專利名稱：：gM-陰性EHV突變體的制作方法gM-陰性EHV突變體本申請是中國申請01805141.3的分案申請，該母案于2001年2月15日以國際申請?zhí)朠CT/EPO1/01672提交，于2002年8月16日進入中國國家階段，本分案采用了與該母案一致的發(fā)明名稱發(fā)明領域本發(fā)明涉及馬皰滲病毒(EquineHerpesViruses，EHV),其中蛋白gM基本缺失或其中gM被修飾，并且其免疫調(diào)節(jié)能力無功能。本發(fā)明進一步的方面涉及編碼所述病毒的核酸，包含這些病毒或核酸的藥物組合物及其用途。本發(fā)明也涉及增強由EHV疫苗所誘發(fā)的抗野生型EHV感染的免疫應答的方法，涉及EHV感染的預防和治療方法以及將野生型EHV感染的動物與用本發(fā)明EHV處理的動物區(qū)分的方法。發(fā)明背景馬皰滲病毒1(EHV-l)是a-皰滲病毒亞一牛(^/;/^/ze/77^vzW"ae」的一個成員，是馬的病毒誘導性流產(chǎn)的主要原因，并能引起呼吸和神經(jīng)病癥。EHV-1毒抹Ab4p的完整DNA序列已被確定(Telford,E.A.R.等，1992);然而，僅確定有少數(shù)幾個基因和基因產(chǎn)物與EHV的毒性相關。采用了兩種不同的方式以控制EHV-1的感染。首先，開發(fā)了經(jīng)修飾的活疫苗(MLVs),包括在歐洲和美國廣泛使用的病毒林RacH(Mayr，A.等,1968;Hubert,P.H.等，1996)。其次，評估滅活疫苗和獨立表達的病毒糖蛋白的免疫原性和保護潛能。用重組桿狀病毒表達的糖蛋白中，糖蛋白(g)B,C，D和H在鼠模型中誘導對后續(xù)EHV-1攻擊的部分保護(Awan，A.R.等，1990;Te麗i，D.等，1994;Osterrieder,N.等，1995;Strokes,A.等，1996)。然而，使用MLVs比滅活疫苗和亞單位疫苗更有優(yōu)勢。MLVs對于誘導細胞介導的免疫應答是高效的，而細胞介導的免疫應答最有可能提供抗疾病的保護(Allen,G.P.等，1995;Mumford,J.A.等，1995)。皰滲病毒糖蛋白主要涉及感染的早期，病毒粒子從細胞中的釋放，以及通過相鄰細胞間融合導致的病毒粒子的直接細胞到細胞傳播。目前已確立了ll種單純皰滲病毒l型(HSV-1)編碼的糖蛋白，定名為gB，gC,gD,gE，gG，gH，gl，gJ,gK，gL,和gM。缺乏gC,gE，gG，gl，gJ,和gM的HSV-1突變體是具有活性的，顯示這些基因對培養(yǎng)細胞的復制是非必需的。HSV-1和馬皰滲病毒1的核苷酸序列對比表明，所有已知的HSV-1糖蛋白在EHV-1中都是保守的。根據(jù)目前的命名法，這些糖蛋白都根據(jù)其HSV-1同系物定名。已知EHV-1的gC，gE，和gl不是細胞培養(yǎng)物生長所必需的，而gB和gD對于病毒在培養(yǎng)細胞中的生長是必需的。其他EHV-1糖蛋白對于病毒在培養(yǎng)細胞中復制的作用仍未知(Flowers,C.C.等，1992)。利用入gtll表達文庫和抗純化EHV-1的單克隆抗體(MAbs)對EHV-1的六種包膜糖蛋白進行作圖(Allen,G.P.等，1987)。此外，轉錄分析和蛋白分析表明糖蛋白gB，gC，gD，gG，gH和gK在EHV-l感染的細胞中表達。糖蛋白gM是最近被詳細分析的HSV-1糖蛋白(由基因UL10編碼，Braines,J.D.等，1991;Baines,J.D.等，1993)。其是被報道的唯一的在所有皰滲病毒亞科中都保守的非必需糖蛋白，對人和鼠巨細胞病毒以及，皰疹病毒亞科(G(37w附aAe77esWn'wae)成員EHV-2，herpesvirussaimiri,和Epstein-Barr病毒中的這種糖蛋白已有描述。如同許多皰奢病毒糖蛋白一樣，HSV-1的gM存在于病毒粒子和被感染細胞的膜中。只缺少gM的HSV-1突變體的效價比野生型病毒效價降低約10倍，并且在鼠模型中表現(xiàn)出毒性降低(Baines,J.D.等，1991;MacLean,C.A.等,1993)。EHV-1的gM同系物(gp21/22a;從現(xiàn)在起作為EHV-1gM)最初由Allen和Yeargan說明(Allen,G.R等，1987),證明是一種病毒包膜的主要組分。進一步的研究表明基因52，即與HSV-1UL10同源的基因，編碼450個氨基酸的EHV-1gM多肽(Pilling,A.等，1994;Telford,E.A.R.等，1992)。EHV-1gM代表一種多疏水蛋白，其包含8個預期的跨膜結構域，并有^Jt表明其作為M/15000蛋白存在于感染的細胞和純化的病毒粒子中(Pilling,A.等，1994;Telford,E.A.R.等，1992)。1996年Osterrieder等將大腸桿菌lacZ基因插入到EHV-1毒抹RacLll的gM基因(開放閱讀框52)中，把帝有這種基因的病毒突變體(LllAgM)的穿透特性與親本EHV-1RacLll的穿透特性相比，從實驗中得出結論EHV-lgM對于病毒穿透進入耙細胞以及所述病毒在細胞到細胞的傳播有重要作用。1997年，Neubauer等通過對被免疫小鼠脾臟中的病毒中和抗體和EHV-1特異性T細胞的檢驗，表明上述EHV-1的gM插入突變體是減毒的，并誘導保護性免疫。本發(fā)明要解決的技術問題是提供新的修飾的馬皰疹病毒，當用于預防和治療EHV感染時，所述馬皰滲病毒表現(xiàn)顯著增強的免疫原性。發(fā)明公開對于上述技術問題的解答通過杈利要求中定義的說明和實施方案實現(xiàn)。