專利名稱：突變體酵母及使用其的物質(zhì)生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)野生型酵母進(jìn)行了使規(guī)定基因組成型表達(dá)這樣的改變的突變體酵 母及使用其的物質(zhì)生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
使用酵母等生產(chǎn)目標(biāo)生產(chǎn)物時(shí)，制作以能組成型表達(dá)的方式導(dǎo)入了與該目標(biāo)生 產(chǎn)物生物合成相關(guān)的基因的突變體酵母，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)突變體酵母，從菌體 內(nèi)或菌體外回收目標(biāo)生產(chǎn)物。另外，以乙醇以外的物質(zhì)作為目標(biāo)生產(chǎn)物時(shí)，優(yōu)選減少大 量產(chǎn)生的乙醇。到現(xiàn)在為止，為了降低乙醇生產(chǎn)能力，已制作出破壞存在于乙醇生產(chǎn)路 徑中的丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等基因的菌株。然而，尤其如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)這種具有葡萄糖效應(yīng)(Crabtree effect)的菌中，降低乙醇生產(chǎn)量時(shí)其繁殖、發(fā)酵 能力也大幅度的下降，存在實(shí)用性低這樣的問題。(非專利文獻(xiàn)1: Ishida, N.etal.(2006) Biosci.Biotechnol.Biochem.70，pll48-1153 ；非專利文獻(xiàn) 2 Flikweert，M.T.et al. (1996) Yeast 12，p247_257、非專利文獻(xiàn) 3 Eri, A.etal. (1998) J.Ferment.Bioeng.86，p284_289 ； 專利文獻(xiàn)1:特表2003-500062號(hào)公報(bào)；專利文獻(xiàn)2 特表2001-516584號(hào)公報(bào)；非專利 文獻(xiàn) 4:Skory，C.D. (2003) J.Ind.Microbiol.Biotechnol 30, p22_27)。另外，根據(jù)非專利 文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)3以及非專利文獻(xiàn)4，即使通過破壞乙醇生產(chǎn)路徑的基因而能大幅度 降低乙醇，所降低部分的大部分也未必都變成目標(biāo)生產(chǎn)物。另一方面，也有通過將乙醇生產(chǎn)路徑的阻斷限于一部分，并增強(qiáng)目標(biāo)生產(chǎn)物 的代謝路徑，從而提高目標(biāo)生產(chǎn)物收率的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)5: Saitoh，S (2005) Appl. Environ.Microbiol.71, p2789_2792)，然而，目標(biāo)生產(chǎn)物的收率雖然得到了提高，但存在 乙醇的降低不充分，發(fā)酵速度也稍微下降這樣的問題。
專利文獻(xiàn)1 特表2003-500062號(hào)公報(bào) 專利文獻(xiàn)1 特表2001-516584號(hào)公報(bào)
非專利文獻(xiàn)1 非專利文獻(xiàn)2 非專利文獻(xiàn)3 非專利文獻(xiàn)4 非專利文獻(xiàn)5
Ishida, N.et al. (2006)Biosci.Biotechnol.Biochem.70, pll48_1153 Flikweert, M.T.et al. (1996) Yeast 12，p247-257 Eri, A.et al. (1998) J.Ferment.Bioeng.86, p284_289 Skory，C.D. (2003) J.Ind.Microbiol.Biotechnol 30，p22_27 Saitoh, S (2005) Appl.Environ.Microbiol.71, p2789_279
發(fā)明內(nèi)容
所以，鑒于上述情況，本發(fā)明的目的在于提供一種突變體酵母及使用其的物質(zhì) 生產(chǎn)方法，其在使用酵母生產(chǎn)目標(biāo)生產(chǎn)物時(shí)，能大幅度提高目標(biāo)生產(chǎn)物的生產(chǎn)率的同時(shí) 維持優(yōu)良的生長(zhǎng)速度以及發(fā)酵速度。為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明人等進(jìn)行銳意研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了通過導(dǎo)入與目標(biāo) 生產(chǎn)物生產(chǎn)相關(guān)的基因并組成型表達(dá)HAP4基因，能夠維持生長(zhǎng)速度以及發(fā)酵速度的同時(shí)大幅度提高該目標(biāo)生產(chǎn)物的生產(chǎn)率的事實(shí)，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明包括以下內(nèi)容。