專利名稱：細胞外基質(zhì)蛋白的氨基酸序列rgd的特異性人源化抗體及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫特異性地識別細胞外基質(zhì)蛋白的氨基酸序列 RGD (Arg-Gly-Asp)的人源化抗體(humanized antibody)，和該人源化抗體用于治療和
診斷包括癌癥、炎癥性疾病、自身免疫病、傳染病和骨病等在內(nèi)的多種疾病或病癥的應用。在本臨時申請中引用了多個出版物(包括專利和專利申請)。這些出版物的公開 內(nèi)容通過引用整體并入本臨時申請，以更全面地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。
2.
背景技術(shù)：
細胞粘附在多細胞生物體的生命維持中發(fā)揮重要作用。多細胞生物體的細胞粘 附分類為細胞_細胞外基質(zhì)(下文簡稱為“ECM” )粘附和細胞-細胞粘附。已經(jīng)闡明 細胞-ECM粘附由整合素(integrin)介導，細胞-細胞粘附由鈣粘蛋白(cadherin)、封閉 蛋白(claudin)和柄蛋白(nectin)介導。跨膜粘附蛋白(例如整合素)形成細胞-ECM粘附。整合素形成α鏈和β鏈 的異源二聚體。目前已經(jīng)鑒別并確認了至少18種類型的α鏈，8種類型的β鏈和24種 類型的α β異源二聚體。各種類型的整合素識別特異的配體。除了細胞粘附外，包括 整合素在內(nèi)的跨膜粘附蛋白還與從ECM至細胞的細胞內(nèi)信號傳導、增殖調(diào)控、移動以及 分化有關(guān)(F.G Giancotti，et.al.，Science, 285，1028-1032，1999)。已知許多蛋白都是ECM蛋白，所述ECM蛋白分類為膠原蛋白(例如I-XIX 型)、非膠原糖蛋白(例如骨橋蛋白(osteopontin，OPN))、玻連蛋白(vitronectin)、纖連 蛋白(fibronectin)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor)、層粘連蛋白(Iaminin)、腱 生蛋白(tenascin)、纖維蛋白原(fibrinogen)、血小板反應蛋白(thrombospondin))、彈性 蛋白(elastin)和蛋白聚糖。這些ECM蛋白與相應的整合素結(jié)合并激活細胞內(nèi)信號傳導通 路，從而調(diào)控細胞骨架形成、移動、增殖和分化等。與ECM蛋白結(jié)合的整合素根據(jù)ECM 蛋白的類型傳遞特異信號，由此調(diào)控這些信號激活通路。在許多ECM蛋白的細胞粘附區(qū) 常觀察到RGD序列，該序列通過與整合素結(jié)合而具有多種功能。ECM蛋白的RGD序列 已經(jīng)被認為是可能的藥物靶標，并且已經(jīng)產(chǎn)生了多種小分子化合物和人工肽。已知一些類型的整合素，例如α3β1整合素、α5β1整合素、α8β1整合素、 ανβ 整合素、α νβ 3整合素、α νβ 5整合素、α νβ 6整合素、α νβ 8整合素與RGD 序列結(jié)合。α 5β1整合素與其特異性配體纖連蛋白之間的相互作用激發(fā)了對整合素介 導的信號傳導機制的研究。所述研究表明，α 5β1整合素不僅調(diào)控細胞粘附和細胞移 動，還調(diào)控細胞分化和細胞死亡。(S.M.Frischetal.，Curr.Opin.Cell Biol., 9，701-706， 1997)。還表明，α 5β1整合素在腫瘤細胞中高表達，并與癌癥的惡性改變有關(guān)。各整 合素介導的信號根據(jù)所結(jié)合的ECM蛋白而不同，例如，生長因子的刺激激活與纖連蛋白 結(jié)合的內(nèi)層細胞的生長，而抑制與層粘連蛋白-1結(jié)合的內(nèi)層細胞的生長。另外，由層粘連蛋白-10/11向α 3β1整合素傳遞的信號不同于由纖連蛋白向α5β1整合素傳遞的信 號，前者顯著增強了癌細胞的移動(J.Guetal.，J.Biol.Chem.，276，27090-27097，2001) 并通過血液饑餓有效避免凋亡(J.Guetal.，J.Biol.Chem., 277，19922-19928，2002)。觀 察到與α ν整合素結(jié)合的RGD序列在破骨細胞和新生血管中高表達，因此認為抑制RGD 序列和α ν整合素是治療骨質(zhì)疏松癥和癌癥的藥物的靶標。已經(jīng)表明，α5β1整合素在 腫瘤細胞上高表達，并與癌癥的惡性改變有關(guān)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)開發(fā)了抗_α5β1 整合素抗體(Volocimab)、抗-α 4整合素抗體(Natalizumab)禾Π抗-α ν β 3整合素抗體 (Vitaxin)作為抑制整合素和ECM蛋白之間相互作用的抗-整合素抗體拮抗藥。同時，已知一些ECM蛋白，例如膠原蛋白、骨橋蛋白(OPN)、玻連蛋白、纖 連蛋白、血管性血友病因子、層粘連蛋白、腱生蛋白、纖維蛋白原和血小板反應蛋白包 含RGD序列。另外，還已知一些病毒和一些細菌具有RGD序列，從而粘附至細胞上。 OPN是具有與骨中富含的鈣相結(jié)合的性質(zhì)的酸性糖蛋白。據(jù)報道，OPN在細胞粘附、細 胞遷移、腫瘤形成、免疫應答和補體介導的細胞裂解中發(fā)揮重要作用。OPN敲除小鼠和 抗-OPN中和抗體的結(jié)果表明，OPN與肝炎、自身免疫病(例如類風濕性關(guān)節(jié)炎)和癌 的轉(zhuǎn)移有關(guān)。已經(jīng)指出，抑制ECM蛋白與細胞結(jié)合的抑制劑可用于治療骨質(zhì)疏松癥或癌 癥。因此，除了上述靶向整合素的拮抗藥外，還開發(fā)了靶向作為整合素結(jié)合伴侶的ECM 蛋白的拮抗藥。3.發(fā)明概述雖然已經(jīng)報道了諸如抑制RGD序列介導的與整合素的相互作用的小分子、抗 OPN抗體和抗整合素抗體的藥物，但還沒有關(guān)于特異識別RGD序列的抗體的報道。由 于RGD序列是ECM蛋白的保守序列之一，特異識別RGD序列的抗體可在人和治療性模 型動物中均發(fā)揮作用，并因此可以被認為是用于治療劑開發(fā)的非常有用的活性成分。因 此，需要特異識別RGD序列的此類抗體。本發(fā)明人之前分離了免疫特異性地識別RGD序列的小鼠單克隆抗體，并通過雜 交瘤克隆33Ε10和35Β6 (保藏編號分別為FERM ΒΡ-10440和FERMBP-10441)產(chǎn)生該抗 體。在本發(fā)明中，雜交瘤克隆名稱可與由所述克隆產(chǎn)生的單克隆抗體名稱互換使用。所 有這些小鼠抗-RGD抗體都為IgGl同型。觀察到這些單克隆抗體通過與諸如骨橋蛋白的 ECM蛋白的RGD序列結(jié)合而干擾RGD序列介導的ECM和細胞之間的結(jié)合。