我們驚訝地發(fā)現(xiàn)如果蛋白gM基本缺失或所述蛋白被修飾，從而使其本可能具有的免疫調(diào)節(jié)能力無功能，則對于馬皰滲病毒的保護性免疫力會有顯著的增強。因此，這是首次表明蛋白gM調(diào)節(jié)EHV的免疫原性。有意思的是，先前討論的病毒突變體UlAgM和HAgM-Ins也誘導親本毒抹RacLll和RacH的免疫原性'盡管Osterrieder等，1996和Neubauer等，1997的作者沒有用當時可得的抗體檢測HAgM-Ins病毒的gM，但HAgM-Ins突變體仍表現(xiàn)與產(chǎn)生gM的親本毒抹相似的免疫調(diào)節(jié)潛能。其原因可能是，盡管在公開的實驗中Western印跡證明了lacZ的插入，但HAgM-Ins中gM的殘留部分得以表達。因此gM的這一殘留部分一定與gM的免疫調(diào)節(jié)活動有關。因此，本發(fā)明首次提供了一種EHV，其蛋白gM基本缺失或所述蛋白被修飾，從而其在病毒宿主中的免疫調(diào)節(jié)能力無功能。一個方面，本發(fā)明涉及馬皰滲病毒，其中蛋白gM基本缺失。另一個同樣重要的方面，本發(fā)明涉及馬皰滲病毒，其中所述蛋白被修飾并且無功能。此處所用術語"基本缺失"是因為相鄰必需蛋白UL9同系物基因(基因53)的位置，其方向以及與編碼gM蛋白的基因的重疊，因此需要保留最短的gM基因的核苷酸序列以使基因53能夠表達，從而保留病毒活性。一個優(yōu)選的實施方案涉及EHV，其中gM基因的至少70%缺失，而一個更優(yōu)選的實施方案中對一種EHV要求了杈利，其中gM基因的至少80%缺失，而一個更優(yōu)選的實施方案中對一種EHV要求了杈利，其中gM基因的至少90%缺失d術語"無功能，，蛋白gM應被理解是所述蛋白相關于病毒-宿主間相互作用的免疫調(diào)節(jié)力。本發(fā)明的EHV與其他表達功能性gM的EHV毒株間免疫原性的差異，可通過獸醫(yī)病毒學現(xiàn)有領域普通專家可得的標準動物模型進行確定。確定EHV表達功能性或非功能性gM的一個可能方法在實施例1中給出。所述方法提供了一種精確并且直接的實驗方案，用于確定修飾的目的EHV毒抹與其他毒抹之間免疫調(diào)節(jié)能力的差異，所述其他毒株與目的毒株相比，差異僅在于其他毒株表達完整的未修飾的功能性gM蛋白。實施例1中所述方法特別合適，因為在BALB/c小鼠中EHV毒株的行為與天然宿主中單個病毒的相一致(Mayr，A.等，1968;vanWoensel,P.A.M.等，1995;Colle,C.F.等，1996;Hubert,RH.等,1996;Matsumura,T.等,1996)。對于從EHV中缺失蛋白gM或使其無功能，可有多種方法(Sambrook，J.等，1989)。非限制性例子包括在編碼蛋白gM的基因中的缺失、突變或插入。所述病毒中相應的完整或部分核苷酸序列的缺失可能導致gM蛋白的完全缺失或無功能表達。通過在該基因或其調(diào)節(jié)區(qū)域中突變核苷酸序列或插入額外的核苷酸，也可獲得同樣的結果。在上述兩個方面的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及EHV，其根據(jù)本發(fā)明在編碼蛋白gM的基因中因缺失、突變或插入而改變。gMORF與UL9ORP和啟動子序列重疊(位置94389到97052，Ori結合蛋白，Telford等，1992)。由UL9ORF編碼的蛋白對于病毒生長是必需的，如在HSV-1中例示(Carmichael等，1988;Malik等，1992)。因此，一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的EHV，其特征在于編碼蛋白gM的基因被缺失或修飾，并且編碼UL9同系物的基因(基因53)的表達不受影響。術語"不受影響"并不涉及UL9的特定數(shù)量或質量特征，而僅僅指該基因的表達不受影響，只要病毒表達所述蛋白，并且所述蛋白以對于病毒活性基本足夠的量存在。本發(fā)明公開了一種實施本發(fā)明最優(yōu)選的EHV，其中病毒抹EHV-1Ab4p的核苷酸93254到94264(Tdford，E.A.R等，1992)或其他毒株中相應位置被缺失，其中的核苷酸編號僅為舉例。共有1352個核苷酸的gMORF上這1010個核苷酸的缺失，導致任何可檢測的gM多肽的基本缺失。這種gM基因核苷酸的幾乎完全缺失仍然產(chǎn)生活病毒，所述活病毒基本不表達gM蛋白衍生物，因此所有其他EHV-1基因的表達不受影響。這種部分的缺失不影響UL9ORF的表達。上述核苷酸的位置參照Telford等，1992(GenBank/EMBL數(shù)據(jù)庫(接入號M86664))針對EHV-1毒株Ab4p的編號。這些核苷酸位置決不僅限于Ab4pEHV-1毒株中定義的確切位置，而只以舉例的方式用來指出在這些位置的核苦酸或其他EHY毒株中相應于gM基因這些位置的核苷酸。對于不同的EHV病毒，優(yōu)選核酸的位置編號可能有所不同，但對于a-皰疹病毒科的病毒分子生物學領域專家可通過其相對于所述序列的其他核苷酸的位置，容易地識別這些優(yōu)選的核苷酸。與gM基因相鄰的基因的功能性表達對于病毒的活性是重要的。根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的EHV毒株是EHV-1毒抹HAgM-3bl，其保藏在ECACC(歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心，Salisbury,UK)，保藏號99101536。