本發(fā)明涉及一種生物檢驗方法，尤其涉及一種椎間盤髓核組織樣本中蛋白質(zhì)或氨基酸的檢測分析方法。
背景技術(shù)：
髓核是椎間盤的重要部分，對于對椎間盤突出病人，往往采取髓核切除的方法進(jìn)行治療，而對手術(shù)獲得的髓核組織標(biāo)本進(jìn)行物質(zhì)分析成為我們探索椎間盤退變疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵手段。但是，由于髓核是一種少細(xì)胞組織，其中充滿大量基質(zhì)蛋白，如膠原蛋白和蛋白聚糖，在利用組織進(jìn)行分析時，這些基質(zhì)成分加上其他雜質(zhì)往往會影響我們對目標(biāo)蛋白/氨基酸的檢測和分析。目前，在該研究領(lǐng)域，還沒有一種標(biāo)準(zhǔn)高效高精度的方法來對髓核組織的蛋白質(zhì)/氨基酸成分進(jìn)行分析。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種椎間盤髓核組織樣本中蛋白質(zhì)或氨基酸的檢測分析方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述目的：
本發(fā)明包括以下步驟：
步驟(1)樣本制備：
(1.1)將手術(shù)中切除的人髓核組織放入培養(yǎng)皿中，用PBS洗凈血液,然后利用手術(shù)顯微鏡去除周圍多余組織,分離獲得髓核組織；
(1.2)將髓核組織剪碎，然后將剪碎的組織放入研缽里,倒入液氮仔細(xì)研磨，直到固體組織變?yōu)閮龈煞?注意研磨一定要均勻；
(1.3)用高精度天平稱量500mg凍干粉,然后將凍干粉轉(zhuǎn)移進(jìn)入玻璃勻漿器中，加入超純水(1ml/100mg組織)進(jìn)行勻速勻漿,勻漿的過程中注意防止勻漿液漏出；
(1.4)持續(xù)勻漿直至待勻漿器中沒有肉眼可見的髓核組織凍干粉后，將得到的勻漿液用1ml移液器全部吸出，轉(zhuǎn)移到離心管中，在4攝氏度條件下11000轉(zhuǎn)高速離心20分鐘,取上清；
(1.5)將上清加入事先用甲醇活化和水平衡的固相萃取小柱中(HLB,Waters,USA)，將上清過柱,可用1ml注射器放在小柱口進(jìn)行加壓，加快液體過柱速度，液體過柱后，丟棄；注：固相萃取小柱可根據(jù)待分析物質(zhì)的物理性質(zhì)不同而選擇不同廠家的不同型號，一切根據(jù)用途來決定。在我們本次研究中，我們選取的是美國Waters公司的小柱；
(1.6)用100ul的10％甲醇洗脫液對固相萃取小柱進(jìn)行洗脫,將洗脫液收集起來。注：洗脫液的體積，以及有機(jī)溶劑的種類，濃度都可根據(jù)不同的分析目的和萃取柱的類型進(jìn)行調(diào)整，需要預(yù)實驗摸索條件；
(1.7)所得洗脫液即為利用髓核組織獲取的液態(tài)分析樣本，-80攝氏度保存待測；
步驟(2)：樣本檢測：
(2.1)將靶蛋白質(zhì)/氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定該物質(zhì)的質(zhì)荷比和離子譜峰的強(qiáng)度并繪制質(zhì)譜圖，然后利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制質(zhì)譜圖，從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；注：本次分析的目標(biāo)物質(zhì)為三肽:N端乙酰化-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸；
(2.2)將制備好的髓核組織液體樣本在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)行分析，得到相應(yīng)樣本的質(zhì)譜圖，通過已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得樣本中靶物質(zhì)的濃度；
步驟(3)：結(jié)果分析：
結(jié)合不同樣本來源病人的臨床相關(guān)資料和測量獲得的靶物質(zhì)濃度，跟分析得出靶物質(zhì)與病人年齡，椎間盤退變，生活習(xí)慣等的相關(guān)性，從而探索不同蛋白質(zhì)/氨基酸在椎間盤退變進(jìn)程中的病理生理作用。
本發(fā)明的有益效果在于：
本發(fā)明是一種椎間盤髓核組織樣本中蛋白質(zhì)或氨基酸的檢測分析方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明樣本制備程序簡單、提取成本低，固相萃取小柱成本低廉，對靶蛋白質(zhì)/氨基酸的檢測特異性強(qiáng)，定量進(jìn)度高，具有推廣應(yīng)用的價值。
具體實施方式
下面對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：
本發(fā)明包括以下步驟：
步驟(1)樣本制備：
(1.1)將手術(shù)中切除的人髓核組織放入培養(yǎng)皿中，用PBS洗凈血液,然后利用手術(shù)顯微鏡去除周圍多余組織,分離獲得髓核組織；
(1.2)將髓核組織剪碎，然后將剪碎的組織放入研缽里,倒入液氮仔細(xì)研磨，直到固體組織變?yōu)閮龈煞?注意研磨一定要均勻；
(1.3)用高精度天平稱量500mg凍干粉,然后將凍干粉轉(zhuǎn)移進(jìn)入玻璃勻漿器中，加入超純水(1ml/100mg組織)進(jìn)行勻速勻漿,勻漿的過程中注意防止勻漿液漏出；
(1.4)持續(xù)勻漿直至待勻漿器中沒有肉眼可見的髓核組織凍干粉后，將得到的勻漿液用1ml移液器全部吸出，轉(zhuǎn)移到離心管中，在4攝氏度條件下11000轉(zhuǎn)高速離心20分鐘,取上清；
(1.5)將上清加入事先用甲醇活化和水平衡的固相萃取小柱中(HLB,Waters,USA)，將上清過柱,可用1ml注射器放在小柱口進(jìn)行加壓，加快液體過柱速度，液體過柱后，丟棄；注：固相萃取小柱可根據(jù)待分析物質(zhì)的物理性質(zhì)不同而選擇不同廠家的不同型號，一切根據(jù)用途來決定。在我們本次研究中，我們選取的是美國Waters公司的小柱；
(1.6)用100ul的10％甲醇洗脫液對固相萃取小柱進(jìn)行洗脫,將洗脫液收集起來。注：洗脫液的體積，以及有機(jī)溶劑的種類，濃度都可根據(jù)不同的分析目的和萃取柱的類型進(jìn)行調(diào)整，需要預(yù)實驗摸索條件；
(1.7)所得洗脫液即為利用髓核組織獲取的液態(tài)分析樣本，-80攝氏度保存待測；
步驟(2)：樣本檢測：
(2.1)將靶蛋白質(zhì)/氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)品，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定該物質(zhì)的質(zhì)荷比和離子譜峰的強(qiáng)度并繪制質(zhì)譜圖，然后利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制質(zhì)譜圖，從而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；注：本次分析的目標(biāo)物質(zhì)為三肽:N端乙?；?脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸；
(2.2)將制備好的髓核組織液體樣本在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)行分析，得到相應(yīng)樣本的質(zhì)譜圖，通過已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算獲得樣本中靶物質(zhì)的濃度；
步驟(3)：結(jié)果分析：
結(jié)合不同樣本來源病人的臨床相關(guān)資料和測量獲得的靶物質(zhì)濃度，跟分析得出靶物質(zhì)與病人年齡，椎間盤退變，生活習(xí)慣等的相關(guān)性，從而探索不同蛋白質(zhì)/氨基酸在椎間盤退變進(jìn)程中的病理生理作用。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。