因此，這 些抗-RGD抗體對與RGD序列相關(guān)的疾病可具有治療或診斷作用，所述與RGD序列相 關(guān)的疾病為，例如癌癥，如癌細胞的生長或轉(zhuǎn)移，和炎癥性疾病，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、 骨關(guān)節(jié)炎、傳染病、肝炎、支氣管哮喘、纖維化、糖尿病、動脈硬化、多發(fā)性硬化、肉 芽腫、炎癥性腸病(潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病)、自身免疫病、骨質(zhì)疏松癥等。然而，由于這些單克隆抗體都為小鼠源的，由于其免疫原性而可能在人中產(chǎn)生 的不利作用阻礙了其直接應用于人的診斷或治療應用。為了降低免疫原性，本發(fā)明人制 備了人源化抗體，該人源化抗體具有與人源化抗體所來源的原始小鼠抗-RGD抗體所表 現(xiàn)的生物活性相應的生物活性。 因此，本發(fā)明提供了免疫特異性地識別RGD序列的人源化抗體或其抗原結(jié)合片 段，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含部分來源于非人來源和部分來源于人來源的 抗原結(jié)合區(qū)。在一些實施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含來源于非人來源(供體，例如33E10和35B6單克隆抗體)的互補決定區(qū)(下文簡稱為“CDR” ) 和來源于人來源(接受體(acceptor))的框架區(qū)(下文簡稱為“FR”)。所述人源化抗體 或其抗原結(jié)合片段可抑制RGD序列和其配體之間的結(jié)合。在具體實施方式
中，免疫特異性地識別RGD序列的所述人源化抗體或其抗原結(jié) 合片段包含ω重鏈(下文簡稱為“H-鏈”)，其包含源自人Η-鏈的可變區(qū)(下文簡 稱為“V-區(qū)”)的至少一個H-鏈FR(下文簡稱為“FRH”)，和源自免疫特異性地識 別RGD序列的非人抗體的H-鏈CDR(下文簡稱為“CDRH” )中的至少一個的至少一個 CDRH ；或者(ii)輕鏈(下文簡稱為“L-鏈”)，其包含源自人L-鏈的V-區(qū)的至少一個 L-鏈FR(下文簡稱為“FRL”)，和源自免疫特異性地識別RGD序列的非人抗體的L-鏈 CDR(下文簡稱為“CDRL” )中的至少一個的至少一個CDRL ；或者上述(i)和(ii)兩 者。在一個實施方式中，所述本發(fā)明的人源化抗體的CDRH中的至少一個和/或CDRL 中的至少一個可以源自由選自保藏編號為FERM BP-10440和FERMBP-10441的雜交瘤 產(chǎn)生的單克隆抗體。在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含
(i)源自人FRH的至少一個FRH，和包含選自氨基酸序列SEQIDN0: 1、2和3的氨基 酸序列的至少一個CDRH ；或者(ii)源自人FRL的至少一個FRL，和包含選自氨基酸序 列SEQ ID NO 4、5和6的氨基酸序列的至少一個CDRL ；或者(iii)上述(i)和(ii)兩 者。在一些實施方式中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含在CDRHl 的 SEQ ID NO 1、在 CDRH2 的 SEQ ID NO 2 和在 CDRH3 的 SEQ ID NO 3。在一 些實施方式中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含在CDRLl的SEQ ID NO 4、在 CDRL2 的 SEQ ID NO 5 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO 6。優(yōu)選地，本發(fā)明 的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含在CDRHl的SEQ ID NO 1、在CDRH2的SEQ ID NO 2、在 CDRH3 的 SEQ ID NO 3、在 CDRLl 的 SEQ ID NO 4、在 CDRL2 的 SEQ ID NO 5 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO 6。在一些具體實施方式
中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含源自 由GenBank登錄號X65891 (SEQ ID NO 13)編碼的人H-鏈的V-區(qū)的FRH或者源自由 GenBank登錄號X72441 (SEQ ID NO 18)編碼的人κ -L-鏈的V-區(qū)的FRL。在一些 實施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的FRH包含選自氨基酸序列SEQIDN0 : 14、15、16 和17(分別為Χ65891的氨基酸序列FRH1、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一個氨基酸序 列。在一些實施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的FRL包含選自氨基酸序列SEQIDN0 : 19、20、21和22(分別為Χ72441的氨基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一 個氨基酸序列。在一個最優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包 含G)包含氨基酸序列SEQ ID NO 24的H-鏈的V_區(qū)(下文簡稱為“ VH” )；或者
(ii)包含氨基酸序列SEQID NO 26的L-鏈的V_區(qū)(下文簡稱為“ VL” ) ； (iii)上述 (i)和(ii)兩者。 在其它實施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含ω源自人 FRH的至少一個FRH，和包含選自氨基酸序列SEQ ID NO 7、8和9的氨基酸序列的至 少一個CDRH ；或者(ii)源自人FRL的至少一個FRL，和包含選自氨基酸序列SEQ ID NO 10、11和12的氨基酸序列的至少一個CDRL ；或者(iii)上述(i)和(ii)兩者。在 一些實施方式中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可以包含在CDRHl的SEQID NO 7、在 CDRH2 的 SEQ ID NO 8 和在 SEQ ID NO 9 的 CDRH3。在一些實施方 式中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含在CDRLl的SEQ ID NO: 10、在 CDRL2的SEQ IDNO 11和在CDRL3的SEQ IDNO 12。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述人源 化抗體或其抗原結(jié)合片段包含在CDRHl的SEQ ID NO 7、在CDRH2的SEQ ID NO 8、在 CDRH3 的 SEQ ID NO 9、在 CDRLl 的 SEQ ID NO 10、在 CDRL2 的 SEQ ID NO 11 和在 CDRL3 的 SEQ ID NO 12。在一些具體實施方式
