專利名稱：巖藻黃質(zhì)的制備方法以及用于制備巖藻黃質(zhì)的微藻的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用微藻制備巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法， 以及用于制備巖藻黃質(zhì)的微藻。特別地，本發(fā)明涉及使用屬于菠蘿藻綱(Pinguiophyceae)、 金藻綱(Chrysophyceae)、硅藻綱(Bacillariophyceae)或定鞭藻綱(Haptophyceae)的微 藻制備巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，以及用于制備巖藻黃質(zhì)的微藻。
背景技術(shù)：
巖藻黃質(zhì)已知具有抗癌效果，并已檢驗(yàn)其作為醫(yī)藥藥品和健康食品的應(yīng)用性 (專利文獻(xiàn)1)。作為巖藻黃質(zhì)的制備方法，已知包括從例如作為大型藻類的巨藻(昆布 (Laminaria)屬海藻)和若芽(裙帶菜(Undaria pinnatifida))提取巖藻黃質(zhì)的方法(專 利文獻(xiàn)2和3)。由于屬于大型藻類的如巨藻和若芽的褐藻不利地具有極慢的生長(zhǎng)速率，需 要較長(zhǎng)時(shí)間和較高成本以獲得足夠?qū)嵺`量的這種褐藻。此外，由于褐藻必須在海洋中培養(yǎng)， 其穩(wěn)定的供應(yīng)是不利地困難的。而且，由于大型藻類具有高含量的多糖等和堅(jiān)固的細(xì)胞壁， 提取和制備巖藻黃質(zhì)的方法是不利地艱難的。因此，已研究培養(yǎng)岡村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)的盾片的方法作為人工 培養(yǎng)大型藻類的方法(專利文獻(xiàn)4)。盡管通過(guò)所述方法的巖藻黃質(zhì)的產(chǎn)率高達(dá)每100克干 海藻1. 1克，由于盾片難以處理以及其緩慢的培養(yǎng)速率，因此生產(chǎn)率較低，從而使得制備成 本不利地較高。此外，如二十碳五烯酸的高度不飽和脂肪酸由于其有用的生理學(xué)活性而用于醫(yī)藥 藥品和健康食品中，其大部分自魚(yú)類等提取。高度不飽和脂肪酸通過(guò)需要復(fù)雜的提取、純化 等的方法制得(專利文獻(xiàn)5)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 JP-A-10-158156專利文獻(xiàn)2 日本專利No. 2639630專利文獻(xiàn)3 日本專利No. 2673684專利文獻(xiàn)4 JP-A-2004-35528專利文獻(xiàn)5 JP-B-4-16519

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題本發(fā)明的目的是，為了有效收集巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的 目的而提供一種使用微藻制備巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法以及 用于制備巖藻黃質(zhì)的微藻。更特別地，本發(fā)明的目的是提供一種使用屬于菠蘿藻綱、金藻 綱、硅藻綱或定鞭藻綱的微藻制備巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，以及用于制備巖藻黃質(zhì)的微藻。解決問(wèn)題的方法注意力集中于微藻產(chǎn)生巖藻黃質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和培養(yǎng)速率(生長(zhǎng)速率)，本發(fā)明人研究了以較高巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率獲得微藻。因此，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一些屬于菠蘿藻綱、金藻綱、硅藻綱 或定鞭藻綱的微藻以較高水平產(chǎn)生巖藻黃質(zhì)。由此實(shí)現(xiàn)發(fā)明。本發(fā)明總結(jié)為使用微藻制備巖藻黃質(zhì)的方法，如下(1)至(7)所描述。(1) 一種巖藻黃質(zhì)的制備方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0. 5毫 克/升/天或更多的微藻以及從培養(yǎng)藻類提取并分離巖藻黃質(zhì)。(2) 一種如(1)中所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中所述培養(yǎng)基為含有包括糖的 有機(jī)物質(zhì)的培養(yǎng)基。(3) 一種如(1)或(2)中所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中所述微藻為屬于菠蘿藻 綱、金藻綱、硅藻綱或定鞭藻綱的微藻。