基于兩端非等重標(biāo)記的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及標(biāo)記輔助的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法，具體地說是一種通過對多肽的N端和C端分別進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記以鑒別碎片離子的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)是重要的生物大分子，在生命活動中發(fā)揮著重要作用。對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序?qū)τ诘鞍踪|(zhì)一級結(jié)構(gòu)的分析至關(guān)重要。盡管目前有些物種存在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可以用搜庫的方法對蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行分析。但是，大多數(shù)物種仍然沒有可供檢索的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，并且對于已經(jīng)存在數(shù)據(jù)庫的物種，由于基因變異也會導(dǎo)致其蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生變化。因此，非常有必要發(fā)展不依賴于數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法。文獻(xiàn)報(bào)道中對蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行從頭測序的方法主要有以下幾種:(1)通過對多肽的N端，使用帶有酸性基團(tuán)的試劑進(jìn)行衍生，然后使用MALDI質(zhì)譜進(jìn)行分析，使得多肽碎片片段基本不含有a、b離子，主要以y離子形式存在，從而可以對y離子進(jìn)行鑒別，實(shí)現(xiàn)對多肽的從頭測序；(2)通過對多肽的N端，使用帶有堿性基團(tuán)的試劑進(jìn)行衍生，然后使用MALDI質(zhì)譜進(jìn)行分析，使得多肽碎片片段基本不含有y離子，主要以a或者b離子形式存在，從而可以對其進(jìn)行鑒別，實(shí)現(xiàn)對多肽的從頭測序。
[0003]多肽兩端穩(wěn)定同位素標(biāo)記方法是蛋白質(zhì)組學(xué)中一種常用的定量方法，通過在多肽N端和C端分別進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)兩個或者多個樣品中的肽段質(zhì)量相同或者相近，并且在色譜分離過程中具有相同或者相近的保留時間，從而在隨后的質(zhì)譜分析中同時碎裂，所形成的碎片離子具有一定的質(zhì)量差；通過比較不同樣品中碎片離子的質(zhì)譜信號強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)不同樣品中多肽和蛋白質(zhì)的定量(Koehler CJ, Arntzen MO, Treumann A, Thiede B,Anal.B1anal.Chem.，2012，404 (4)，1103-1114)。如前所述，目前的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法，主要通過對一個樣品的多肽一端或者兩端進(jìn)行衍生，使多肽在碎裂時主要產(chǎn)生一個系列的碎片離子，從而簡化離子碎片種類，進(jìn)行從頭測序。但是，由于多肽的碎裂機(jī)理比較復(fù)雜，即使對多肽進(jìn)行前述處理，多肽在碎裂時仍然會產(chǎn)生其它碎片離子，因此特異性不高，影響從頭測序的準(zhǔn)確性；此外，隨著氨基酸序列長度的增加，較大的碎片離子其產(chǎn)生的幾率和強(qiáng)度都會降低，不利于從頭測序。為此，我們通過將同一個樣品分成兩份，分別對其中的多肽兩端進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記，通過在質(zhì)譜分析時形成的成對碎片離子，提高碎片離子辨別的準(zhǔn)確度；通過對多肽的兩端進(jìn)行不同的標(biāo)記，使得多肽的b離子和y離子對質(zhì)量差異不同，而分辨b離子和y離子；利用b離子和y離子的互補(bǔ)性，實(shí)現(xiàn)對長序列多肽的準(zhǔn)確從頭測序。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序比較困難，由于多肽碎裂機(jī)理復(fù)雜，造成質(zhì)譜圖的復(fù)雜性和難以準(zhǔn)確分辨碎片離子。同位素標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)定量，通過對不同樣品進(jìn)行不同同位素標(biāo)記，混合后樣品在一級譜或者二級譜存在質(zhì)量差異，從而可以被分辨，并利用一級譜或者二級譜的峰面積或者強(qiáng)度進(jìn)行定量。本發(fā)明的目的是利用對多肽兩端進(jìn)行同位素標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對多肽b和y系列碎片離子的鑒別，提高從頭測序的準(zhǔn)確度和速度。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]對蛋白質(zhì)進(jìn)行變性，還原和烷基化后，使用胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸-C對其進(jìn)行酶解；酶解產(chǎn)物分成兩份后，使用含有不同輕重同位素的標(biāo)記試劑對其N端氨基和C端賴氨酸進(jìn)行標(biāo)記，使兩份樣品中多肽的分子量差異不大于2Da，并且其質(zhì)譜中b離子及y離子的質(zhì)量差異均大于4Da ;對標(biāo)記后的肽段，混合后使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分析。分析時通過適當(dāng)擴(kuò)大碎裂窗口寬度，實(shí)現(xiàn)對不同標(biāo)記肽段的同時碎裂。根據(jù)產(chǎn)生的碎片離子對質(zhì)量差來鑒別b離子和y離子，從而實(shí)現(xiàn)對多肽的從頭測序。