中，本發(fā)明的所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包含源自 由GenBank登錄號X65891 (SEQ ID NO 13)編碼的人H-鏈的V-區(qū)的FRH或者源自由 GenBank登錄號X72441 (SEQ ID NO 18)編碼的人κ -L-鏈的V-區(qū)的FRL。在一些 實施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的FRH包含選自氨基酸序列SEQIDN0 : 14、15、16 禾口 17 (分別為Χ65891的氨基酸序列FRHl、FRH2、FRH3和FRH4)的至少一個氨基酸序 列。在一些實施方式中，本發(fā)明的人源化抗體的FRL包含選自氨基酸序列SEQIDN0 : 19、20、21和22(分別為Χ72441的氨基酸序列FRL1、FRL2、FRL3和FRL4)的至少一 個氨基酸序列。在一個最優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包 含G)包含氨基酸序列SEQ ID NO 28的VH ；或者(ii)包含氨基酸序列SEQID NO 30的VL ；或者(iii)上述(i)和(ii)兩者。本發(fā)明還提供了包含編碼免疫特異性地識別RGD序列的本發(fā)明人源化抗體或其 抗原結(jié)合片段的核苷酸序列的分離的核酸分子。具體而言，本發(fā)明提供了分離的核酸分 子，其包含編碼包含選自SEQ ID NO : 1、2、3、7、8和9的至少一個氨基酸序列的人源 化H-鏈的核苷酸序列，或者包含編碼包含選自SEQ ID NO 4、5、6、10、11和12的至 少一個氨基酸序列的人源化L-鏈的核苷酸序列，或者包含所述人源化H-鏈的核苷酸序 列和所述人源化L-鏈的核苷酸序列兩者。在優(yōu)選的具體實施方式
中，此分離的核酸分子 包含編碼VH的核苷酸序列SEQ ID NO 23，或者包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO 24 的核苷酸序列。在一些優(yōu)選的具體實施方式
中，此分離的核酸分子包含編碼VL的核苷 酸序列SEQ ID NO 25，或者包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO 26的核苷酸序列。優(yōu) 選地，本發(fā)明的分離的核酸分子包含核苷酸序列SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 25兩 者。在優(yōu)選的具體實施方式
中，本發(fā)明的分離的核酸分子進一步包含編碼供體來源的信 號肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO 32和34)或者異源來源的信號肽的核苷酸序列。在其它優(yōu)選的具體實施方式
中，此分離的核酸分子包含編碼VH的核苷酸序列SEQ ID NO 27，或者包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO 28的核苷酸序列。在一些優(yōu)選 的具體實施方式
中，此分離的核酸分子包含編碼VL的核苷酸序列SEQ ID NO: 29，或者 包含編碼氨基酸序列SEQ ID NO: 30的核苷酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的分離的核酸分子 包含核苷酸序列SEQ ID NO : 27和SEQ ID NO: 29兩者。在優(yōu)選的具體實施方式
中，本 發(fā)明的分離的核酸分子進一步包含編碼供體來源的信號肽(例如氨基酸序列SEQ ID NO 36和38)或者異源來源的信號肽的核苷酸序列。本發(fā)明進一步提供了載體，例如表達載體，其包含編碼免疫特異性地識別RGD 序列的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的H-鏈或L-鏈或兩者的核苷酸序列。在此 載體中，本發(fā)明的核苷酸序列可操作地連接一個或多個調(diào)控元件。本發(fā)明的核苷酸序列 可以包括編碼作為CDR來自的非人供體抗體的天然信號肽的核苷酸序列，或者編碼異源來源的信號肽的核苷酸序列。此外，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核酸分子的宿主細胞，其含有包含本發(fā)明 核酸分子的載體。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了分離的宿主細胞，其包含編碼本發(fā) 明的人源化H-鏈的第一核酸分子和編碼本發(fā)明的人源化L-鏈的第二核酸分子，所述第 一核酸分子和第二核酸分子均以表達具有生物學功能的本發(fā)明人源化抗體或其抗原結(jié)合 片段的方式可操作地連接調(diào)控元件。因此，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的制備方法，所 述方法包括在使所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細 胞，和收集所產(chǎn)生的人源化抗體。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的至少一種人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的組合 物。此外，本發(fā)明提供了用于預防或治療與RGD-蛋白相關(guān)的病癥或疾病的藥物組合 物，其包含本發(fā)明的至少一種人源化抗體或其抗原結(jié)合片段和藥學上可接受的載體。所 述兩種組合物中的任一種均可以進一步包含可以加和或協(xié)同地改善所述病癥或疾病的另 一種活性化合物。所述活性化合物包括，但不限于抗炎化合物和化療化合物等。所述活 性化合物還包括小分子化合物和抗體或其抗原結(jié)合片段，例如人α4結(jié)合素特異性抗體 或人α 9結(jié)合素特異性抗體。 另一方面，本發(fā)明提供了用于預防或治療與RGD-蛋白相關(guān)或涉及RGD-蛋白的 病癥或疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施予預防有效量或治療有效量的 本發(fā)明的至少一種人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。