(1) 一種突變體酵母，導(dǎo)入了編碼與目標(biāo)生產(chǎn)物的生產(chǎn)相關(guān)的酶的外來基因、和 能組成型表達(dá)的HAP4基因或其同源基因。上述(1)的突變體酵母優(yōu)選的是與野生型相比醇生產(chǎn)率降低了的突變體。例 如，通過降低與醇合成相關(guān)的酶的酶活性而能降低醇生產(chǎn)率。在此，作為與醇合成相 關(guān)的酶可舉出丙酮酸脫羧酶和/或醇脫氫酶。作為上述丙酮酸脫羧酶可舉出選自PDCl 基因、PDC5基因和PDC6基因中的至少一個(gè)基因所編碼的酶。作為上述醇脫氫酶，可 舉出由ADHl基因所編碼的酶。另外，作為上述(1)的突變體酵母優(yōu)選使用屬于酵母 (Saccharomyces)屬的酵母，尤其是屬于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株的酵 母。另外，上述外來基因可舉出編碼具有乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因。(2) —種使用酵母的物質(zhì)生產(chǎn)方法，包含培養(yǎng)上述的本發(fā)明的突變體酵母， 在菌體內(nèi)外生成目標(biāo)生產(chǎn)物的工序；和回收上述目標(biāo)生產(chǎn)物的工序。上述(2)的物質(zhì)生產(chǎn)方法中，能以有機(jī)酸作為目標(biāo)生產(chǎn)物。而且，特別優(yōu)選的 是以乳酸作為目標(biāo)生產(chǎn)物。并且，也能以乙醇以外的醇作為目標(biāo)生產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，能夠提供維持優(yōu)良的生長(zhǎng)速度以及發(fā)酵速度的同時(shí)還具有優(yōu)良的 目標(biāo)生產(chǎn)物生產(chǎn)率的突變體酵母，并且，通過使用本發(fā)明的突變體酵母能以低成本生產(chǎn) 目標(biāo)生產(chǎn)物。本說明書包括作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2008-113053號(hào)的說明書 和/或附圖所記載的內(nèi)容。


圖1為表示構(gòu)建LDH基因?qū)?PDCl基因破壞用DNA片段的流程的示意圖。圖2為表示構(gòu)建PDC5基因破壞用DNA片段的流程的示意圖。圖3為表示構(gòu)建HAP4基因過度表達(dá)用DNA片段的流程的示意圖。圖4為表示對(duì)于LDH基因?qū)?PDCl基因破壞株的、HAP4導(dǎo)入株以及HAP4 非導(dǎo)入株的發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果的特性圖。圖5為表示對(duì)于LDH基因?qū)?PDCl以及PDC5基因破壞株的、HAP4導(dǎo)入株 以及HAP4非導(dǎo)入株的發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果的特性圖。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)說明本發(fā)明。本發(fā)明的突變體酵母導(dǎo)入了編碼與目標(biāo)生產(chǎn)物的生產(chǎn)相關(guān)的酶的外來基因、 和能組成型表達(dá)的HAP4基因或其同源基因。在此，HAP4基因是編碼構(gòu)成被半活性 化、葡萄糖抑制的Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-結(jié)合性復(fù)合體的亞基的HAP4蛋白質(zhì)。 已知該復(fù)合體具有各種各樣的基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。在Gancedo JM(1998)Yeast carbon cataboliterepression.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62 (2)，p334-61 中尤其對(duì) HAP4 蛋白質(zhì)以及上 述復(fù)合體進(jìn)行了詳細(xì)敘述。HAP4基因中的編碼區(qū)域的堿基序列以及HAP4蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別表示于序列號(hào)1以及2。