本發(fā)明涉及蠶絲領(lǐng)域，尤其涉及一種分析桑蠶絲絲素蛋白中氨基酸徑向分布的方法。
背景技術(shù)：
蠶絲是一種動物蛋白纖維材料，主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，其中絲素蛋白約占70%，是蠶絲的主要成分，決定蠶絲的性質(zhì)和用途。桑蠶絲是生活中比較常見的蠶絲之一，其在各領(lǐng)域中都有實際應(yīng)用。
絲素基質(zhì)在蠶體內(nèi)的生化合成十分復(fù)雜，不同蠶絲腺內(nèi)的絲素蛋白原液不同，而且在吐絲過程中，絲素原液受到蠶體內(nèi)的壓力及口器的作用，會表現(xiàn)出不同的流變性，最終導(dǎo)致不同種類蠶絲絲素的分子結(jié)構(gòu)和超分子結(jié)構(gòu)等微結(jié)構(gòu)的不同。
桑蠶絲和柞蠶絲絲素蛋白中含有18種氨基酸（不含有20種基本氨基酸中的谷氨酰胺和天冬酰胺），主要由甘氨酸（gly）、丙氨酸（ala）、絲氨酸（ser）和酪氨酸（tyr）組成。桑蠶絲素中四種氨基酸的含量在85%以上，而柞蠶絲素中四種氨基酸含量在82%以上。此外，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，除了不同種類的蠶絲其氨基酸分布不同之外，同一桑蠶絲的氨基酸在其徑向上的分布是不同的。
為了實現(xiàn)桑蠶絲更好地進行利用，有必要比較研究桑蠶絲絲素蛋白中氨基酸的徑向分布和變化規(guī)律。目前，在研究過程中，可通過使用酸、堿溶液或各種蛋白酶對絲素蛋白進行不同程度（通過控制水解/酶解時間的長短來實現(xiàn)徑向上的逐層侵蝕）的溶解，以得到殘余的絲素纖維，再采用紅外光譜、x射線衍射等技術(shù)進行分析。但上述溶解方法容易損傷氨基酸，并且容易對絲素纖維內(nèi)層暫時不希望被水解的蛋白質(zhì)造成誤水解/酶解，從而造成分析結(jié)果不夠準確。此外，上述方法還無法進行較詳細的定量研究。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種分析桑蠶絲絲素蛋白中氨基酸徑向分布的方法。本發(fā)明根據(jù)桑蠶絲絲素纖維徑向上氨基酸分布的特點，采用多次酶解法對絲素蛋白進行溶解，特異性高，作用條件溫和，對氨基酸的破壞小，使結(jié)果更準確。
本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：1.一種分析桑蠶絲絲素蛋白中氨基酸徑向分布的方法，其特征在于包括以下步驟：
1）稱取桑蠶絲作為樣品，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。
2）將烘干的樣品以1:95-105的浴比在含有0.4-0.6wt%na2po4和0.8-1.2wt%c17h35coona的混合溶液中煮沸25-35min，進行脫膠處理，共脫膠兩次。
本發(fā)明在脫膠過程中，加入c17h35coona緩沖劑，提高脫膠效率，同時減少對絲素纖維的傷害。
3）脫膠之后，將樣品用去離子水沖洗干凈，放入55-65℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。
4）取直徑相近的絲素纖維，等質(zhì)量分為a、b、c、d、e五組，其中a組作為對照組，不做任何處理。
5）將b、c、d、e組浸入到胰蛋白酶溶液中進行酶解，反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留b組殘余絲素。
6）將步驟5）酶解過的c、d、e組浸入到堿性蛋白酶溶液中進行酶解，反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留c組殘余絲素。
7）將步驟6）酶解過的d、e組浸入到木瓜蛋白酶溶液中進行酶解，反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留d組殘余絲素。
8）將步驟7）酶解過的e組浸入到胰彈性蛋白酶溶液中進行酶解，反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理。
9）對b、c、d、e組殘余絲素進行過濾和洗滌處理，得到在徑向上具有不同程度溶蝕的殘余絲素。
10）利用氨基酸自動分析儀對a和b、c、d、e組殘余絲素進行氨基酸分析，可得到各組中氨基酸的種類和含量。
與現(xiàn)有技術(shù)中只使用同一種水解方法、僅采用不同時長來控制對絲素纖維的腐蝕程度的方法相比，本發(fā)明人經(jīng)過長期研究，根據(jù)桑蠶絲其徑向上大概、粗略的氨基酸分布情況，每腐蝕一層絲素纖維時選用不同的蛋白酶。其依據(jù)是：絲素纖維徑向上不同部位，其氨基酸分布具有不同的特征，桑蠶絲絲素中存在多層次結(jié)構(gòu)，其表層無定形區(qū)的比例較高，里層結(jié)晶區(qū)的比例較高；側(cè)基較大的氨基酸和賴氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和酪氨酸等在絲素的表層分布較多，而甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸等小側(cè)基氨基酸在中間至里層分布較多。本發(fā)明根據(jù)每一層氨基酸的含量，選用不同的蛋白酶針對性的對該層進行酶解。利用每一種蛋白酶對不同氨基酸組成的蛋白質(zhì)酶解能力的不同，使得在對絲素纖維的每一層進行酶解時，只會對目標層的蛋白質(zhì)具有最好的酶解效果，而對于目標層內(nèi)層的蛋白質(zhì)的酶解效果較差。該方法能夠取得的技術(shù)效果是，在對目標層進行酶解時能夠使目標層徹底酶解殘留少，同時對目標層內(nèi)層的絲素蛋白的“誤傷”程度較小，從而實現(xiàn)對目標層的“精準腐蝕”，最終提高后續(xù)氨基酸檢測的準確性，進而分析其分布對蠶絲性能的影響。
作為優(yōu)選，步驟5）中酶解反應(yīng)具體為：將b、c、d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的胰蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度45-50℃，溶液ph7~9，反應(yīng)時間為6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留b組殘余絲素。