對于此類應用，本發(fā)明的人源化抗體 或其抗原結(jié)合片段可以與增強所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的生物學作用的治療分 子(moiety)結(jié)合。此類治療分子的實例包括另一種抗體、抑制細胞生長或殺死細胞的細 胞毒素、放射性元素和/或包括抗炎劑和抗生素等在內(nèi)的其它治療劑。在本發(fā)明的再一個實施方式中，本發(fā)明提供了用于診斷受試者的與RGD-蛋白 相關(guān)或涉及RGD-蛋白的病癥或疾病的方法，所述方法包括向待檢查受試者施予診斷有 效量的本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。對于此類應用，本發(fā)明的人源化抗體可 以用可檢測的標記物(例如放射性元素)進行標記。3.1.定義本發(fā)明使用的術(shù)語“抗體”是指能夠免疫特異性地結(jié)合目標抗原或目標序列 (例如RGD序列)的抗體分子，并涵蓋完整的抗體分子或其片段，包括其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明使用的術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指保留了免疫特異性地結(jié)合目標多肽、 蛋白或序列(尤其為RGD序列)的能力的任何抗體片段，其包括單鏈抗體、Fab片段、 F(ab' )2片段、二硫鍵連接的Fvs和包含VL和/或VH中任一種的片段或包含特異結(jié)合 目標多肽、蛋白或序列的CDR的片段。因此，人源化抗體的此抗原結(jié)合片段可以包括或 可以不包括部分或全長的人恒定區(qū)。本領(lǐng)域熟知獲得上述抗體片段的各種方法。本發(fā)明使用的術(shù)語“免疫特異性地識別”是指抗體或其抗原結(jié)合片段特異性地 結(jié)合目標多肽、蛋白或序列(尤其為人RGD序列)的能力。該抗體不非特異性地與其它 多肽或蛋白結(jié)合。然而，免疫特異性地結(jié)合目標多肽或蛋白(例如RGD-蛋白)的抗體 或其抗原結(jié)合片段可以與其它抗原交叉反應。例如，免疫特異性地識別人RGD-蛋白的 本發(fā)明人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可以與鼠(murine)RGD-蛋白交叉反應。優(yōu)選地，免疫特異性地識別人RGD-蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段不與其它抗原交叉反應。本發(fā)明使用的術(shù)語“源自人來源”或“源自非人來源”分別是指其氨基酸序列源自人抗體或非人抗體的相應部分的抗體部分。本發(fā)明使用的術(shù)語“接受體序列”是指來自人抗體VH或VL的FR的核苷酸序 列或氨基酸序列，其作為來自通常為非人抗體的供體抗體的CDR的接受體。
4.


圖1顯示利用鼠OPN的部分肽對單克隆抗體4P11、11M6、25H15和35B6表位
分析的結(jié)果。圖2顯示利用鼠OPN和人OPN的部分肽對單克隆抗體29R5、30C7、33E10禾口 3818表位分析的結(jié)果。圖3顯示利用包含RGD序列的鼠OPN的部分肽對單克隆抗體33E10和35B6表 位分析的結(jié)果。圖4顯示利用鼠OPN的部分肽對單克隆抗體33E10和35B6表位分析的結(jié)果。圖5顯示利用鼠OPN的部分肽(CGDSLAYGLR ； SEQ ID NO 79)對單克隆抗 體33E10和35B6表位分析的結(jié)果。圖6顯示抗RGD單克隆抗體的CDRH分析結(jié)果。在該圖中，33E10的第99位 的氨基酸(F)與35B6的第98位的氨基酸(F)可以為K或R。圖7顯示抗RGD單克隆抗體的CDRL分析結(jié)果。圖8顯示抗RGD抗體與包含RGD序列的多種ECM蛋白的結(jié)合親和性結(jié)果。圖9顯示抗RGD抗體對mOPN N-末端片段(mOPN N-half)與癌細胞(NIH3T3
細胞)結(jié)合的抑制結(jié)果。圖10A-10C顯示抗RGD抗體對多種ECM蛋白與癌細胞(NIH3T3細胞)結(jié)合的
抑制結(jié)果。圖11顯示抗RGD抗體對肝炎的抑制作用的結(jié)果。圖12A-12B顯示抗RGD抗體對試驗性轉(zhuǎn)移模型中的肺轉(zhuǎn)移的抑制作用的結(jié)果。 圖12A顯示轉(zhuǎn)移細胞的數(shù)量，圖12B顯示重量變化。圖13A-13C顯示抗RGD抗體對自發(fā)轉(zhuǎn)移模型中的肺轉(zhuǎn)移的抑制作用的結(jié)果。圖 13A顯示癌體積，圖13B顯示轉(zhuǎn)移細胞的數(shù)量，圖13C顯示重量變化。圖14顯示抗RGD抗體在類風濕性關(guān)節(jié)炎模型中的治療作用的研究結(jié)果。圖15顯示小鼠33E10VH cDNA的核苷酸序列與推測的氨基酸序列一起顯示。氨 基酸殘基以單字母密碼顯示。信號肽序列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基 (E)以雙下戈Ij線表不。根據(jù) Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services， 1991)定義的CDR序列以下劃線表示。圖16顯示小鼠33E10VLcDNA的核苷酸序列與推測的氨基酸序列一起顯示。氨 基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽序列以斜體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘 基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。圖17顯示所設計的側(cè)翼具有SpeI和HindIII位點(下劃線表示)的33E10VH基因的核苷酸序列與推測的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽 序列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基(E)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat etal.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖18顯示所設計的側(cè)翼具有NheI和EcoRI位點(下劃線表示)的33E10VL基 因的核苷酸序列與推測的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽 序列以斜體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat etal.