù)據(jù)與對照品相比對進(jìn)行化學(xué)成分的快速鑒定，最終確定了荊芥醇提取物中對抗肺癌藥效貢獻(xiàn)較大（關(guān)聯(lián)系數(shù)不小于于0.6623）的7種化學(xué)成分其中6、10、11、12、16、18、19號色譜峰的碎片離子與對照品碎裂方式一致，如圖2至圖8所示。其鑒定結(jié)果如表4所示。

表4 為色譜峰指認(rèn)結(jié)果。

2.8 色譜峰的含量測定。

分別取9種不同來源荊芥藥材粉末約2.0 g，精密稱定（按藥典規(guī)定稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所取重量的千分之一），按供試品溶液的制備方法及色譜條件測定峰面積，供試品溶液及混合對照品溶液的液相色譜圖分別如圖9和圖10所示。并用外標(biāo)法計算樣品中木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、迷迭香酸甲酯、木犀草素、芹菜素、香葉木素的含量，結(jié)果見表5。

表5 為不同產(chǎn)地荊芥藥材含量測定結(jié)果（mg/g）。

綜上所述，分別稱取9種不同來源荊芥藥材粉末，按上述制備供試品溶液及色譜條件測定峰面積，并用外標(biāo)法計算樣品中木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、迷迭香酸甲酯、木犀草素、芹菜素、香葉木素的含量，9批來自不同來源的荊芥藥材的醇提物中7種成分含量差異較大，并且藥效差異顯著。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明創(chuàng)建了一套完整的荊芥醇提物在發(fā)揮抗肺癌活性的應(yīng)用研究領(lǐng)域的質(zhì)量控制方法，對于荊芥藥材抗肺癌作用作用上的質(zhì)量控制尤為重要，具有潛在的應(yīng)用價值。