(4) 一種如(3)中所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中屬于菠蘿藻綱的微藻為 Pinguiochrysis (拉丁文，無(wú)譯文)屬的微藻。(5) 一種如(3)中所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中屬于金藻綱的微藻為棕鞭藻 (Ochromonas)屬的微藻。(6) 一種如(3)中所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中屬于硅藻綱的微藻為褐指藻 (Phaeoductylum)屬的微藻。(7) 一種如(3)中所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中屬于定鞭藻綱的微藻為屬于 顆石藻(Pleurochrysis)或巴夫藻(Pavlova)屬的微藻。此外，本發(fā)明總結(jié)為使用微藻制備含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，如 下(8)至(10)所描述。(8) 一種根據(jù)(1)至(7)任一項(xiàng)所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法制備含有高度不飽和 脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，其包括自培養(yǎng)物收集巖藻黃質(zhì)并同時(shí)收集高度不飽和脂肪酸。(9) 一種如(8)中所述的制備含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，其中所 述高度不飽和脂肪酸為具有20或更多個(gè)碳原子的高度不飽和脂肪酸。(10) 一種如(9)中所述的制備含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，其中所 述高度不飽和脂肪酸為二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的至少一種。此外，本發(fā)明總結(jié)為如下(11)所描述的微藻。(11)用于⑴至(7)任一項(xiàng)所述的方法中的巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0.5毫克/升/天 或更多的微藻。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種使用用于制備巖藻黃質(zhì)的微藻和巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0. 5毫克/ 升/天或更多的微藻制備巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法。更特別 地，本發(fā)明提供了一種使用用于制備巖藻黃質(zhì)的屬于菠蘿藻綱、金藻綱、硅藻綱或定鞭藻綱 的微藻和巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0. 5毫克/升/天或更多的微藻制備巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽 和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法。本發(fā)明提供了一種制備巖藻黃質(zhì)的有效方法，以及在該方法 中使用的巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0. 5毫克/升/天或更多，優(yōu)選1. 0毫克/升/天或更多，更優(yōu) 選2. 0毫克/升/天或更多的微藻，從而實(shí)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)的大規(guī)模制備。


圖1為顯示在培養(yǎng)實(shí)施例2中菠蘿藻綱的微藻培養(yǎng)物隨時(shí)間變化的圖。
具體實(shí)施例方式微藻為在藻類中僅可使用顯微鏡觀察到的極小浮游植物的通用名，亦即，除了主 要在陸地上生長(zhǎng)的蘚類植物、蕨類植物和種子植物之外的具有產(chǎn)氧型光合成的生物體。用于本發(fā)明的微藻包括屬于菠蘿藻綱、金藻綱、硅藻綱或定鞭藻綱的微藻。更特 別地，屬于菠蘿藻綱的微藻為Pinguiochrysis屬的微藻、Phaeomonas (拉丁文，無(wú)譯文) 屬的微藻、或Polypodochrysis (拉丁文，無(wú)譯文)屬的微藻；屬于金藻綱的微藻為棕鞭藻 屬的微藻、錐囊藻(Dinobryon)屬的微藻、金藻(Poterioochromonas)屬的微藻、附鐘藻 (Epipyxis)屬的微藻等；屬于硅藻綱的微藻為褐指藻屬的微藻、小環(huán)藻(Cyclotella)屬的 微藻、骨條藻(Skeletonema)、菱形藻(Nitzschia)或角毛藻(Chaetoceros)屬的微藻等； 屬于定鞭藻綱的微藻為顆石藻、Exanthemachrysis (拉丁文，無(wú)譯文)或巴夫藻，或等鞭金 藻(Isochrysis)屬的微藻等。