本發(fā)明特別適用于EHV的1型和4型，因為這二者親源關系極近(Telford,E.A.R.等，1992和1998)。本發(fā)明的EHV特別適用于基因治療，適用于攜帶一般性的異源物質，尤其適合于攜帶外源抗原用于活疫苗(對于EHV作為異源載體，參見EP507179，WO9827216，WO9400587，WO9827216)。當本發(fā)明的EHV在動物中表達異源物質時，對于與gM相關的免疫特性沒有影響。將針對其它病原體具有相關免疫特性的相應核苷酸序列插入本發(fā)明EHV病毒的基因組后，該抗原被表達時，EHV特別適用于針對所述其他病原體進行免疫。皰滲病毒載體疫苗屬于現(xiàn)有技術(參見Schmitt,J.等，1999;Peeters,B.等，1997,Yoloyama等，1998)。因此，在優(yōu)選實施方案中本發(fā)明也涉及攜有一或多種異源基因的本發(fā)明EHV。本發(fā)明另一方面也涉及編碼本發(fā)明EHV的核酸。所述核酸適用于進一步改變EHV或用于重組產(chǎn)生本發(fā)明的EHV。它們也可用于產(chǎn)生基于核酸的疫苗。由于表達修飾的無功能gM或根本不表達gM的EHV具有增強的免疫特性，本發(fā)明的EHV特別適合作為預防和治療EHV感染的藥物組合物的活性成分。因此，另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明EHV的藥物組合物。本發(fā)明的核苷酸也可用于制備DNA載體疫苗。這些疫苗中，核苷酸直接給予動物或通過除起始病毒以外的其他載體間接給予。核苦酸疫苗和載體疫苗是現(xiàn)有技術中眾所周知的，因此不進一步地詳述。一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含本發(fā)明核酸的藥物組合物。本發(fā)明還涉及一種包含本發(fā)明EHV的藥物組合物。包含本發(fā)明EHV的藥物組合物一個非限制性實例可通過以下方法制備將感染的細胞培養(yǎng)物上清與一種穩(wěn)定劑(如亞精胺和/或BSA(牛血清白蛋白))混合，接著通過其他方法使該混合物凍干或脫水。接種之前，所述混合物在水相(如鹽水，PBS(磷酸緩沖鹽溶液))或非水相溶液(如油乳液，基于鋁的佐劑)中重新水合。EHV和其核普酸特別運合用于制備藥物組合物。"藥物組合物，，基本上包含一種或多種下述成分，所述成分可修飾用其給藥的生物，或在其表面內(nèi)或表面上生活但不受制于抗生素或抗寄生蟲劑的生物的生理功能(如免疫功能)，還包含用于其它目的的其他組分，所述目的例如但不限于，加工特性，無菌性(sterility)，穩(wěn)定性，通過胃腸或胃腸外途徑(如口服、鼻內(nèi)、靜脈、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮或其他適當?shù)耐緩?給藥的便利性，給藥后的耐受性，控釋特性。其他實施方案中，本發(fā)明涉及增強馬皰疹病毒疫苗所誘導的抗野生型病毒感染的免疫應答的方法，其特征在于所述疫苗包含本發(fā)明的馬皰疹病毒。另一方面涉及一種預防和/或治療動物的方法，其特征在于本發(fā)明的一種藥物組合物被給予所述動物?，F(xiàn)有EHV活疫苗的另一方面是其與野生型病毒區(qū)分的能力。本發(fā)明的EHV至少在一個重要的特性上不同于野生型分離林。其提供一種顯著改變的gM蛋白。gM基本缺失或者被修飾到一定程度，使得該特異性抗原靶與野生型病毒的gM顯著不同。一個優(yōu)選實施方案涉及區(qū)分野生型馬皰瘆病毒感染的動物和用本發(fā)明修飾的馬皰滲病毒處理的動物的方法，其特征在于確認病毒野毒林的gM蛋白或在修飾病毒中表達的gM蛋白或所述蛋白的基本缺失。一個更優(yōu)選的實施方案涉及上述提及的方法，其特征在于a)目的樣品被加入一種分離的gM或其經(jīng)修飾的衍生物中，b)加入特異于所述分離的gM或其經(jīng)修飾的衍生物的抗體，c)確定所述抗體的結合。一種更優(yōu)選的實施方案涉及區(qū)分野生型馬皰滲病毒感染的動物和用本發(fā)明改變的馬皰滲病毒處理的動物的方法，其特征在于確認編碼病毒野毒抹的gM蛋白的核酸與編碼修飾的gM蛋白的核酸或所述核酸的缺失之間的差異。本發(fā)明另一個方面涉及試劑盒，所述試劑盒可實施區(qū)分野生型馬皰疹病毒感染的動物和本發(fā)明改變的馬皰瘆病毒處理的動物的優(yōu)選方法。一個方便使用的試劑盒優(yōu)選包含一種或多種必需的分析工具，緩沖液，標記和解讀工具，溶劑以及機械裝置。優(yōu)選的特異性分析工具是分離的野生型蛋白gM,分離的修飾蛋白gM，特異于野生型蛋白gM的抗體，特異于分離的修飾蛋白gM的抗體，以及與編碼野生型蛋白gM的核苷酸結合的核苷酸特異性探針和與編碼修飾蛋白gM的核苷酸結合的核普酸特異性探針。Allen,G.P"Yeargan,M.,Costa,L.R.R.andCross,R.,1995.MajorhistocompatibilitycomplexclassI-restrictedcytotoxicT-lymphocyteresponsesinhorsesinfectedwithequineherpesvirus1.J.Virol.69，606-612.Allen,G.P"Yeargan,M.R.