[0007]所述蛋白質(zhì)氨基酸序列的從頭測序方法，具體步驟如下:
[0008](1)蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理:對蛋白質(zhì)采用熱變性或者尿素變性，時間為1-2小時；使用10mM DTT對蛋白質(zhì)變性的冋時進(jìn)彳丁還原；變形和還原完成后，加入鵬代乙酷胺在黑暗中放置1小時，對蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化。然后將溶液用50mM磷酸鈉(pH7.5)將尿素濃度稀釋到0.8M，按照底物/酶比25/1 (w:w)加入胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸-C，在37°C下孵育過夜。
[0009](2)多肽兩端非等重標(biāo)記:將蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物分成兩份，一份用含有輕同位素的標(biāo)記試劑對多肽N端氨基進(jìn)行衍生，通過控制反應(yīng)溶液的pH值保證衍生的選擇性，然后用含有重同位素的標(biāo)記試劑對多肽C端氨基酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行衍生或者在培養(yǎng)細(xì)胞時，通過加入含有重同位素賴氨酸的培養(yǎng)液實(shí)現(xiàn)對賴氨酸的標(biāo)記；對另一份樣品，用含有重同位素的標(biāo)記試劑對多肽N端氨基進(jìn)行衍生，通過控制反應(yīng)溶液的pH值保證衍生的選擇性，然后用含有輕同位素的標(biāo)記試劑對多肽C端氨基酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行衍生或者在培養(yǎng)細(xì)胞時，通過加入含有輕同位素賴氨酸的培養(yǎng)液實(shí)現(xiàn)對賴氨酸的標(biāo)記。
[0010]在進(jìn)行同位素標(biāo)記時，多肽N端被元素相同但同位素不同標(biāo)記試劑標(biāo)記后的質(zhì)量差異大于或者等于4Da，以防止多肽碎裂形成碎片時同位素的干擾；同樣，多肽C端賴氨酸被不同標(biāo)記試劑標(biāo)記后，由于標(biāo)記引起的質(zhì)量變化之差異大于或者等于4Da，以防止多肽碎裂形成碎片時同位素的干擾。
[0011](3)標(biāo)記多肽的質(zhì)譜分析:將不同標(biāo)記的多肽樣品按照1:1的比例混合后，使用反相高效液相色譜進(jìn)行分離，電噴霧質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。為了保證不同標(biāo)記的肽段同時碎裂，將碎裂窗口寬度設(shè)為4Da。
[0012]發(fā)明的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法可以應(yīng)用于未知序列蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確和快速測序。
[0013]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0014]1.本發(fā)明對蛋白質(zhì)酶解多肽的兩端氨基進(jìn)行標(biāo)記，反應(yīng)效率和選擇性高。
[0015]2.本發(fā)明通過將蛋白質(zhì)多肽樣品分成兩份，對其兩端氨基進(jìn)行不同同位素標(biāo)記，使得兩份樣品中多肽的質(zhì)量差不超過2Da，在質(zhì)譜分析中同時被碎裂，形成的二級碎片離子其b離子和y離子均以成對形式存在，利于被分辨，提高了碎片離子鑒定的特異性，有利于準(zhǔn)確的從頭測序。
[0016]3.本發(fā)明通過對兩份多肽樣品兩端氨基進(jìn)行不同同位素標(biāo)記，在質(zhì)譜中碎裂后形成的b離子對之間的質(zhì)量差和1離子對之間的質(zhì)量差不同，從而可以分辨b和y系列碎片離子，有利于準(zhǔn)確的從頭測序。
【附圖說明】
[0017]圖1為蛋白質(zhì)多狀兩端甲基化標(biāo)記實(shí)驗(yàn)流程圖；
[0018]圖2為使用液相色譜-質(zhì)譜對甲基化標(biāo)記的多肽進(jìn)行分析獲得的二級質(zhì)譜圖；
[0019]圖3為蛋白質(zhì)多肽C端代謝標(biāo)記和N端的丁二酸酐標(biāo)記實(shí)驗(yàn)流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明提供的方法進(jìn)行詳述，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0021]實(shí)施例1
[0022]1.基于二甲基化標(biāo)記的蛋白質(zhì)酶解多肽兩端標(biāo)記
[0023]如圖1所示，按如下流程進(jìn)行標(biāo)記:
[0024]1)蛋白質(zhì)樣品的變性、還原、燒基化和酶解:將100微克蛋白質(zhì)溶于1 _升8M尿素中，加入100微升10mM 二硫蘇糖醇，在56°C水浴中放置2小時，然后加入100微升20mM碘代乙酰胺在黑暗中放置1小時。最后將溶液用50mM磷酸鈉(pH7.5)將尿素濃度稀釋到
0.8M，然后按照底物/酶比25/1 (w:w)加入胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸-C，在37°C下孵育過夜。
[0025]2)多肽兩端二甲基化標(biāo)記:將1)獲得的多肽樣品分成兩等份，
[0026]第一份上柱(C18預(yù)柱)除鹽后，使用甲醛溶液(5 μ L0.6Μ氰基硼氫化鈉和55 μ L甲醛(4%，v:v)溶解在lmLl%醋酸中，pH2.8中)對多肽N端進(jìn)行標(biāo)記。使用1毫升過量
0.1%甲酸除去標(biāo)記試劑和使用5毫升50mM磷酸鈉(pH7.5)溶液對預(yù)柱進(jìn)行平衡后，對多肽的C端賴氨酸側(cè)鏈ε氨基使用含有4%氘代甲醛和60mM氰基硼氫化鈉的50mM磷酸鈉緩沖溶液(PH7.5)進(jìn)行標(biāo)記和還原。
[0027]對于第二份樣品，使用同樣的標(biāo)記方法進(jìn)行二甲基化標(biāo)記。不同之處是對多肽N端使用含有4%氘代甲醛和60mM