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖 19 顯示 pCh33E10 和 pHu33E10 (統(tǒng)稱表達載體(collectively Expression Vector)) 的結(jié)構(gòu)示意圖。從上部的SalI位點順時針開始，所述質(zhì)粒包含從人巨細胞病毒(CMV) 主要立即早期啟動子和增強子(CMV啟動子)開始以起始抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄的重鏈轉(zhuǎn) 錄單元。CMV啟動子之后為VH外顯子、包含含有人Y -1重鏈恒定區(qū)(所述人Y -1重 鏈恒定區(qū)包含具有插有內(nèi)含子的CH1、鉸鏈、CH2和CH3外顯子)的基因組序列以及 CH3外顯子之后的聚腺苷酸位點。輕鏈轉(zhuǎn)錄單元在重鏈基因序列之后，該輕鏈轉(zhuǎn)錄單元 以CMV啟動子起始，之后為VL外顯子和包含人κ鏈恒定區(qū)外顯子(CL)和在CL之前 的部分內(nèi)含子的基因組序列，以及CL外顯子之后的聚腺苷酸位點。所述輕鏈基因之后為 SV40早期啟動子(SV40啟動子)、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)和含 有SV40聚腺苷酸位點(SV40聚腺苷酸位點)的片段。最后，所述質(zhì)粒包含質(zhì)粒pUC19 的含有細菌復制起點(pUCori)和β-內(nèi)酰胺酶基因(β-內(nèi)酰胺酶)的一部分。圖 20 顯示 33E10VH、人源化 33Ε10 (Hu33E10) VH 和人接受體 U03400 (GenBank 登錄號)的氨基酸序列的比對。氨基酸殘基以單字母密碼表示。序列上方的數(shù)字表示根 據(jù) Kabat et al. (1991)的位置。Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91—3242, U.S.Department of Health and Human Services， 1991)定義的CDR序列以下劃線表示。預測雙下劃線表示的殘基與CDR接觸，并且在 人源化形式中在這些位置上小鼠殘基被保留。在該圖中省略了 U03400中的CDR殘基。

圖 21 顯示 33E10VL、人源化 33E10 (Hu33E10)VL 和人接受體 X72452 (GenBank 登錄號)的氨基酸序列的比對。氨基酸殘基以單字母密碼表示。序列上方的數(shù)字表示根 據(jù)Kabatetal. (1991)的位置。Kabat et al. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。在該 圖中省略了 X72452中的CDR殘基。圖22顯示用于構(gòu)成Hu33E10VH基因的寡核苷酸。圖23顯示用于構(gòu)成Hu33E10VL基因的寡核苷酸。圖24顯示用于構(gòu)成Hu33E10VH基因的寡核苷酸。箭頭指示各寡核苷酸的位置 和方向(由5’至3’)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。圖25顯示用于構(gòu)成Hu33E10VL基因的寡核苷酸。箭頭指示各寡核苷酸的位置 和方向(由5’至3’)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。圖26顯示側(cè)翼具有SpeI和HindIII位點(下劃線表示)的Hu33E10VH基因的
核苷酸序列和推測的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽序 列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基(E)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat et al.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖27顯示側(cè)翼具有NheI和EcoRI位點(下劃線表示)的Hu33E10VL基因的核苷酸序列與推測的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽序列以斜 體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991) 定 義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖28顯示小鼠35B6VH cDNA的核苷酸序列和推測的氨基酸序列一起顯示。氨 基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽序列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基 (Q)以雙下戈1J線表不。根據(jù) Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services，
1991)定義的CDR序列以下劃線表示。圖29顯示小鼠35B6VL cDNA的核苷酸序列和推測的氨基酸序列一起顯示。氨 基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽序列以斜體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘 基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。圖30顯示所設計的側(cè)翼具有SpeI和HindIII位點(下劃線表示)的35B6VH基 因的核苷酸序列與推測的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽 序列以斜體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基(Q)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat etal.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖31顯示所設計的側(cè)翼具有NheI和EcoRI位點(下劃線表示)的35B6VL基因 的核苷酸序列與推測的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽序 列以斜體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabat et al.