，1987.Useof入gtllandmonoclonalantibodiestomapthegenesforthesixmajorglycoproteinsofequineherpesvirus1.丄Virol.61,2454-2461.Awan，A.R.，Chong,Y.-C.andField,H.J.，1990.Thepathogenesisofequineherpesvirustype1inthemouse:Anewmodelforstudyinghostresponsestotheinfection.J,Gen.Virol.71，1131-1140.Baines,J.D.andRoizman,B.，1991.TheopeningreadingframesUL3,UL4,UL10andUL16aredispensableforthereplicationofherpessimplexvirus1incellculture.J.Virol.65，938-944.Baines,J.D.andRoizman,B.，1993.TheUL10geneofherpessimplexvims1encodesanovelviralglycoprotein,gM,whichispresentinthevirionandintheplasmamembraneofinfectedcells.J.Virol.67，1441-1452.Carmichael，E.P.，KosovskyM.J.，andWeller，S.K.，1988.Isolationandcharacterizationofherpessimplexvirustype1hostrangemutantsdefectiveinviralDNAsynthesis.J,Virol.62(1),91-99.Day,L，1999.Characterizationofselectedglycoproteinsofequineherpesvirus-1:immuneresponsesinthemurinemodel.PhDthesis,DepartmentofMicrobiology,UniversityofLeeds,UK.FlowersC.C.andO'Callaghan,D丄，1992.Theequineherpesvirustype1(EHV隱l)homologofherpessimplexvirustype1US9andthenatureofamajordeletionwithintheuniqueshortsegMentoftheEHV-1KyAstraingenome.Virology190,307-315.Hubert,P.H.，Birkenmaier，S.，Rziha，H.J.andOsterrieder，N.,1996.Alterationsintheequineherpesvirustype-1(EHV-1)strainRacHduringattenuation.J.Vet.Med.B43,1-14.Kyhse-Andersen，J,1984.Electroblottingofmultiplegels:asimpleapparatuswithouttankforrapidtransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulose.J.Biochem.Biophys.Methods10，203-210.Laemmli，U.K.,1970.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227,680-685.MacLean，C.A.,Robertson,L.M.andJamieson，F(xiàn).E.，1993.CharacterizationoftheULlOgeneproductofherpessimplexvirustype1andinverstigationofistroleinvivo.J.Gen.Virol.74,975-983.Malik,A.K.，Martinez,R.，Muncy，L，Carmichael，E.P.andWeller，S.K.,1992.Geneticanalysisoftheherpessimplexvirustype1UL9gene:isolationofaLacZinsertionmutantandexpressionineukaryoticcells.Virology190(2),702-715.Mayr，A.，Pette，J.，Petzoldt，K.andWagener，K.，1968.UntersuchungenzurEntwicklungeinesLebendimpfstoffesgegendieRhinopneumonitis(Stutenabort)derPferde,.J.Vet.Med.B15，406-418.Meindl,A.andOsterrieder，N.，Theequineherpesvirus1Us2homologencodesanonessentialmembrane-associatedvirioncomponentJ.Virol"73(4):3430-7,1999.Mumford，J.A.，Hannant，D.A.,Jessett，D./M.，O'Neill，T.，Smith,K.C.andOstlund，E.N.