其中，作為以組成型表達(dá)的方式導(dǎo)入的HAP4基因并不限定于編碼含序 列號(hào)2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的基因，也可以編碼包含相對(duì)于序列號(hào)2所示的氨基酸 序列，例如具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最 優(yōu)選97%以上的同源性的氨基酸序列的、形成上述復(fù)合體并表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性的蛋白質(zhì) 的基因。在此，同源性是指使用收納了安裝有blast算法的計(jì)算機(jī)程序以及基因序列信息 的數(shù)據(jù)庫，通過設(shè)定值(Default)的設(shè)定而求出的值。另夕卜，作為HAP4基因也可以是編碼含序列號(hào)2所示的氨基酸序列中1或多個(gè) (例如2 60個(gè)、優(yōu)選2 50個(gè)、更優(yōu)選2 40個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選2 30個(gè)、最優(yōu)選2 15個(gè))氨基酸缺失、取代、添加或插入的氨基酸序列的、形成上述復(fù)合體并表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄促 進(jìn)活性的蛋白質(zhì)的基因。進(jìn)而，作為HAP4基因并不限定于含序列號(hào)1所示的堿基序列的基因，也可以是 對(duì)于由與序列號(hào)1所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的聚核苷酸的全部或連續(xù)的一部 分，在嚴(yán)格條件下雜交，編碼形成上述復(fù)合體并表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性的蛋白質(zhì)的基因。在 此，嚴(yán)格條件下是指形成所謂的特異性雜交物，不形成非特異性雜交物的條件。例如， 可舉出45°C、6XSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)下的雜交、其后的50 65°C、0.2 1XSSC、 0.1% SDS下的洗凈，或者，作為這種條件還可以舉出65 70°C、IX SSC下的雜交、其 后的 65 70°C、0.3XSSC 下的洗凈。雜交能夠以 J.Sambrooket al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual, 2nd Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory (1989)所記載的方法等現(xiàn)有公 知方法進(jìn)行。其中，如上所述的具有規(guī)定的同源性的氨基酸序列、具有氨基酸的缺失、取代 或添加的氨基酸序列等可通過對(duì)具有編碼含序列號(hào)2所示的氨基酸序列蛋白質(zhì)的堿基序 列(例如，序列號(hào)1所示的堿基序列)的聚核苷酸，以該技術(shù)領(lǐng)域公知的手法進(jìn)行改變 而進(jìn)行。另外，對(duì)于由與序列號(hào)1所示的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的聚核苷酸的全 部或連續(xù)的一部分，在嚴(yán)格條件下雜交的聚核苷酸，同樣可通過將具有序列號(hào)1所示的 堿基序列的聚核苷酸，以該技術(shù)領(lǐng)域公知的手法進(jìn)行改變而進(jìn)行。向堿基序列導(dǎo)入變異 時(shí)可通過Kunkel法或Gapped duplex法等的公知手法或以其為基準(zhǔn)的方法進(jìn)行，例如使 用利用定點(diǎn)突變誘導(dǎo)法的變異導(dǎo)入用試劑盒(例如Mutant-K、Mutant-G(均為商品名、 TAKARA Bio公司制))等，或者使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列試劑盒(商品名、 TAKARA Bio公司制)導(dǎo)入變異。另外，作為變異導(dǎo)入方法也可以是使用EMS(乙基甲 烷磺酸鹽)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羥胺、N-甲基-N’ -硝基-N亞硝基胍、其他 的以致癌性化合物為代表的化學(xué)誘變劑的方法，也可以是利用X射線、阿爾法射線、貝 塔射線、伽馬射線、離子束為代表的放射線處理、紫外線處理的方法。另外，對(duì)于某蛋白質(zhì)是否形成上述復(fù)合體并具有轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性，例如可通過利 用 David S.McNabb 等、Eukaryotic Cell，November 2005，p.1829-1839, Vol.4, No.ll 所 公開的實(shí)驗(yàn)系進(jìn)行確認(rèn)。即，該文獻(xiàn)中記載有通過構(gòu)建Hap2p/Hap3p/Hap5p雜合三聚體 之后起到Hap4蛋白質(zhì)作用而形成上述復(fù)合體的同時(shí)表現(xiàn)上述轉(zhuǎn)錄促進(jìn)活性。因此，利用 該文獻(xiàn)所記載的實(shí)驗(yàn)系，可容易地考察某蛋白質(zhì)是否具有與HAP4蛋白質(zhì)同等的功能。而且，上述的HAP4基因可通過現(xiàn)有公知的手法從釀酒酵母分離使用。并 且，本發(fā)明中，代替上述的HAP4基因也可以使用HAP4基因的同源基因。作為