(1991)定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖32顯示pCh35B6和pHu35B6 (統(tǒng)稱表達載體)的結(jié)構(gòu)示意圖。從上部的SalI 位點順時針開始，所述質(zhì)粒包含從人巨細胞病毒(CMV)主要立即早期啟動子和增強子 (CMV啟動子)開始以起始抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄的重鏈轉(zhuǎn)錄單元。CMV啟動子之后為VH 外顯子、包含含有人Y-I重鏈恒定區(qū)(所述人Y-I重鏈恒定區(qū)包含具有插入內(nèi)含子的 CHU鉸鏈、CH2和CH3外顯子)的基因組序列以及CH3外顯子之后的聚腺苷酸位點。 輕鏈轉(zhuǎn)錄單元在重鏈基因序列之后，該輕鏈轉(zhuǎn)錄單元以CMV啟動子起始，之后為VL外 顯子和包含人κ鏈恒定區(qū)外顯子(CL)和在CL之前的部分內(nèi)含子的基因組序列，以及CL 外顯子之后的聚腺苷酸位點。然后，所述輕鏈基因之后為SV40早期啟動子(SV40啟動 子)、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)和含有SV40聚腺苷酸位點(SV40 聚腺苷酸位點)的片段。最后，所述質(zhì)粒包含質(zhì)粒pUC19的含有細菌復制起點(pUCori) 和β -內(nèi)酰胺酶基因(β -內(nèi)酰胺酶)的一部分。圖 33 顯示 35B6VH、人源化 335Β6 (Hu35B6) VH 和人接受體 Z47230 (GenBank 登
錄號)的氨基酸序列的比對。氨基酸殘基以單字母密碼表示。序列上方的數(shù)字表示根據(jù) Kabatetal. (1991)的位置。Kabatetal. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。預測雙下 劃線表示的殘基與CDR接觸，并且在人源化形式中在這些位置上小鼠殘基被保留。在該 圖中省略了 Z47230中的CDR殘基。圖 34 顯示 35B6VL、人源化 335B6 (Hu35B6) VL 和人接受體 X72479 (GenBank 登
錄號)的氨基酸序列的比對。氨基酸殘基以單字母密碼表示。序列上方的數(shù)字表示根據(jù) Kabatetal. (1991)的位置。Kabatetal. (1991)定義的CDR序列以下劃線表示。預測雙下 劃線表示的殘基與CDR接觸，并且在人源化形式中在這些位置上小鼠殘基被保留。在該圖中省略了 X72479中的CDR殘基。圖35顯示用于構(gòu)成Hu35B6VH基因的寡核苷酸。圖36顯示用于構(gòu)成Hu35B6VL基因的寡核苷酸。圖37顯示用于構(gòu)成Hu35B6VH基因的寡核苷酸。箭頭指示各寡核苷酸的位置 和方向(由5’至3’)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。圖38顯示用于構(gòu)成Hu35B6VL基因的寡核苷酸。箭頭指示各寡核苷酸的位置和 方向(由5’至3’)。氨基酸殘基以單字母密碼表示。圖39顯示側(cè)翼具有SpeI和HindIII位點(下劃線表示)的Hu35B6VH基因的核苷
酸序列和推測的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽序列以斜 體表示。成熟的VH的N-末端氨基酸殘基(Q)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991) 定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖40顯示側(cè)翼具有NheI和EcoRI位點(下劃線表示)的Hu35B6VL基因的核苷 酸序列與推測的氨基酸序列一起顯示。氨基酸殘基以單字母密碼表示。信號肽序列以斜 體表示。成熟的VL的N-末端氨基酸殘基(D)以雙下劃線表示。根據(jù)Kabatetal. (1991) 定義的CDR序列以下劃線表示。內(nèi)含子序列以斜體表示。圖41A-41B顯示通過ELISA對嵌合35B6抗體和人源化35B6抗體與hOPN-BSA 的結(jié)合進行分析的結(jié)果。以起始濃度2.5μ g/ml(圖41A)或Ι.Ομ g/ml(圖41B)和一系 列兩倍稀釋對各個抗體進行測試。實驗一式三份。各抗體濃度的平均吸收值和標準偏差 顯示在圖41A-41B中。5.發(fā)明詳述5.1.針對RGD序列的抗體的制備可以通過本領(lǐng)域任何適合的方法產(chǎn)生免疫特異性地識別RGD序列的抗體。在本發(fā)明中，包含細胞粘附“RGD”序列的RGD-蛋白或肽(下文簡稱為 “RGD-肽”)可以為(1)源自表達RGD蛋白的人ECM或者源自具有ECM的所有組
織，(2)通過向細菌、酵母、諸如動物細胞的細胞系等中轉(zhuǎn)染編碼RGD-蛋白或RGD-肽 的DNA(優(yōu)選為cDNA)而表達獲得的重組蛋白或肽，或者(3)合成的蛋白或肽。在本發(fā)明中，用作抗原的RGD-肽能夠通過免疫產(chǎn)生針對RGD序列的抗體。所 述RGD-肽包括氨基酸序列CVDVPNGRGDSLAYGLR (SEQ IDNO 71)(其為鼠ECM蛋 白的細胞粘附序列)的RGD-肽。所述RGD-蛋白或RGD-肽包括，例如OPN、玻連蛋 白、纖連蛋白、血管性血友病因子、膠原蛋白、層粘連蛋白、腱生蛋白、纖維蛋白原、 血小板反應蛋白和包括其片段的RGD?？梢詫⑷斯せ蛱烊蛔兓?，例如氨基酸的取代、缺 失、修飾和添加應用于所述蛋白或所述肽，只要所述蛋白或所述肽包含RGD-序列。所 述變體蛋白或肽可以包含其中的多個氨基酸，優(yōu)選1-10個氨基酸，更優(yōu)選1-幾個(例如 1-5個)氨基酸被取代、缺失、修飾、添加或插入的氨基酸序列。在本發(fā)明中，所述RGD-肽包含至少約5個氨基酸，優(yōu)選約5-50個氨基酸，更 優(yōu)選約10-20個氨基酸?？梢岳帽绢I(lǐng)域熟知的方法，例如化學合成法、細胞培養(yǎng)法、 基因重組法及其正確修飾產(chǎn)生在本發(fā)明中作為抗原的RGD-蛋白或RGD-肽。例如，可 以利用蛋白酶對ECM蛋白進行適當切割，從而獲得RGD-肽。所述RGD-蛋白或所述 RDG-肽可源自哺乳動物，例如鼠(murine)、大鼠、兔、豬、牛、猴和人?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的任何方法制備可用于制備抗-RGD抗體的RGD-蛋白或RGD-肽。用于產(chǎn)生所述變體多肽的方法的實例包括合成寡核苷酸定點突變法(缺口 雙鏈體法)、涉及利用亞硝酸鹽或亞硫酸鹽處理隨機引入點突變的點突變法、涉及利 用Bal31酶或其它酶制備缺失突變的方法、盒式突變 、連接子掃描法、錯摻入法(miss incorporation method)、錯配弓丨物法和DNA片段合成法等。