，1995.Abortigenicandneurologicaldiseasecausedbyexperimentalinfectionwithliquidherpesvirus-1.In"Proceedings7thInternationalConferenceofEquineInfectiousDisease"(H.NakajimaandW.Plowright,Eds.)pp.261-175.R&WPubl.Newmarket,U.K..UnitedKingdom.Neubauer，A.，Beer,M.，Brandmuller，C.，Kaaden，O.-R.,andOsterrieder,N.，1997.Equineherpesvirus1mutantsdevoidofglycoproteinBorMareapathohenicformicebutinduceprotectionagainstchallengeinfection.Virology239,36-45.Osterrieder,N.，Neubauer,A.，Brandmiiller，C.，Braun，B.，Kaaden，O.-R.andBaines，J.D.，1996.Theequineherpesvirus1glycoproteingp21/22a,theherpessimplexvirustype1gMhomolog,isinvolvedinviruspenetrationandcell-to-cellspreadofvirions.Journalofvirology,June1996,p.4110-4115.Osterrieder,N.，Wagner,R.，Brandmuller,C.，Schmidt,P"Wolf，H.andKaaden，O.-R.,1995.ProtectionagainstEHV-1challengeinfectioninthemurinemodelaftervaccinationwithvariousformulationsofrecombinantglycoproteingpl4(gB).Virology208,500-510.Peeters，B.，Biendowska-Szewcyk，K.,Hulst，M.，Giellens，A.andKimman，T"1997.Biologicallysafe,non-transmissiblepseudorabiesvirusvectorvaccineprotectspigsagainstbothAujeszky'sdiseaseandclassicalswinefever.J.Gen.Virol.78,3311-3315.Pilling,A.，Davison,A.J.，Telford,E.A.R.andMeredith,D.M.,1994.Theequineherpesvirustype1glycoproteinhomologoustoherpessimplexvirustype1glycoproteinMisamajorconstituentofthevirusparticle.J.Gen.Virol.75，439-442.Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch，D.F.andManiatis,T"l卿.MolecularCloning:Alaboratorymanual.2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY.Schmitt，J>,Becher，P"Thiel，H.J.andKeil，G.M.，1999.ExpressionofbovineviraldiarrheavirusglycoproteinE2bybovineherpesvirus-1fromasyntheticORFandincorportationofE2intorecombinantvirions.J.Gen.Virol.80,2839-2848.Stokes,A.，Alber，D.G.，Greensill，J.，Ameiiai,B.，Carvalho，R.，Taylor,L.A.，Doel，T.R.，Killington，R.A.，Halliburton,I.W.andMeredith,D.M.，1996.Theexpressionoftheproteinsofequineherpesvirus1whichsharehomologywithherpessimplexvirus1glycoproteinsHandL.VirusRews.40，91-107.Telford,E.A.R"Watson,M.S.,McBride，K.andDavison,A.J.，1992.TheDNAsequenceofequineherpesvirus-1.Virology189,304-316.Telford,E.A.R.,Watson，M.S.，Perry,J.，Cullinane，A.A.andDavison,A.J.，1998.TheDNAsequenceofequineherpesvirus-4.JournalofGen.Virol.79，]197-1203.Tewari，D.，Whallery，J.M.，Love,D.N.，andField,H.J.，1994.Characterisationofimmuneresponsestobaculovimsexpressedequineherpesvirustype1glycoproteinsDandHinamurinemodel.J.Gen.Virol.75，1735-1741.Yoloyama,N.，F(xiàn)ujita,K.，DamianiA"Sato,E.，Kurosawa,K.，Miyazawa,T"Ishiguro,S.