5HAP4基因的同源基因可舉出乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)來源HAP4同源 基因(參照 Bourgarel，D.et al.，1999.Mol.Microbiol.31 1205-1215)以及漢遜酵母 (Hansenulapolymorpha)來源HAP4 同源基因(參照 Sybirna，K.etal.，2005.Curr.Genet.47
172-181)。這些HAP4同源基因的堿基序列以及該基因編碼的HAP4同源蛋白質(zhì)的氨基 酸序列可以從Genbank等的公知數(shù)據(jù)庫獲取。對(duì)于以上說明的HAP4基因或其同源基因在宿主內(nèi)的組成型表達(dá)，例如可舉出 利用組成型表達(dá)啟動(dòng)子的方法。即，可以采用在組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下構(gòu)建配置了 HAP4基因或其同源基因的表達(dá)載體，使用該表達(dá)載體將宿主轉(zhuǎn)化的方法。在此，組成型 表達(dá)啟動(dòng)子是具有與宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)條件無關(guān)聯(lián)地表達(dá)下游基因的功能的啟動(dòng)子。對(duì)于 組成型表達(dá)啟動(dòng)子，可無特別限定地使用，根據(jù)宿主細(xì)胞的種類或所控制基因的種類等 適宜選擇即可。例如，作為釀酒酵母中的組成型表達(dá)啟動(dòng)子可舉出ADHl啟動(dòng)子、HIS3 啟動(dòng)子、TDH3啟動(dòng)子、CYC3啟動(dòng)子、CUPl啟動(dòng)子以及HOR7啟動(dòng)子等。其中，含上述的組成型表達(dá)啟動(dòng)子和HAP4基因或其同源基因的表達(dá)載體被導(dǎo) 入于宿主時(shí)還可以具有調(diào)整HAP4基因或其同源基因表達(dá)的其他序列，具體有操縱基 因、增強(qiáng)子、沉默子、核糖體結(jié)合序列、終止子等。在此，作為用于將HAP4基因或其同源基因以組成型表達(dá)的方式導(dǎo)入的宿主， 只要是酵母就無特別的限定。作為可用作宿主的酵母例如可舉出子囊菌門(Ascomycota) 的子囊菌酵母、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)的擔(dān)子菌酵母、或不完全菌綱(Fungi Imperfecti)的不完全菌酵母。優(yōu)選為子囊菌酵母、尤其使用作為出芽酵母的釀酒酵母、 產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)或畢赤酵母(Pichiapastris)等、作為裂殖酵母的粟酒裂殖酵 母(Shizosaccharomycespombe)等。另外，作為宿主可以使用乳酸克魯維酵母以及漢遜 酵母。另外，作為宿主使用的酵母特優(yōu)選為使用醇生產(chǎn)率降低了的突變株。在此，醇 生產(chǎn)率降低了是指與野生型酵母相比、醇生產(chǎn)率顯著降低了的意思。例如，可通過以降 低與醇合成相關(guān)的酶的酶活性的方式對(duì)野生型酵母導(dǎo)入變異，從而降低醇生產(chǎn)率。作為 與醇合成相關(guān)的酶可舉出丙酮酸脫羧酶以及醇脫氫酶。這些丙酮酸脫羧酶以及醇脫氫酶 中，通過降低其一或兩個(gè)酶活性而能降低醇生產(chǎn)率。作為編碼釀酒酵母來源丙酮酸脫羧 酶的基因可舉出PDCl基因、PDC5基因以及PDC6基因。作為編碼釀酒酵母來源醇脫氫 酶的基因可舉出ADHl基因。通過使這些基因中的1個(gè)或多個(gè)基因缺損而能降低醇生產(chǎn)率。其中，作為基 因的缺損方法無特別的限定，可舉出使該基因缺失的方法、向該基因?qū)胱儺惗磉_(dá)非 活性型酶的方法、使該基因的表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)域(例如啟動(dòng)子)缺失或變異的方法。另外， 基因的缺損方法還包括在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該基因的siRNA(small interfering RNA)、反義 RNA,核酶的方法。另外，本發(fā)明的突變體酵母具有編碼與目標(biāo)生產(chǎn)物的生產(chǎn)相關(guān)的酶的外來基 因，能用于生產(chǎn)該目標(biāo)生產(chǎn)物。作為目標(biāo)生產(chǎn)物只要是能夠以酵母生物合成的物質(zhì)則無 特別的限定，例如可舉出乳酸、丙烯酸、乙酸、丙酮酸、3-羥丙酸、富馬酸、琥珀酸、 衣康酸、乙酰丙酸、己二酸、抗壞血酸以及檸檬酸等的有機(jī)酸以及1-丙醇、2-丙醇、 1-丁醇、異丁醇、2-甲基-1-丁醇以及3-甲基-1-丁醇等的醇。