作為優(yōu)選，步驟6）中酶解反應(yīng)具體為：將步驟5）酶解過的c、d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的堿性蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度40~55℃，溶液ph9~10，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留c組殘余絲素。
作為優(yōu)選，步驟7）中酶解反應(yīng)具體為：將步驟6）酶解過的d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的木瓜蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度50~60℃，溶液ph6~7，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留d組殘余絲素。
作為優(yōu)選，步驟8）中酶解反應(yīng)具體為：將步驟7）酶解過的e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.0g/l的胰彈性蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度35~39℃，溶液ph8.5~9.2，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理。
桑蠶絲絲素中存在多層次結(jié)構(gòu)，表層無定形區(qū)的比例較高，里層結(jié)晶區(qū)的比例較高；側(cè)基較大的氨基酸和賴氨酸、組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和酪氨酸等在絲素的表層分布較多，而甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸等小側(cè)基氨基酸在中間至里層分布較多。在眾多蛋白酶中，胰蛋白酶的作用位點為精氨酸（arg）和賴氨酸（lys），主要分布在外層；木瓜蛋白酶的作用位點為精氨酸（arg）、賴氨酸（lys）、酪氨酸（tyr）和甘氨酸（gly），主要分布在外層和中層；堿性蛋白酶的作用位點是亮氨酸（leu）、酪氨酸（tyr）、丙氨酸（gly）和纈氨酸（val），主要分布在外層和中層；胰彈性蛋白酶的作用位點是丙氨酸(ala)、甘氨酸(gly)、絲氨酸(ser)、纈氨酸(val)，主要分布在內(nèi)層。所以依次選擇這四種蛋白酶對桑蠶絲絲素纖維進行水解。
作為優(yōu)選，步驟5）至步驟8）中的酶溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用；同時需要用0.1%na2co3溶液調(diào)節(jié)溶液ph。
作為優(yōu)選，步驟5）至步驟8）中滅酶處理為：在90℃的烘箱中保溫1h或改變?nèi)芤旱膒h使溶液呈現(xiàn)過酸或過堿，使酶失活。
與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明的有益效果是：
（1）本發(fā)明在脫膠過程中，加入c17h35coona緩沖劑，提高脫膠效率，同時減少對絲素纖維的傷害。
（2）本發(fā)明根據(jù)桑蠶絲絲素纖維徑向上氨基酸分布的特點，采用多次酶解法對絲素蛋白進行溶解，特異性高，作用條件溫和，對氨基酸的破壞小，使結(jié)果更準確。
（3）本發(fā)明中采用的生物酶無毒無害、與環(huán)境友好，同時用量少，節(jié)約資源。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。
實施例1
一種分析桑蠶絲絲素蛋白中氨基酸徑向分布的方法，包括以下步驟：
1）稱取桑蠶絲作為樣品，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。
2）將烘干的樣品以1:100的浴比在含有0.5wt%na2po4和1wt%c17h35coona的混合溶液中煮沸30min，進行脫膠處理，共脫膠兩次；
3）脫膠之后，將樣品用去離子水沖洗干凈，放入60℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。
4）取直徑相近的絲素纖維，等質(zhì)量分為a、b、c、d、e五組，其中a組作為對照組，不做任何處理。
5）將b、c、d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的胰蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度48℃，溶液ph8，反應(yīng)時間為6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留b組殘余絲素。
6）將步驟5）酶解過的c、d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的堿性蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度48℃，溶液ph9.5，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留c組殘余絲素。
7）將步驟6）酶解過的d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的木瓜蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度55℃，溶液ph6.5，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留d組殘余絲素。
8）將步驟7）酶解過的e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.0g/l的胰彈性蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度37℃，溶液ph8.9，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理。
9）對b、c、d、e組殘余絲素進行過濾和洗滌處理，得到在徑向上具有不同程度溶蝕的殘余絲素。
10）利用氨基酸自動分析儀對a和b、c、d、e組殘余絲素進行氨基酸分析，可得到各組中氨基酸的種類和含量。