所述RGD-肽可以與其它生物大分子，例如甲狀腺球蛋白(thyrogloblin)、鑰孔 血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或牛球蛋白，優(yōu)選甲狀腺球 蛋白結(jié)合。通過使用偶聯(lián)劑，例如具有活性酯基團和馬來酰亞胺基團的結(jié)合試劑(所 述活性酯基團與蛋白或肽的氨基基團結(jié)合，并且所述馬來酰亞胺基團與蛋白或肽的巰基 基團結(jié)合；S.Yoshirake et al.，Eur.J.Biochem.，101，395-399，1979)，通過使用混合酐 法(B.F.Erlanger et al.，J.Biol.Chem.，234，1090-1094，1954)，或者通過使用活性酯法 (A.E.Karuetal.，J.Agric.FoodChem.，42，301-309，1994)，可以獲得 RGD-肽和生物大 分子結(jié)合的方法。優(yōu)選通過使用偶聯(lián)劑獲得RGD-肽和生物大分子結(jié)合的方法。還可以使用自身過表達RGD-蛋白或RGD-肽的細胞作為抗原。自身過表達 RGD-蛋白或RGD-肽的細胞可以通過本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)制備?？梢岳冒凑丈鲜鲋苽涞倪m當抗原，通過本領(lǐng)域熟知的多種方法制備特異于 RGD序列的抗體。可以通過本領(lǐng)域熟知的多種方法產(chǎn)生針對RGD序列的抗體。例如， 可以將目標抗原施予包括但不限于兔、小鼠、大鼠等在內(nèi)的多種宿主動物，從而誘導產(chǎn) 生包含特異于所述抗原的多克隆抗體的抗血清。可以根據(jù)宿主種類使用多種佐劑提高免 疫應答，所述佐劑包括，但不限于弗氏(完全或不完全)佐劑，礦物膠，例如氫氧化鋁， 表面活性物質(zhì)，例如溶血卵磷脂、復合多元醇(pluranicpolyol)、聚陰離子、肽、油乳 齊U、鑰孔血藍蛋白、二硝基酚，和用于人的潛在有用的佐劑，例如BCG(卡介菌，Bacille Calmette-Guerin)和短小棒狀桿菌(corynebacterium parvum)。此類佐劑也是本領(lǐng)域熟知 的。可以使用本領(lǐng)域已知的包括使用雜交瘤、重組技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)或其組 合在內(nèi)的多種技術(shù)制備單克隆抗體。例如，可以通過使用包括本領(lǐng)域已知的以及例如 Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) ； Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T—Cell Hybridomas， pp.563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)(兩者均通過引用整體并入本文)中教導的雜交瘤技 術(shù)，產(chǎn)生單克隆抗體。本發(fā)明使用的術(shù)語“單克隆抗體”不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的 抗體。術(shù)語“單克隆抗體”指源自單個克隆的抗體，并包括真核、原核或噬菌體克隆， 但不限于產(chǎn)生該單克隆抗體的方法。利用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生并篩選特異抗體的方法是常規(guī)方法，且為本領(lǐng)域所熟知。 在非限制性實例中，可以利用目標抗原或表達此抗原的細胞免疫小鼠。檢測到免疫應 答(例如在小鼠血清中檢測到特異于所述抗原的抗體)后，收集小鼠脾臟并分離脾細 胞。然后，通過熟知的技術(shù)將所述脾細胞與任何合適的骨髓瘤細胞(例如，P3U1、 P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-Ul、P3NSl_Ag4、SP2/0_Agl4、P3X63_Ag8_653 等)融合。 通過有限稀釋選擇并克隆雜交瘤。然后，通過本領(lǐng)域已知的方法檢測所述雜交瘤克隆， 獲得分泌能夠與所述抗原結(jié)合的抗體的細胞?？梢酝ㄟ^對小鼠腹膜內(nèi)接種陽性雜交瘤克隆來產(chǎn)生腹水液，該腹水液通常包含高水平的抗體。可以通過已知技術(shù) 產(chǎn)生識別特異表位的抗體片段。例如，可以通過免疫球蛋 白分子的蛋白水解切割，利用諸如木瓜蛋白酶(以產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(以產(chǎn)生 F(ab，)2片段)的酶產(chǎn)生Fab和F(ab，)2片段。F(ab，)2片段包含完整的L-鏈和H-鏈 的V區(qū)、CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)。可以通過本領(lǐng)域已知的任何用于合成抗體的方法，尤其是通過化學合成或者優(yōu) 選通過重組表達技術(shù)，產(chǎn)生本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何信息(例如來自Genbank的信息、文獻或 者通過常規(guī)克隆和序列分析)，獲得編碼抗體的核苷酸序列。如果不能獲得包含編碼特定 抗體或其表位結(jié)合片段的核酸的克隆，而抗體分子或其表位結(jié)合片段的序列已知，則可 以化學合成編碼所述免疫球蛋白的核酸，或者從合適的來源(例如抗體cDNA文庫，或者 由表達所述抗體的任何組織或細胞，例如所篩選的表達抗體的雜交瘤細胞分離的核酸， 優(yōu)選polyA+RNA，或由其產(chǎn)生的cDNA文庫)利用與序列的3’和5’末端雜交的合成 引物通過PCR擴增獲得編碼所述免疫球蛋白的核酸或通過克隆利用特異于所述特定基因 序列的寡核苷酸探針以鑒定例如來自cDNA文庫的編碼所述抗體的cDNA克隆從而獲得編 碼所述免疫球蛋白的核酸。然后，可以利用本領(lǐng)域熟知的任何方法，將通過PCR擴增產(chǎn) 生的核酸克隆至可復制的克隆載體內(nèi)。5.2.重組抗體的制備可以利用本領(lǐng)域熟知的用于操作核苷酸序列的方法，例如重組DNA技術(shù)、定 點突變和 PCR 等(參見，例如 Sambrook etal.，見上文；和 Ausubel et al.，eds.，1998， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY,描述的技術(shù)，其均通過