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其中，以乳酸為目標(biāo)生產(chǎn)物時(shí)，作為外來基因可舉出與乳酸合成相關(guān)的乳酸脫 氫酶(LDH)基因。換言之，通過以LDH基因作為外來基因進(jìn)行導(dǎo)入而對(duì)突變體酵母 賦予乳酸生產(chǎn)能力。作為L(zhǎng)DH根據(jù)生物的種類或者在生物體內(nèi)存在各種同族體。作 為本發(fā)明中所使用的LDH除了天然來源LDH以外還包括化學(xué)合成或者基因工程學(xué)人 工合成的LDH。作為L(zhǎng)DH優(yōu)選為瑞士乳桿菌株(Lactobacillus helveticusK)、益生菌 (Lactobacillus casei)、熱克魯維酵母(Kluyveromyces · thermotolerans)、德爾布有孢酵母 (Torulaspora · delbraeckii)、粟酒裂殖酵母、米根霉(Rhizopusoryzae)等的原核生物或者 霉菌等的真核生物來源，更優(yōu)選為植物、動(dòng)物、昆蟲等的高等真核生物來源。例如，優(yōu) 選使用牛來源LDH (L-LDH)。通過將這些基因?qū)肷鲜龅慕湍付芟蛟撐⑸镔x予乳酸 生成能力。另外，上述的外來基因可以是在組成型表達(dá)啟動(dòng)子的控制下導(dǎo)入的，也可以是 在表達(dá)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下導(dǎo)入的。其中，上述的外來基因無需在含Hap2p/3p/4p/5p CCAAT-結(jié)合性復(fù)合體識(shí)別而結(jié)合的CCAAT共有序列的啟動(dòng)子的控制下導(dǎo)入。根據(jù)本發(fā)明的突變體酵母，由于組成型表達(dá)HAP4基因或其同源基因，所以大 幅度提高目標(biāo)生產(chǎn)物的生產(chǎn)率。尤其是降低了醇生產(chǎn)率的突變體酵母中通過組成型表達(dá) HAP4基因或其同源基因而能不導(dǎo)致生長(zhǎng)速度以及發(fā)酵速度的降低就能夠提高目標(biāo)生產(chǎn)物 的生產(chǎn)率。如此，通過利用本發(fā)明的突變體酵母而能大幅度提高目標(biāo)生產(chǎn)物的收率，能 顯著削減目標(biāo)生產(chǎn)物的生產(chǎn)成本。實(shí)施例下面使用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍并不被以下 的實(shí)施例所限定。〔實(shí)施例1〕LDH基因?qū)?PDCl基因破壞用DNA片段的制作首先，對(duì)成為宿主的酵母導(dǎo)入乳酸脫氫酶(LDH)基因作為外來基因的同時(shí)，制 作了用于破壞與醇合成相關(guān)的丙酮酸合成酶基因(PDC1基因)的DNA片段。具體為，以特開2003-259878號(hào)公報(bào)所公開的質(zhì)粒pBTrp-PDCl-LDHKCB為模 板，將融合了 PDCl啟動(dòng)子、LDH基因以及TDH3終止子的DNA片段，以PCR進(jìn)行擴(kuò) 增。該 PCR 中作為引物使用了 TB215(5' -GAAACAGCTATGACCATGATTACG-3‘ 序列號(hào) 3)和 TB1497 (5 ‘ -AAGCTCTTAAAACGGGAATTCCCCTAAGAAACCAT-3 ‘序 列號(hào)4)(參照?qǐng)D1)。另一方面，以質(zhì)粒pRS403(可從ATCC獲取)為模板，擴(kuò)增HIS3基因。該 PCR 中作為引物使用了 TB1421 (5' -ATGGTTTCTTAGGGGAATTCCCGTTTTAAGAGCT T-3'序列號(hào) 5)禾口 TB422(5' -GACCAAGTTAGCTGGTCGAGTTCAAGAGAAAAAAA AAG-3'序列號(hào) 6)。另外，以上述pBTrp-PDCl-LDHKCB為模板，對(duì)PDCl基因的下游區(qū)域DNA 片段以PCR進(jìn)行了擴(kuò)增。該P(yáng)CR中作為引物使用了 TB1147(5' -CCAGCTAACTTGGT CGACTTG-3 ‘序列號(hào) 7)和 TBO 19(5' -GCGCGTAATACGACTCACTAT-3 ‘序列號(hào)8)。以如上擴(kuò)增的3種類的PCR產(chǎn)物為模板，利用Shevchuk，N.Α.等的方法(Shevchuk, N.A.et al. (2004) Construction of long DNA moleculesusing long PCR-based fusion of several fragments simultaneously.Nucleic Acids Research 32 (2) el9),結(jié)合 3 禾中類 的 PCR產(chǎn)物。該 PCR 中作為引物使用了 TB151(5' -CCTATCTCTAAACTTCAACACC-3'序列號(hào) 9)和 TB152(5' -TCAGCAATAGTGGTCAACAACT-3‘序列號(hào) 10)。其