本發(fā)明涉及一種巖藻黃質(zhì)的制備方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為 0. 5毫克/升/天或更多的微藻以及從培養(yǎng)藻類分離并提取巖藻黃質(zhì)。0.5毫克/升/天或更多的生產(chǎn)率的重要性已知微藻產(chǎn)生巖藻黃質(zhì)。已知巖藻黃質(zhì)為具有用于光合成的會(huì)聚作用的輔助染 料。然而，對(duì)微藻中的巖藻黃質(zhì)水平的詳細(xì)檢查的研究工作實(shí)例還是未知的。因此，完全未 知有多少巖藻黃質(zhì)包含于其中(Shinichi Takaichi編輯的“Carotenoid”，2006年4月，第 10-48 頁(yè))。從海藻中收獲巖藻黃質(zhì)涉及與食物的競(jìng)爭(zhēng)、困難的回收、穩(wěn)定的制備、苛刻的提取 (多糖的存在)等。例如，在若芽的情況中，巖藻黃質(zhì)的生產(chǎn)率為約0.01毫克/升/天，盡 管其生產(chǎn)率與相同單位的微藻生產(chǎn)率的比較較困難。在自海藻收獲的巖藻黃質(zhì)的任何情況 中，應(yīng)了解達(dá)到0.01毫克/升/天或更多的巖藻黃質(zhì)的生產(chǎn)率十分困難。盾片的制備需要 20至30天。然后，應(yīng)培養(yǎng)盾片7天。盾片制備是限速的。當(dāng)估計(jì)盾片的制備到巖藻黃質(zhì)的 制備需要約30天時(shí)，生產(chǎn)率為約0. 1毫克/升/天。根據(jù)本發(fā)明，使用在如上所述的微藻中巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0. 5毫克/升/天或更 多的微藻。相比于屬于常規(guī)大型藻類的褐藻，如具有極慢生長(zhǎng)速率的巨藻和若芽以及具有 艱難處理 和緩慢培養(yǎng)速率的R村枝管藻的紅毛盤(pán)菌(scutellata)，當(dāng)使用巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率 為0. 5毫克/升/天或更多的微藻時(shí)，能以穩(wěn)定的方式經(jīng)濟(jì)地獲得實(shí)踐量的巖藻黃質(zhì)。此 外，相比于大型藻類，這些微藻的提取和制備較容易。另外，微藻含有有用的高度不飽和脂 肪酸。在微藻中，巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0. 5毫克/升/天或更多的微藻是經(jīng)濟(jì)上令人滿意 的。巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率優(yōu)選為1. 0毫克/升/天或更多，更優(yōu)選為2. 0毫克/升/天或更多 的微藻更令人滿意。另外，本發(fā)明涉及一種巖藻黃質(zhì)的制備方法，該方法包括在含有包括糖的有機(jī)物 質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0. 5毫克/升/天或更多的微藻，以及從培養(yǎng)藻類分離并提取巖藻黃質(zhì)。待使用的糖的類型包括無(wú)特別限定的任何糖，只要棕鞭藻屬的微藻能 夠用該糖生長(zhǎng)。例如，多糖(如淀粉、纖維素、β 1，3-葡聚糖、幾丁質(zhì)和果聚糖)、二糖(如 蔗糖、纖維二糖、麥芽糖、海藻糖和乳糖)和單糖(如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖和乳糖) 可用作糖。甘油和酚用作其他有機(jī)物質(zhì)。特別地，當(dāng)?shù)矸?、麥芽糖、纖維二糖和葡萄糖用作 碳源時(shí)，巖藻黃質(zhì)可有效制得。果糖、甘露糖和酚也可用作與如上所述碳源具有相同生產(chǎn)率 的那些。
微藻特別地包括例如菠蘿藻綱的微藻(如Pinguiochrysis pyriformis (拉丁 JC, 譯文)、Phaeomonas parva (拉丁文，譯文)，禾口 Polypodochrysis teissieri (拉 丁文，無(wú)譯文))；金藻綱的微藻(如Ochromonas danica(拉丁文，無(wú)譯文)、 Ochromonas tuberculata(拉 丁文，無(wú)譯文)，禾口 Ochromonas villosa(拉 丁文，無(wú)譯 文)或 Ochromonasminuta (拉 丁文，無(wú)譯文)、Dinobryon cylindrical (拉 丁文，無(wú)譯 文)、Poterioochromonas malhamensis (拉 丁文，無(wú)譯文)，禾口 Epipyxis glabra (拉丁 文，無(wú)譯文))；硅藻綱的微藻(如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、隱形小 環(huán)藻(Cyclotella cryptica)、梅尼小環(huán)藻(Cyclotellameneghiniana)、中肋骨條藻 (Skeletonema costatum)、左彎菱形藻(Nitzschia laevis)，禾口角刺藻(Chaetoceros gacillis))；定鞭藻綱的微藻(如 Pleurochrysis haptonemofera(拉丁文，無(wú)譯文)、 Exanthemachrysisgayraliae (拉丁文，無(wú)譯文)、Pavlova pinguis (拉丁文，無(wú)譯文)禾口路 氏巴夫藻(Pavlova lutheri)，和球等鞭金藻(Isochrysis galbana))。