，Mochizuki,M.,Maeda，K.andMikami，T"1998.Futherdevelopmentofarecombinantfelineherpesvirustype1vectorexpressingfelinecalicivirusimmunogenicantigen.J.Vet.Med.Sci.60,717-723.圖1:平均體重分析圖1是平均體重分析，以相對于感染攻擊當天組的平均體重的百分比表示°HAgM-3bl免疫組(第7到9組)與其他所有的免疫組比4交，以分析該病毒與其他兩種病毒相比的潛在優(yōu)勢，因為該病毒的糖蛋白M基本上完全的缺失(氨基酸70到406被缺失)，而對于HAgM-Ins(第4到6組)，gM開放閱讀框因LacZ盒的插入而被破壞。然而，這種病毒突變體仍能表達gM開放閱讀框的羧基末端部分(可能開始于226位的甲疏氨酸殘基)。RacH(組1到組3)是HAgM-3bl和HAgM-Ins的親本病毒，代表一種廣泛使用的疫苗抹。接種了HAgM-3bl的動物在以103PFU接種的小鼠(第9組)中，與接種103PFUHAgM-Ins(第6k)或103PFURacH(第3組)相比，有最低的暫時體重下降。與接種HAgM-Ins(第4-6組)或RacH(第1-3組)相比，接種HAgM-3bl的組(第7-9組)預防攻擊后體重降低的劑量依賴性降低。圖2:病毒效價分析對每組中感染后(p.i.)l天的2只動物、感染后3天的3只動物、和感染后5天的2只動物進行尸檢。制備鼠肺，用海沙勻漿，用1ml的DMEM-10%FCS重懸。通過Neubauer等，1997年所述的噬斑試驗確定肺勻漿物中的病毒效價。數(shù)據(jù)表明用HAgM-3bl免疫后(第7-9組)，從肺組織(每個肺單獨制備，每個肺的平均病毒效價如圖所示)中重新分離的EHV病毒的量，與HAgM-Ins(第4-6組)或RacH(第1-3組)免疫的組相比，是降低的。這種效果在各種病毒各自的最低接種劑量(103PFU)比較高接種劑量(104或105PFU)吋更強烈。與H△gM-Ins或RacH免疫的小鼠相比，病毒血癥的持續(xù)時間也縮短，表現(xiàn)為5天后從HAgM-3bl免疫的動物中重新分離的病毒量顯著降低，特別是在用10SPFU劑量接種的組中。圖3:Western印跡分析利用抗gB單克隆抗體3F6(Allen和Yeargan,由Dr.G.Allen,Lexington,Ky,U.S.A.惠贈)(A)或抗gM單克隆抗體A8(由Dr.R.A.Killington,Leeds,UK惠贈)(B)對被感染細胞的裂解物進行Western印跡分析。將細胞裂解物懸浮在樣品緩沖液中，并立即用SDS-10%-PAGE分離。將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，與單抗一同孵育，如材料和方法一節(jié)所述進行檢測。1泳道RacH感染的細胞；2泳道HAgM-Ins(插入突變體)感染的細胞；3泳道HAgM-3b1感染的細胞；4泳道用HAgM-3bl在Rkl3細胞中生長的第二代感染的細胞。A組中，被RacH,HAgM-Ins和HAgM-3bl感染的細胞中gB的特異性識別清楚地表明感染細胞中病毒蛋白的表達和病毒的復制。gB的二聚體和寡聚體清晰可見，表明進行了運當?shù)奶堑鞍准庸?。B組中，單克隆抗體A8識別RacH感染的細胞中具有預期表觀分子量的gM蛋白(l泳道)。H△gM-Ins中，開放閱讀框因插入LacZ基因而被中斷。相應地，被特異性識別的gM蛋白的表觀分子量更低(2泳道)。HAgM-Ins表達的gM蛋白的Western印跡信號強度與在RacH感染的細胞中獲得的信號相當，這清楚地表明這種截短并不能導致gM蛋白在感染細胞中表達的失敗或所述蛋白的立即降解。此外，gM的羧基末端部分似乎在HAgM-Ins的情況下表達，因為A8抗體直接岸巴向gM羧基末端的親水部分。在3和4泳道，如上所述在HAgM-3bl中缺失相應核苷酸序列后并未如預期那樣^r測出gM蛋白。材料和方法(Western印跡分析)Western印跡分析中，感染細胞的裂解物用BCATM分析(Pierce)調(diào)整到相同的蛋白濃度，懸浮于樣品緩沖液(終濃度50mMTris-CI,pH6.8;3.2%十二烷基磺酸鈉(SDS);5%2-蔬基乙醇；10%甘油)中。整個過程中都將樣品放置在冰上，不能受熱。通過不連續(xù)的SDS-10Q/o-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(Laemmli,1970)分離蛋白，通過半干法(Kyhse-Andersen,1984)轉移到硝酸纖維素膜(Schleicher&SchuII)上。轉膜后，將膜溫育于10%脫脂乳的磷酸緩沖鹽溶液(含0.05。/oTween20，PBS-T))中，4。C16小時。室溫(RT)下用PBS-T洗膜兩次，每次10分鐘，接著以在PBS-T中指定的稀釋度加入抗gB單克隆抗體(mab)3F6(Allen和Yeargan，1987)或抗gMmabA8(Day，1999),硝酸纖維素膜與單克隆抗體在室溫下溫育1小時，然后用PBS-T洗膜兩次(室溫，10分鐘)。用過氧化物酶偶聯(lián)的抗小鼠免疫球蛋白G抗體(Sigma)，按照供應商的說明，在室溫下作用1小時以檢測結合的單克隆抗體。兩次最后的洗膜步驟(PBS-T,IO分鐘)后，通過增強的化學發(fā)光(ECLTM,Amersham-Pharmacia)按照供應商的說明使反應性條帶可見。