中，所得DNA片段含有PDCl啟動(dòng)子、LDH基因以及TDH3終止子以該順序融合的區(qū) 域、和作為選擇標(biāo)記的LEU2基因、以及作為重組用區(qū)域的PDCl基因的下游區(qū)域。以 下、將該DNA片段稱為「LDH基因?qū)?PDCl基因破壞用DNA片段」。PDC5基因破壞用DNA片段的制作另外，本實(shí)施例中制造了用于破壞PDC5基因的DNA片段。具體是以釀酒酵母 BY4742株(Invitrogen社)的基因組DNA為模板，分別將PDC5基因的5 ‘上游非翻譯區(qū) 域DNA片段和3'下游非翻譯區(qū)域DNA片段以PCR進(jìn)行了擴(kuò)增(參照?qǐng)D2)。使用的 PCR 用引物為，前者是 TB604(5' -TTCGCATCTAAGGGGTGGTG-3 ‘序列號(hào) 11)和 TB607(5' -GCGTGTACGCATGTAACTTTGTTCTTCTTGTTATT-3'序列號(hào) 12)，后者 是 TB599(5' -CTAACATTCAACGCTAGACGGTTCTCTACAATTGA-3'序列號(hào) 13)和 TB501(5' -TAAGAAGGCATGTTGGCCTCTGT-3‘序列號(hào) 14)。另外，以特開2003-259878號(hào)公報(bào)公開的質(zhì)粒ρΒΗΡΗ_ΡΤ為模板，將潮霉素抗 性基因的表達(dá)盒以PCR進(jìn)行了擴(kuò)增。使用的PCR用引物為ΤΒ606 (5 ‘ -AATAACAAGA AGAACAAAGTTACATGCGTACACGC-3 ‘序列號(hào) 15)和 ΤΒ598 (5 ‘ -TCAATTGTAGA GAACCGTCTAGCGTTGAATGTTAG-3 ‘序列號(hào) 16)。以如上擴(kuò)增的3種PCR產(chǎn)物為模板，利用上述的Shevchuk， N.A.等的方法，結(jié)合了 3種類的PCR產(chǎn)物。該P(yáng)CR中作為引物使用了 TB070(5' -GGAGACCCACTGTACAAC-3 ‘序列號(hào) 17)禾口 TB210 (5 ‘ -GCAGCTGAA AGATAATAAGGTATG-3 ‘序列號(hào)18)。以下將該DNA片段稱為「PDC5基因破壞用 DNA片段」。HAP4基因過度表達(dá)用DNA片段的制作另外，本實(shí)施例中制作了用于將釀酒酵母來源HAP4基因過度表達(dá)的DNA片 段。具體是以釀酒酵母BY4742株的基因組DNA為模板，將含PDC6基因的一部分和其 5'上游非翻譯區(qū)域的DNA片段、含HAP4基因和其終止子區(qū)域的DNA片段、含TDH2 啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段、含CTTl基因的5'上游非翻譯區(qū)域的DNA片段，以PCR進(jìn) 行了擴(kuò)增(參照?qǐng)D3)。使用的PCR用弓丨物分別為TB1021 (5 ‘ -CCTTGATGCGTGCGTA ACC-3 ‘序列號(hào) 19)禾口 TB910(5' -AAACGCGTGTACGCATGTAATCTCATAAACCTAT GCACTG-3 ‘序列號(hào) 20)、TB911(5' -TCATATTCGACGATGTCGTCCGAACTACAGT TATCGCCTC-3 ‘:序列號(hào) 21)和 TB679(5' -CACACAAACAAACAAAACAAAATGACC GCAAAGACTTTTCTAC-3 ‘序列號(hào) 22)、TB680(5' -GTAGAAAAGTCTTTGCGGTCA TTTTGTTTTGTTTGTTTGTGTG-3 ‘序列號(hào) 23)禾口 TB900 (5 ‘ -ATATATCTGCAGGGAT CCCTTGACGGGTATTCTGA-3 ‘序列號(hào) 24)、TB899(5' -TCAGAATACCCGTCAAGG GATCCCTGCAGATATAT-3 ‘序列號(hào) 25)和 TB349 (5 ‘ -CCATATTTTCGTTAGGTCATT T-3'序列號(hào)26)。另外，以特開2003-259878號(hào)公報(bào)所公開的質(zhì)粒pBble-LDHKCB為模板，將腐草霉素表達(dá)盒以PCR進(jìn)行了擴(kuò)增。使用的PCR用引物為TB909 (5 ‘ -CAGTGCATAGGT TTATGAGATTACATGCGTACACGCGTTT-3 ‘序列號(hào) 27)和 TB912 (5 ‘ -GAGGCGATA ACTGTAGTTCGGACGACATCGTCGAATATGA-3'序列號(hào) 28)。以含如上擴(kuò)增的PDC6基因的一部分和其5'上游非翻譯區(qū)域的PCR產(chǎn)物、腐 草霉素表達(dá)盒為模板，利用上述的Shevchuk，N.A.