引用整體并入本文)，對所述抗體的核苷酸序列進行處理?？梢韵蚩贵w中引入突變，例如 在表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域區(qū)或者在任意部分引入氨基酸取代、缺失和/或插入，從而增強或降 低生物活性。可以使用包含編碼抗體的核苷酸序列的表達載體用于抗體或其抗原結(jié)合片段的 重組表達?？梢岳弥肮?jié)段中討論的本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生包含 編碼抗體分子、抗體的H-鏈和/或L-鏈或其用于產(chǎn)生抗體或其抗原結(jié)合片段的部分的 核苷酸序列的載體?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建包含抗體或其抗原結(jié)合片 段的編碼序列以及適當?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括，例如體外重 組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組?？梢詫⒕幋aVH、VL、VH和VL兩者、VH 和/或VL的抗原結(jié)合片段或者抗體的一個或多個CDR的核苷酸序列克隆至此載體中用 于表達。此序列可以與編碼可以是天然的或與原始抗體異源的信號肽的多核苷酸融合。 然后，可以將由此制備的表達載體引入到適合表達所述抗體的宿主細胞中。因此，本發(fā) 明包括包含編碼免疫特異性地識別RGD序列的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸 的宿主細胞?？梢岳帽景l(fā)明的兩種表達載體共轉(zhuǎn)染所述宿主細胞，其中，第一載體編碼源 自H-鏈的多肽，第二載體編碼源自L-鏈的多肽。所述兩種載體可以包含能夠均等表達 H-鏈和L-鏈多肽的同一選擇標記物，或者不同的選擇標記物，從而確保兩種質(zhì)粒的維 持?；蛘?，可以使用編碼并能夠同時表達H-鏈和L-鏈多肽的單個載體。H-鏈和L-鏈的編碼序列可以包含cDNA或基因組DNA。在另一個實施方式中，還可以利用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示法產(chǎn)生抗體。 在噬菌體展示法中，功能抗體結(jié)構(gòu)域被展示在具有編碼其的多核苷酸序列的噬菌體顆粒 表面。在具體的實施方式中，可以利用此噬菌體來展示由庫(repertoire)或組合抗體文庫 (例如人或鼠)表達的抗原結(jié)合域，例如Fab和Fv或者通過二硫鍵穩(wěn)定的Fv?？梢岳每?原，例如利用標記抗原或被固體表面或珠結(jié)合或捕獲的抗原，選擇或鑒定表達與目標抗 原結(jié)合的抗原結(jié)合域的噬菌體。在這些方法中使用的噬菌體通常為包括fd和M13在內(nèi)的 絲狀噬菌體。所述抗原結(jié)合域作為與噬菌體基因III或基因VIII蛋白融合的重組融合蛋白 表達。可用于制備本發(fā)明的免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示法的實例包括在Brinkman etal., J.Immunol.Methods, 182 41-50, 1995 ； Amesetal., J.Immunol.Methods, 184 177-186，1995 ； Kettleborough et al.，Eur.J.Immunol.，24 952-958，1994 ； Persic et al.，Gene，187 9-18, 1997 ； Burton et al., Advances in Immunology，57 191-280,
1994； PCT 申請?zhí)?PCT/GB91/01134 ； PCT 公開 W090/02809 ； WO 91/10737 ； WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/11236 ； W095/15982 ； WO 95/20401 ；和美國專利 號 5,698,426 ； 5,223,409 ； 5,403,484 ； 5,580,717 ； 5,427,908 ； 5,750,753 ； 5,821,047 ； 5,571,698 ； 5,427,908 ； 5,516,637 ； 5,780,225 ； 5,658,727 ； 5,733,743 和 5,969,108 中描述 的方法，其均通過引用整體并入本文。如上述參考文獻中的描述，在噬菌體選擇后，可以分離來自噬菌體的抗體編碼 區(qū)并用于產(chǎn)生包括人抗體或其它任何目標片段在內(nèi)的所有抗體，并按照例如以下詳述在 包括例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、酵母和細菌在內(nèi)的任何期望宿主中表 達。例如，也可以利用本領(lǐng)域已知的方法，例如在PCT公開WO 92/22324 ； Mullinax et al., BioTechniques，12(6) 864-869，1992 ；和 Sawai et al.，AJRI, 34: 26-34，
1995；和 Better et al.，Science, 240 1041-1043，1988 (均通過引用整體并入本文)中 公開的方法，采用重組產(chǎn)生Fab、Fab，和F(ab，)2片段的技術(shù)?？捎糜诋a(chǎn)生單鏈Fvs 和抗體的技術(shù)的實例包括在美國專利號4,946,778和5,258,498 ； Huston et al., Methods in Enzymology, 203 46-88，1991 ； Shu et al.，PNAS, 90: 7995-7999，1993 ；和 Skerra et al., Science, 240 1038-1040，1988 中描述的技術(shù)。在通過上述任一方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體分子后，可以通過本領(lǐng)域已知的純化免 疫球蛋白分子的任一方法對其進行純化，例如通過層析(例如離子交換層析、親和層析 (尤其是在蛋白A或蛋白G純化后針對特異抗原的親和層析)和根據(jù)體積的柱層析)、 離心、差異溶解度或通過用于蛋白純化的其它標準技術(shù)對其進行純化。此外，本發(fā)明的 抗體或其片段可以與本文描述的異源多肽序列或本領(lǐng)域已知的其它物質(zhì)融合，以便于純 化。對于包括抗體在人體內(nèi)的應用和體外檢測試驗在內(nèi)的一些應用，可以優(yōu)選使用 嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。在下文5.3節(jié)中將詳細討論嵌合抗體和人源化抗體。 與其它化合物或異源多肽融合或結(jié)合的抗體可用于體外免疫試驗、純化方 法(例如親和層析)以及體內(nèi)治療應用或診斷應用中。參見，例如PCT
發(fā)明者上出利光, 今重之, 尚卡爾·庫馬爾, 曹仲欣, 鶴下直也 申請人:株式會社遺傳科技