圖4:HAgM-3bl基因組的圖示EHV-1RacH病毒的gM區(qū)的BamHI限制性酶切圖譜和基因組組構(organization)，以及gM陰性RacH病毒H△gM-3bl的結構。給出了克隆中使用的限制性酶切位點，并且是按比例的。實施例實施例1:檢測gM對于病毒免疫原性的影響實驗設計將3-4周齡BALB/c小鼠(CharlesRiver)隨機分為10組，各組包含14只動物，鼻內(nèi)(i.n.)分別免疫接種RacH(第1到第3組)，gM陰性插入突變體HAgM-Ins(Neubauer等，1997)(第4到第6組)或缺少幾乎整個gM開放閱讀框的HAgM3bl病毒(第7到第9組)。小鼠被一次性給予20jil溶液進行免疫，所述溶液中分別含有l(wèi)xlOS噬斑形成單位(PFU)(第1，4，7組)，lx104PFU(第2,5,8組)，或lxl03PFU(第3,6,9組)，如所示。用20pi的DMEM-10%FCS對小鼠進行模擬物感染(第10組)。免疫29天后，用懸浮于20jal溶液中的lxl04PFU的RacLll毒抹鼻內(nèi)感染小鼠。從感染當天(O天)到第13天，每日對各小鼠的體重進行評分。根據(jù)以下公式計算第0天到第13天的相對體重(以％表示)第n天的體重/第0天的體重xl00%。感染后(p丄)第一天的2只動物、感染后第3天的3只動物、和感染后第5天的2只動物進行尸檢。制備鼠肺，用海沙勻漿，用1ml的DMEM-10o/oFCS(Meindl&Osterrieder，1999)重懸。鼠肺中的病毒效價在Rkl3細胞中測定(Neubauer等，1997)。如下所述對每曰記錄的體重進行統(tǒng)計學分析。研究目的本研究的主要目的是表明HAgM-3bl免疫(第7-9組)與RacH(第I-3組)或HAgM-Ins(第4-6組)免疫相比，保護潛力的差異，這種比較是通過用毒性EHV-1株感染攻擊后的體重參數(shù)來確定的。第二個目的是將第1到9組與模擬物感染的組(組IO)進行比較。HAgM-3bl免疫的組(第7-9組)與所有其他免疫組進行比較，以分析這種病毒與其他兩種病毒相比的有利效果，因為這種病毒的糖蛋白M幾乎完全缺失，而對于HAgM-Ins(第4-6組)，gM開放閱讀框^又因為LacZ盒的插入而被中斷。然而，這種病毒突變體仍可表達gM升放閱讀框的羧基末端部分。RacH(第1-3組)是HAgM-3bl和HAgM-Ins二者的親本病毒，并且代表一種廣泛使用的疫苗株。統(tǒng)計學方法使用SAS(Heiddberg)軟件包WinVersion6.12在個人電腦上進行統(tǒng)計學分析。為了評估初級終點，用SAS的PROCGLM重復方差分析，使用CONTRAST聲明(statement)以便在選定組間進行針對性比較。為了將不平衡的情況考慮在內(nèi)(在不同天數(shù)時動物的數(shù)量不同)，使用PROCGLM(概括性(Generalized)線性模式)替代PROCANOVA。程序procglmdata=iaaus*obser;classgroupmodelcoll-一coll4=group,.repeatedtime14(1234567891011121314)/summary;contrast'group10vsothers'9,'contrast'group7vsgroup40,.contrast'group7vsgroup1contrast'group8vsgroup20/contrast，group8vsgroup50,.contrast，group9vsgroup30,'contrast，group9vs.group6O,.meansgroup/waller,'run,.quit/group_1-l一l一l一l一l一l一lgroup000-l00100group-l00000100groupO-l0000010group0000-l0010group00-l000001groupOOOO'O-lOOl體重評估的結果:小鼠的平均重量(克)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>1、模擬物感染的動物(第IO組)與免疫動物的對比下表證實，用模擬物免疫的動物的平均體重與所有其他的組相比，在攻擊感染后有統(tǒng)計學上顯著的降低(第3天)或統(tǒng)計學上極其顯著的降低(第4到13天)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>l=#r-驗統(tǒng)計2=從第1天到第13天的統(tǒng)計；第0天時，所有計算都相同(重量設定為100%)*=為統(tǒng)計學顯著的(<0.05)**=為統(tǒng)計學上極其顯著的(<0.0001)2、HAgM-3bl免疫的動物(第7組，105PFU/每只動物)與RacH(第1組，1()5pFU)和HAgM-Ins(第4組，1()5pFU)免疫的動物，在感染攻擊后阻止體重降低的效力參數(shù)方面的比較下表中給出的結果表明，無論免疫使用的是何種病毒，在高劑量病毒免疫的組中，平均體重沒有統(tǒng)計學上顯著的差異。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>2=從第1天到第13天的統(tǒng)計；第0天時，所有計算都相同(重量設定為100%)*=為統(tǒng)計學顯著的(<0.05)**=為統(tǒng)計學上極其顯著的(<0.0001)3、HAgM-3bl免疫的動物(第8組，104PFU/每只動物)與RacH(第2組，1()SpFU)和HAgM-Ins(笫5組，10"PFU)免疫的動物，在感染攻擊后阻止體重降低的效力參數(shù)方面的比較。