等的方法以PCR進(jìn)行了結(jié)合。使 用的 PCR 用引物為 TB315 (5 ‘ -ACCAGCCCATCTCAATCCATCT-3 ‘序列號(hào) 29)和 TB912。另外，以含如上擴(kuò)增的HAP4基因和其終止子區(qū)域的PCR產(chǎn)物、含TDH2啟動(dòng) 子區(qū)域的PCR產(chǎn)物以及含CTTl基因的5'上游非翻譯區(qū)域的PCR產(chǎn)物為模板，同樣以 PCR 進(jìn)行 了 結(jié)合。使用的 PCR 用引物為 TB911 和 TB316 (5 ‘ -AGCGTATGGGTGATGA GAGTAC-3'序列號(hào) 30)。然后，進(jìn)一步將如上結(jié)合的2個(gè)片段的DNA為模板，同樣以PCR進(jìn)行了結(jié)合。 該 PCR 中作為引物使用了 TB948(5' -GTTGAAGTCGCCTGGTAGCC-3‘序列號(hào) 31) 和 TB734(5' -TGTCCAGGCTACGTCGAATC-3 ‘序列號(hào) 32)。將最終獲得的 DNA 片 段稱為“HAP4基因過度表達(dá)用DNA片段”。LDH基因?qū)?PDCl基因破壞株的制作使用Frozen-EZ Yeast Transformation II 試劑盒(ZYMORESEARCH 公司制)， 將上述LDH基因?qū)?PDCl基因破壞用DNA片段導(dǎo)入于BY4742株進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn) 化是按照試劑盒所附帶的操作指南進(jìn)行的。轉(zhuǎn)化后、在亮氨酸選擇性培養(yǎng)基(SD-Leu)板 上播種，在30°C下培養(yǎng)3天，選取轉(zhuǎn)化體。由轉(zhuǎn)化體調(diào)制基因組DNA，以PCR法確認(rèn) 了 LDH基因?qū)?PDCl基因破壞用DNA片段整合到染色體。該P(yáng)CR中作為位于LDH 基因?qū)?PDCl基因破壞用DNA片段的外側(cè)的引物使用了 TB324 (5 ‘ -CTCATACATGTT TCATGAGGGT-3 ‘序列號(hào) 33)和 TB304(5' -ACACCCAATCTTTCACCCATCA-3 ‘ 序列號(hào)34)。其結(jié)果、破壞了 BY4742株中的PDCl基因，確認(rèn)到了 LDH基因整合到染 色體中。以下，將該轉(zhuǎn)化酵母稱為“LDH基因?qū)?PDCl基因破壞株”。LDH基因?qū)?PDCl以及PDC5基因破壞株的制作接著，使用PDC5基因破壞用DNA片段，對(duì)LDH基因?qū)?PDCl基因破壞株 進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。其中，轉(zhuǎn)化方法與上述相同。轉(zhuǎn)化后，向200 μ g/ml的含潮霉素的YPD 培養(yǎng)基板播種，在30°C下培養(yǎng)3天，選取轉(zhuǎn)化體。由轉(zhuǎn)化體調(diào)制基因組DNA，以PCR 法確認(rèn)了 PDC5基因破壞用DNA片段整合到染色體中。該P(yáng)CR中作為位于PDC5基因 破壞用DNA片段的外側(cè)的引物使用了 TB077 (5 ‘ -GGAACCCATAGATGAAGAGG-3 ‘ 序列號(hào)35)和作為位于PDC5基因破壞用DNA片段內(nèi)部的引物使用了 TB434(5' -ATCC GCTCTAACCGAAAAGG-3 ‘序列號(hào)36)。其結(jié)果，確認(rèn)到LDH基因?qū)?PDCl基因 破壞株中的PDC5基因被破壞。以下、將該轉(zhuǎn)化酵母稱為“LDH基因?qū)?PDCl以及 PDC5基因破壞株”。HAP4基因?qū)胫甑闹谱鹘又?，使用上述的HAP4基因過度表達(dá)用DNA片段，對(duì)上述LDH基因?qū)? PDCl基因破壞株以及LDH基因?qū)?PDCl以及PDC5基因破壞株進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。其中， 轉(zhuǎn)化方法與上述相同。轉(zhuǎn)化后，向100 μ g/ml的含腐草霉素YPD培養(yǎng)基板播種，30°C下 培養(yǎng)3-5天，選取轉(zhuǎn)化體。由轉(zhuǎn)化體調(diào)制基因組DNA，以PCR法確認(rèn)HAP4基因過度表達(dá)用DNA片段整合到染色體。該P(yáng)CR使用了作為位于HAP4基因過度表達(dá)用DNA片段 外側(cè)的引物TB315和作為位于HAP4基因過度表達(dá)用DNA片段內(nèi)部的引物TB1020 (5 ‘-TCCTGCGCCTGATACAGAAC-3 ‘序列號(hào)37)。其結(jié)果、確認(rèn)到LDH基因?qū)?PDCl 基因破壞株以及LDH基因?qū)?PDCl以及PDC5基因破壞株的染色體中已導(dǎo)入了 HAP4 基因過度表達(dá)用DNA片段。