氘代氰基硼氫化鈉的lmLl %醋酸溶液進(jìn)行標(biāo)記，對(duì)C端賴氨酸側(cè)鏈ε氨基使用含有4%氘代甲醛和60mM氰基硼氫化鈉的1毫升50mM磷酸鈉溶液進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)N端的標(biāo)記時(shí)間為10分鐘，而對(duì)C端的標(biāo)記時(shí)間為20分鐘。
[0028]標(biāo)記后的多肽使用80%乙腈溶液洗脫后，使用真空蒸干。
[0029]3)標(biāo)記多肽的質(zhì)譜分析:標(biāo)記后的兩份樣品混合后，使用Triple_T0F5600plus質(zhì)譜(AB SCIEX, USA)和nano UPLC系統(tǒng)(Eskigent, USA)進(jìn)行分離和分析。流動(dòng)相A和B(V/V)分別為97.9%水/2%乙腈/0.1%甲酸及97.9%乙腈/2%水/0.1%甲酸。在流速為500nL/min的100% A流動(dòng)相下，上樣到預(yù)柱(75 μ m 1.d.X5cm)上，然后被洗脫到分析柱(75 μ m 1.d.X 20cm)上。流速設(shè)為300nL/min，流動(dòng)相梯度為:在0到45分鐘內(nèi)從5%到22% B，在45-60分鐘內(nèi)從22 % B到35 % B，在60-65分鐘內(nèi)從35 % B到80 % B。在使用80%的流動(dòng)相B沖洗柱子5分鐘后，使用98%的流動(dòng)相A平衡15分鐘。
[0030]Triple-T0F5600plus的噴霧電壓設(shè)為2.6kV。一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為350到1250Da (電荷數(shù)從+2到+5，cps>80,累積時(shí)間0.25s)，后面跟隨60個(gè)二級(jí)掃描(掃描范圍從100到1500Da，累積時(shí)間為0.04s)。分離窗口設(shè)為4Da，獲得的多肽二級(jí)質(zhì)譜圖如圖2所示。獲得的原始二級(jí)質(zhì)譜圖(圖2(a))中含有很多碎片離子，難以分辨出b和y離子。根據(jù)多肽兩端標(biāo)記形成的碎片離子對(duì)之間的質(zhì)量差異(b離子相差4.0251Da，y離子質(zhì)量差異為6.0318Da)，可以分辨出b離子(圖2(b))和y離子(圖2(c));分辨出的b，y離子使得質(zhì)譜圖大大簡(jiǎn)化，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量差異可以推導(dǎo)出多肽的序列(如圖2(b)和圖2(c)所示)。
[0031]實(shí)施例2
[0032]基于代謝標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記的蛋白質(zhì)酶解多肽兩端標(biāo)記
[0033]該實(shí)施例中采取了不同的多肽兩端標(biāo)記方法，對(duì)于多肽的分離和鑒定方法與上例相同。
[0034]1.細(xì)胞培養(yǎng)和代謝標(biāo)記:對(duì)于Hela細(xì)胞，使用含有10%胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。為了對(duì)賴氨酸進(jìn)行標(biāo)記，使用不含有L-賴氨酸的DMEM以及透析過的胎牛血清?！拜p”培養(yǎng)液中加入L-賴氨酸(146 μ g/ml)，“重”培養(yǎng)液中含有同樣濃度的[13C]L-賴氨酸。
[0035]2.蛋白質(zhì)提取和預(yù)處理:細(xì)胞收集后，溶解在含有8M尿素和蛋白酶抑制劑的緩沖溶液中。裂解液進(jìn)行三次超聲后，離心收集上清液。輕標(biāo)和重標(biāo)的蛋白質(zhì)使用10mM 二硫蘇糖醇進(jìn)行還原，在50mM碳酸氫鈉溶液中和56°C下還原1小時(shí)，然后在黑暗中室溫下使用含有55mM碘代乙酰胺的50mM碳酸氫鈉溶液烷基化45分鐘-1小時(shí)。
[0036]3.蛋白質(zhì)酶解:按照50:1 (w/w)的底物/酶比例，使用胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸_C在37°C下在50mM碳酸氫鈉溶液中(pH7.5)對(duì)輕重標(biāo)記的蛋白質(zhì)分別過夜酶解。
[0037]4.多肽N端標(biāo)記:首先對(duì)前述輕重標(biāo)記的多肽C端賴氨酸側(cè)鏈氨基進(jìn)行胍基化。在1ml溶液中加入40 μ L含有2Μ 0-甲基異脲的lOOmM碳酸氫鈉溶液，用2M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至11，在37°C下反應(yīng)2小時(shí)。然后通過加入10%的三氟乙酸終止反應(yīng)，并將溶液pH調(diào)節(jié)到8.0。按照實(shí)施例1中的方法對(duì)重代謝標(biāo)記的肽段使用甲醛進(jìn)行甲基化，對(duì)輕代謝標(biāo)記的多肽使用氘代甲醛進(jìn)行甲基化。反應(yīng)后的樣品按照1:1比例混合后進(jìn)行液相色譜_質(zhì)譜分析。
[0038]本發(fā)明通過標(biāo)記形成成對(duì)存在的多肽碎片離子而加以分辨，可以有效降低干擾信號(hào)的影響，提高碎片離子選擇的特異性和多肽測(cè)序的準(zhǔn)確度；同時(shí)通過標(biāo)記引起b，y碎片離子對(duì)不同的質(zhì)量差異，實(shí)現(xiàn)對(duì)b，y離子的分辨，簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測(cè)序算法，提聞了從頭測(cè)序的速度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.基于兩端非等重標(biāo)記的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測(cè)序方法，其特征在于:對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性后，對(duì)其中含有的二硫鍵進(jìn)行還原，然后用烷基化試劑封閉自由巰基；對(duì)處理后的蛋白質(zhì)采用胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸-C進(jìn)行酶切；酶切后形成的多肽，使用化學(xué)/代謝標(biāo)記的方法對(duì)多肽N端的α-氨基和C端賴氨酸側(cè)鏈氨基分別進(jìn)行標(biāo)記；在進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，將樣品分成等量的兩份，分別使用含有不同同位素的輕重標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，使一份樣品中的多肽Ν端采用輕標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記、多肽C端采用重標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，使另一份樣品中的多肽Ν端采用重標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記、多肽C端采用輕標(biāo)記試劑進(jìn)行標(biāo)記，且使得二份樣品間輕重標(biāo)記的相同肽段的分子量相差不超過2Da ;將標(biāo)記后的二份樣品混合，使用一維或者二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分離和鑒定；在質(zhì)譜鑒定時(shí)，將分離窗口設(shè)置為2_8Da，使得不同標(biāo)記的多肽同時(shí)碎裂；根據(jù)同位素標(biāo)記引起的多肽碎片離子質(zhì)量差異鑒別b(N端)，y(C端)離子，進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測(cè)序分析。2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 蛋白質(zhì)的變性方式包括:熱變性或尿素變性； 使用二硫蘇糖醇對(duì)二硫鍵進(jìn)行還原； 封閉自由巰基的烷基化試劑包括:碘代乙酰胺、碘乙酸、甲基甲烷巰基磺酸或N-乙基馬來酰亞胺。3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:用胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸-C進(jìn)行酶切，其中胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸-c的用量為蛋白質(zhì)質(zhì)量的1%至10%。4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:對(duì)蛋白質(zhì)酶解多肽的兩端標(biāo)記，包括化學(xué)標(biāo)記和/或代謝標(biāo)記； 化學(xué)標(biāo)記法包括任何可以與氨基發(fā)生反應(yīng)的化學(xué)試劑；醛，酸，酸酐，酰氯，酯中的一種； 代謝標(biāo)記法包括同位素(12c及13c，、14n及15n，或Η及氘)標(biāo)記的賴氨酸，通過在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入標(biāo)記的賴氨酸，從而產(chǎn)生賴氨酸被標(biāo)記的蛋白質(zhì)。5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:對(duì)標(biāo)記后的肽段，使用電噴霧質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)；為了使不同標(biāo)記的多肽能夠同時(shí)碎裂，將二級(jí)碎裂窗口設(shè)為3-4Da，即母離子質(zhì)荷比左右各3-4Da的母離子被同時(shí)碎裂。6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:為了實(shí)現(xiàn)多肽碎片離子的分辨以及多肽母離子的同時(shí)碎裂，對(duì)于分成兩等份的樣品，一份樣品用含有輕同位素的標(biāo)記試劑對(duì)其N端進(jìn)行標(biāo)記，使用含有重同位素的標(biāo)記試劑對(duì)其C端賴氨酸進(jìn)行標(biāo)記；對(duì)于另一份樣品，則使用含有重同位素的標(biāo)記試劑對(duì)其N端進(jìn)行標(biāo)記，使用含有輕同位素的標(biāo)記試劑對(duì)其C端賴氨酸進(jìn)行標(biāo)記； 同位素標(biāo)記試劑指含有不同輕重同位素(如12c及13C、14N及15N，或Η及氘)的標(biāo)記試劑。7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:根據(jù)同位素標(biāo)記引起的兩份樣品中多肽碎片b (Ν端)離子質(zhì)量差異MDb，從多肽二級(jí)譜圖中挑選成對(duì)存在且質(zhì)量差異為MDb的b (N端)離子，根據(jù)同位素標(biāo)記引起的兩份樣品中多肽碎片y(C端)離子質(zhì)量差異MDy，從多肽二級(jí)譜圖中挑選成對(duì)存在且質(zhì)量差異為MDy的y (C端)離子，根據(jù)不同碎片離子之間的質(zhì)量差異判斷存在的氨基酸種類，進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測(cè)序分析。8.按照權(quán)利要求1所述的從頭測(cè)序方法，可用于快速準(zhǔn)確的未知序列蛋白質(zhì)測(cè)序和鑒定。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于多肽兩端非等重穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測(cè)序方法。以胞內(nèi)蛋白酶賴氨酸-C對(duì)變性還原烷基化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，形成含有N端α-氨基和C端賴氨酸側(cè)鏈ε-氨基的肽段。樣品分成兩份后，使用含有不同同位素的標(biāo)記試劑對(duì)多肽N端α-氨基進(jìn)行選擇性衍生；再使用含有不同同位素的標(biāo)記試劑對(duì)多肽C端賴氨酸ε-氨基進(jìn)行衍生或者在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，使用含有同位素標(biāo)記賴氨酸的培養(yǎng)液來實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)中賴氨酸的標(biāo)記。最后，將樣品混合，使用高效液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分離和鑒定。本發(fā)明通過標(biāo)記形成成對(duì)存在的多肽碎片離子而加以分辨，降低干擾信號(hào)的影響，提高碎片離子選擇特異性和多肽測(cè)序準(zhǔn)確度；提高從頭測(cè)序的速度。
【IPC分類】G01N30/02
【公開號(hào)】CN105301119
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410336907
【發(fā)明人】張麗華, 單亦初, 張珅, 吳琪, 張玉奎
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2014年7月15日