下表顯示了對接受10"PFU/每只動物的小鼠組的統(tǒng)計學分析，顯示第8組動物(1(^PFUHAgM-3bl)和第5組動物(HAgM-Ins)在第1天和第11到第13天，其平均體重的差異在統(tǒng)計學上顯著。但RacH免疫的動物(第2組)與HAgM-3bl免疫的動物(第8組)相比，在感染之后所有的天中，其平均體重差異都有顯著或極其顯著的降低。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>1=檢驗統(tǒng)計2=從第l天到第13天的統(tǒng)計；第O天時，所有計算都相同(重量設定為100%)*=為統(tǒng)計學顯著的(<0.05)**=為統(tǒng)計學上極其顯著的(<0.0001)4、HAgM-3bl免疫的動物(第9組，1()3pFU/每只動物)與RacH(第3組，1()3pFU)和HAgM-Ins(第6組，1()3pFU)免疫的動物，在感染攻擊后阻止體重降低的效力參數(shù)方面的比較下表顯示了用最低劑量免疫的結果?？偨Y來說，接種最低劑量HAgM-3bl的動物與接種相同劑量的HAgM-Ins或RacH的動物相比，在第4天到第9天表現(xiàn)(極其)顯著的較高平均體重。此外，在感染攻擊后第l天到第3天，RacH免疫的動物與HAgM-3bl免疫的動物相比，其體重有顯著的降低。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>1—會-險統(tǒng)計2=從第l天到第13天的統(tǒng)計；第0天時，所有計算都相同(重量設定為100%)*=為統(tǒng)計學顯著的(<0.05)**=為統(tǒng)計學上極其顯著的(<0.0001)權利要求1、一種馬皰疹病毒，其中蛋白gM基本缺失。2、一種馬皰滲病毒，其中蛋白gM被修飾并且無功能。3、一種杈利要求1或2的馬皰滲病毒，其特征是蛋白gM適過編碼蛋白gM的基因中的缺失、突變或插入而被基本缺失或修飾。4、杈利要求1到3中任一項的馬皰夸病毒，其特征是編碼蛋白gM的基因被缺失或修飾，并且編碼UL9同系物的基因(基因53)的表達未受到影響。5、杈利要求1到4中任一項的馬皰疹病毒'其中病毒株EHV-1Ab4p的核苷酸93254到94264或其他EHV毒株中相應區(qū)段被缺失，其中的核苷酸編號僅為舉例。6、馬皰滲病毒HAgM-3bl抹，其保藏號為EACC99101536。7、杈利要求1到6中任一項的馬皰滲病毒，其中所述病毒是型或4型馬皰滲病毒。8、杈利要求1到7中任一項的馬皰滲病毒，所述馬皰疹病毒帶有一個或多個異源基因。9、一種核酸，其編碼杈利要求到8中任一項的馬皰疹病毒'10、一種藥物組合物，其包含杈利要求1到8中任一項的馬皰疹病毒。11.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含杈利要求9的核酸。12、杈利要求1到8中任一項的馬皰滲病毒的用途，其用于制備一種藥物組合物。13、杈利要求9的核酸的用途，其用于制備一種藥物組合物。14、一種方法，所述方法可增強馬皰滲病毒疫苗所誘導的抗野生型感染的免疫應答，該方法的特征是所述疫苗包含杈利要求1到7中任一項的馬皰滲病毒。15、一種預防和/或治療動物的方法，所述方法的特征是給予所述動物以杈利要求10或11的藥物組合物。16、一種方法，所述方法用于區(qū)分野生型馬皰滲病毒感染的動物和杈利要求1到7中任一項的經(jīng)修飾的馬皰滲病毒處理的動物，其特征是確認野生型病毒的蛋白gM或經(jīng)修飾病毒中表達的蛋白gM或經(jīng)修飾病毒中蛋白gM的基本缺失。17、杈利要求16的方法，其特征是a)目的樣品被加入一種分離的gM或其修飾的布f生物中，b)加入特異于所述分離的gM蛋白或其修飾的衍生物的抗體，c)確定所述抗體的結合。18、一種用來實施杈利要求16和17的方法的試劑盒，其特征是所述試劑盒包含分離的蛋白gM或其分離的修飾衍生物和/或抗體，所述抗體或者特異于野生型gM蛋白或者特異于經(jīng)修飾的蛋白gM。19、一種方法，所述方法用于區(qū)分野生型馬皰疹病毒感染的動物和杈利要求1到7中任一項的條飾的馬皰疹病毒處理的動物'其特征是確認編碼病毒野毒抹蛋白gM的核酸和編碼經(jīng)修飾的gM蛋白的核酸或其基本缺失之間的差異。20、一種用于實施杈利要求19的方法的試劑盒，其特征是所述試劑盒包含一或多種核苷酸序列特異性探針，所述探針或者結合編碼野生型蛋白gM的核苷酸，或者結合編碼經(jīng)修飾的gM蛋白的核苷酸。全文摘要本發(fā)明涉及馬皰疹病毒(EquineHerpesViruses，EHV)，其中蛋白gM被基本缺失或修飾，并且其免疫調(diào)節(jié)能力無功能。本發(fā)明進一步的方面涉及編碼所述病毒的核酸，包含這些病毒或核酸的藥物組合物及其用途。本發(fā)明也涉及增強由EHV疫苗所誘發(fā)的抗野生型EHV感染的免疫應答的方法，涉及EHV感染的預防和治療方法以及將野生型EHV感染的動物與用本發(fā)明EHV處理的動物區(qū)分的方法。文檔編號C12N7/00GK101230336SQ20081000929公開日2008年7月30日申請日期2001年2月15日優(yōu)先權日2000年2月17日發(fā)明者克努特·埃爾伯斯,克里斯琴·西博爾特,尼古勞斯·奧斯特里德申請人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司