增殖試騎對(duì)導(dǎo)入了如上制作的LDH基因?qū)?PDCl基因破壞株(本項(xiàng)中為HAP4非導(dǎo)入 株)以及HAP4基因過度表達(dá)用DNA片段的LDH基因?qū)?PDCl基因破壞株(本項(xiàng)中 為HAP4導(dǎo)入株)進(jìn)行了比增殖速度的計(jì)算。具體為注入了 YPD(酵母提取物1%、蛋白 胨2%以及葡萄糖2%)液體培養(yǎng)基IOOml的500ml容積帶擋板燒瓶中植菌測(cè)定株，30°C、 120rpm(振幅35mm)下15 20小時(shí)振蕩培養(yǎng)后，在菌體濃度0.7 1.0%的狀態(tài)下進(jìn)行 了收集。再次以相同條件下將測(cè)定株以菌體濃度0.01%的濃度進(jìn)行植菌，增殖開始后約 每2小時(shí)采樣測(cè)定菌體濃度。比增殖速度是在增殖開始2 10小時(shí)之間，確認(rèn)對(duì)數(shù)增殖 期，以下式算出的。[數(shù)學(xué)式1]
權(quán)利要求
1.一種突變體酵母，其特征在于，導(dǎo)入編碼與目標(biāo)生產(chǎn)物的生產(chǎn)相關(guān)的酶的外來基 因、和能組成型表達(dá)的HAP4基因或其同源基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的突變體酵母，其特征在于，與野生型相比醇生產(chǎn)率降低了的 突變株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的突變體酵母，其特征在于，與醇合成相關(guān)的酶的酶活性 降低了。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的突變體酵母，其特征在于，所述與醇合成相關(guān)的酶是丙酮酸 脫羧酶和/或醇脫氫酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的突變體酵母，其特征在于，所述丙酮酸脫羧酶是由選自 PDCl基因、PDC5基因和PDC6基因中的至少一個(gè)基因編碼的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的突變體酵母，其特征在于，所述醇脫氫酶是由ADHl基因編 碼的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的突變體酵母，其特征在于，屬于酵母屬。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的突變體酵母，其特征在于，屬于釀酒酵母的菌種。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的突變體酵母，其特征在于，所述外來基因是編 碼具有乳酸脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的基因。
10.—種使用酵母的物質(zhì)生產(chǎn)方法，其特征在于，包含培養(yǎng)權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的突變體酵母，在菌體內(nèi)外生成目標(biāo)生產(chǎn)物的工 序；禾口回收所述目標(biāo)生產(chǎn)物的工序。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的物質(zhì)生產(chǎn)方法，其特征在于，所述目標(biāo)生產(chǎn)物是有機(jī)酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的物質(zhì)生產(chǎn)方法，其特征在于，所述目標(biāo)生產(chǎn)物是乳酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的物質(zhì)生產(chǎn)方法，其特征在于，所述目標(biāo)生產(chǎn)物是乙醇以外的醇。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，使用酵母生產(chǎn)目標(biāo)生產(chǎn)物時(shí)，能夠維持優(yōu)良的生長(zhǎng)速度以及發(fā)酵速度的同時(shí)還具有優(yōu)良的目標(biāo)生產(chǎn)物生產(chǎn)率。對(duì)于成為宿主導(dǎo)入編碼目標(biāo)生產(chǎn)物生產(chǎn)相關(guān)酶的外來基因、和能組成型表達(dá)的HAP4基因或其同源基因。突變體酵母優(yōu)選的是與野生型相比降低了醇生產(chǎn)率的突變體。
文檔編號(hào)C12N15/00GK102016024SQ20098011416
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者保谷典子, 多田宣紀(jì), 大西徹, 嶋村隆, 松下響, 石田亙廣 申請(qǐng)人:豐田自動(dòng)車株式會(huì)社