可培養(yǎng)微藻的任何培養(yǎng)基可令人滿意地使用而無(wú)特別限定，培養(yǎng)微藻的培養(yǎng)基包 括例如加入氮?dú)?、營(yíng)養(yǎng)鹽(如磷酸、維生素和微量元素)的人工海水或海水。此外，培養(yǎng)可 在光照射下完成。作為照射方法，可進(jìn)行連續(xù)照射和光循環(huán)照射。巖藻黃質(zhì)通過(guò)常規(guī)方法 從以這種方式培養(yǎng)的藻類中提取。通過(guò)在離心之后干燥藻類并提取巖藻黃質(zhì)，巖藻黃質(zhì)可 以較簡(jiǎn)單的方式得以提取。此外，由于棕鞭藻屬的微藻可用如糖的有機(jī)物質(zhì)增殖，藻類可無(wú)需光照射而增殖。 該方法可用于除了棕鞭藻屬的微藻之外的能夠使用如糖的有機(jī)物質(zhì)生長(zhǎng)的微藻。例如也可 使用硅藻綱的菱形藻(Nitzschia)屬。此外，本發(fā)明涉及一種巖藻黃質(zhì)的制備方法，其包括在含有包括糖的有機(jī)物質(zhì)的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)棕鞭藻屬的微藻以獲得6克/升或更多的干藻類。當(dāng)微藻在無(wú)有機(jī)物質(zhì)(如 葡萄糖)下培養(yǎng)時(shí)，通常，由于在培養(yǎng)物密度剛達(dá)到3克/升或更多時(shí)的微藻的培養(yǎng)物密度 導(dǎo)致通過(guò)微藻的透光率降低，使得需要提高光強(qiáng)度。當(dāng)提高光強(qiáng)度時(shí)，不利地，水溫的控制 具有難度。使用有機(jī)物質(zhì)的培養(yǎng)允許微藻使用有機(jī)物質(zhì)作為營(yíng)養(yǎng)物而增殖，從而易于獲得 6克/升或更多的干藻類而無(wú)需任何光照射?？墒褂媚軌驈闹刑崛r藻黃質(zhì)的任何溶劑作為從微藻提取巖藻黃質(zhì)的溶劑而無(wú) 特別限定。例如，可使用乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和甲苯。例如，有機(jī)溶劑可單獨(dú)使 用或以兩種或兩種以上的結(jié)合使用，包括醇(如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和正丁醇)、酮(如 甲乙酮和丙酮)、酯(乙酸甲酯和乙酸乙酯)、有機(jī)氯烴(如氯仿)、脂族烴(如己烷)，和芳 香烴(如苯和甲苯)。可以1 100至100 1，優(yōu)選1 50至50 1的有機(jī)溶劑與干微 藻的比例使用這種有機(jī)溶劑。使用有機(jī)溶劑提取可通過(guò)通常方法進(jìn)行。例如，在使用乙醇作 為有機(jī)溶劑的情況中，提取可在0°C至60°C，優(yōu)選5°C至40°C的溫度下令人滿意地進(jìn)行0. 5至100小時(shí)，優(yōu)選12小時(shí)至72小時(shí)。對(duì)于提取，如需要，可進(jìn)行使用超聲波或使用攪拌器 的攪拌。對(duì)于利用具有高效液相色譜的離子交換色譜、反相色譜等的巖藻黃質(zhì)分離和純化， 直接使用或在去除殘余物之后使用以這種方式獲得的在有機(jī)溶劑中的提取物。使用在有機(jī)溶劑中的提取物而不通過(guò)如HPLC的色譜加工時(shí)，可獲得高度不飽和 脂肪酸和巖藻黃質(zhì)的混合物。本文的高度不飽和脂肪酸指優(yōu)選具有20個(gè)或更多個(gè)碳原子 的高度不飽和脂肪酸，特別包括二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸或其混 合物。現(xiàn)在如下描述本發(fā)明的實(shí)施例。然而，本發(fā)明決不限定于實(shí)施例。實(shí)施例培養(yǎng)實(shí)施例1培養(yǎng)金藻綱的微藻金藻綱的 Ochromonas danica CS-4 菌株 (可購(gòu)自 Microbial CultureCollection, the National Institute for Environmental Studies)在 iM i音養(yǎng) 基中培養(yǎng)(表1)。該菌株在200毫升JM培養(yǎng)基中在300 μ mol m^S"1 (14小時(shí)亮循環(huán)和10 小時(shí)暗循環(huán))下培養(yǎng)7天，所述JM培養(yǎng)基被裝入在25°C下的恒溫水箱中的500毫升錐形瓶 (Erlenmeyer flask)中。表 1