其中，在步驟5）至步驟8）中的酶溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用；同時需要用0.1%na2co3溶液調(diào)節(jié)溶液ph。在90℃的烘箱中保溫1h或改變?nèi)芤旱膒h使溶液呈現(xiàn)過酸或過堿，使酶失活。
實施例2
一種分析桑蠶絲絲素蛋白中氨基酸徑向分布的方法，包括以下步驟：
1）稱取桑蠶絲作為樣品，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。
2）將烘干的樣品以1:95的浴比在含有0.4wt%na2po4和0.8wt%c17h35coona的混合溶液中煮沸35min，進行脫膠處理，共脫膠兩次；
3）脫膠之后，將樣品用去離子水沖洗干凈，放入55℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。
4）取直徑相近的絲素纖維，等質(zhì)量分為a、b、c、d、e五組，其中a組作為對照組，不做任何處理。
5）將b、c、d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的胰蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度45℃，溶液ph7，反應(yīng)時間為6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留b組殘余絲素。
6）將步驟5）酶解過的c、d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的堿性蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度40℃，溶液ph9，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留c組殘余絲素。
7）將步驟6）酶解過的d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的木瓜蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度50℃，溶液ph6，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留d組殘余絲素。
8）將步驟7）酶解過的e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.0g/l的胰彈性蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度35℃，溶液ph8.5，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理。
9）對b、c、d、e組殘余絲素進行過濾和洗滌處理，得到在徑向上具有不同程度溶蝕的殘余絲素。
10）利用氨基酸自動分析儀對a和b、c、d、e組殘余絲素進行氨基酸分析，可得到各組中氨基酸的種類和含量。
其中，在步驟5）至步驟8）中的酶溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用；同時需要用0.1%na2co3溶液調(diào)節(jié)溶液ph。在90℃的烘箱中保溫1h或改變?nèi)芤旱膒h使溶液呈現(xiàn)過酸或過堿，使酶失活。
實施例3
一種分析桑蠶絲絲素蛋白中氨基酸徑向分布的方法，包括以下步驟：
1）稱取桑蠶絲作為樣品，用去離子水清洗，去除表面污染物，烘干。
2）將烘干的樣品以1:105的浴比在含有0.6wt%na2po4和1.2wt%c17h35coona的混合溶液中煮沸25min，進行脫膠處理，共脫膠兩次；
3）脫膠之后，將樣品用去離子水沖洗干凈，放入65℃烘箱，得到干燥的絲素纖維。
4）取直徑相近的絲素纖維，等質(zhì)量分為a、b、c、d、e五組，其中a組作為對照組，不做任何處理。
5）將b、c、d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的胰蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度50℃，溶液ph9，反應(yīng)時間為6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留b組殘余絲素。
6）將步驟5）酶解過的c、d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的堿性蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度55℃，溶液ph10，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留c組殘余絲素。
7）將步驟6）酶解過的d、e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.5g/l的木瓜蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度60℃，溶液ph7，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理，保留d組殘余絲素。
8）將步驟7）酶解過的e組以1:40的浴比放入預(yù)先配制好的1.0g/l的胰彈性蛋白酶溶液中，控制反應(yīng)溫度38℃，溶液ph9.2，繼續(xù)反應(yīng)6h；反應(yīng)完成后，對酶進行滅活處理。
9）對b、c、d、e組殘余絲素進行過濾和洗滌處理，得到在徑向上具有不同程度溶蝕的殘余絲素。
10）利用氨基酸自動分析儀對a和b、c、d、e組殘余絲素進行氨基酸分析，可得到各組中氨基酸的種類和含量。
其中，在步驟5）至步驟8）中的酶溶液需要現(xiàn)配現(xiàn)用；同時需要用0.1%na2co3溶液調(diào)節(jié)溶液ph。在90℃的烘箱中保溫1h或改變?nèi)芤旱膒h使溶液呈現(xiàn)過酸或過堿，使酶失活。
本發(fā)明中所用原料、設(shè)備，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常用原料、設(shè)備；本發(fā)明中所用方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。