四水合硝酸 丐 4.0克 磷酸二氫鉀 2.48克 七水合硫酸鎂 10.0克 碳酸氫鈉 3.18克 EDTA鈉鹽 0.5克 硼酸 0.496克 四水合氯化鎂 0.278克 L0054J 四水合鉬酸銨 0.2克 維生素B12 0.008克 氯化硫胺素鹽 0.008克 生物素 0.008克 硝酸鈉 16.0克 磷酸氫二鈉 7.2克 蒸餾水_1000毫升培養(yǎng)實(shí)施例2培養(yǎng)菠蘿藻綱的微藻菠蘿藻綱的 Pinguiochrysis pyriformis MBIC 10782 菌株(可購(gòu)自 Marine Biotechnology Research Institute)在IMK培養(yǎng)基中培養(yǎng)(表2)。該菌株在100毫升 IMK培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基被裝入蓋有Silicosen(由Shin-Etsu Polymer Co. ,Ltd.制 造)的500毫升錐形瓶中。用1毫升玻璃移液管穿過(guò)Silicosen，試管在自其底部的通氣下 進(jìn)行攪拌。培養(yǎng)在25°C下的恒溫水箱中，并在通氣條件下在pH控制和300μπιΟ1 HT2S4 (連續(xù)照射)下進(jìn)行7天。培養(yǎng)物隨時(shí)間的變化顯示于圖1。
表 2
硝酸鈉200毫克
磷酸氫二鈉1.4毫克
磷酸氫二鉀5毫克
氯化銨2.68毫克
Fe-EDTA5.2 毫克
Mn-EDTA0.332 毫克
Na2-EDTA37.2 毫克
硫酸鋅0.023毫克
硝酸鈷0.014毫克
二水合鉬酸鈉0.0073毫克
硫酸銅0.0025毫克
亞硒酸0.0017毫克
氯化硫胺素0.2毫克
生物素0.0015毫克
維生素B120.0015毫克
氯化錳0.18毫克
海水1000毫升
pH_8^2_培養(yǎng)實(shí)施例3培養(yǎng)硅藻綱的微藻硅藻綱的三角褐指藻CCAP1052/1A菌株(可購(gòu)自CultureCollection ofAlgae and Protozoa)在f/2+Si培養(yǎng)基中培養(yǎng)(表3)。該菌株在200毫升JM培養(yǎng)基中在300 μ mol HT2S4 (14小時(shí)亮循環(huán)和10小時(shí)暗循環(huán))下培養(yǎng)8天，所述JM培養(yǎng)基被裝入在25°C下的恒 溫水箱中的500毫升錐形瓶中。表 3硝酸鈉75毫克
磷酸二氫鈉脫水物5.7毫克
EDTA 二鈉鹽4.36毫克
六水合氯化亞鐵3.15毫克
五水合硫酸銅0.01毫克
七水合硫酸鋅0.022毫克
六水合氯化鈷0.01毫克四水合氯化錳0.18毫克 二水合鉬酸0.006毫克 維生素B120.0005毫克 氯化硫胺素鹽100毫克 生物素0.0005毫克 九水合二硅酸鈉30毫克 海水1000毫升 pH8.0培養(yǎng)實(shí)施例4培養(yǎng)定鞭藻綱的微藻定鞭藻綱的 Pavlova pinguis AC 19 菌株(可購(gòu)自 Microalgal
CultureCollection University of Caen Basse-Normandie)在 IMK培養(yǎng)基中培養(yǎng)(表2)。
該菌株在200毫升JM培養(yǎng)基中在300mol m^S"1 (14小時(shí)亮循環(huán)和10小時(shí)暗循環(huán))下培養(yǎng)
10天，所述JM培養(yǎng)基被裝入在25°C下的恒溫水箱中的500毫升錐形瓶中。培養(yǎng)實(shí)施例5使用可溶性淀粉作為底物培養(yǎng)金藻綱微藻的 Ochromonas danica CS-4 胃 tt (胃 _ 自 Microbial
CultureCollection,the National Institute for Environmental Studies)在 0A30S i音
養(yǎng)基中培養(yǎng)(表4)。該菌株在100毫升0A30S培養(yǎng)基中在300 μ mol m^S"1 (14小時(shí)亮循環(huán)
和10小時(shí)暗循環(huán))下培養(yǎng)7天，所述0A30S培養(yǎng)基被裝入在25°C下的500毫升錐形瓶中。表 4可溶性淀粉30克酵母提取物6克胰蛋白胨9克磷酸二氫鉀1克七水合硫酸鈉0.2克氯化鈉0.5克EDTA鈉鹽0.2克二水合氯化鈣0.2克培養(yǎng)實(shí)施例6使用葡萄糖作為底物培養(yǎng)金藻綱微藻t ■ β 白勺 Ochromonas danica CS-4 胃 tt (胃 _ 自 Microbial CultureCollection, the National Institute for Environmental Studies)在 0A30G 培養(yǎng)基中培養(yǎng)(表4)。該菌株在100毫升0A30G培養(yǎng)基中用IOOrpm下的搖動(dòng)培養(yǎng)機(jī) (Takasaki Scientific Instrument Co.，Ltd.)在黑暗狀態(tài)培養(yǎng) 3 天，隨后在 25 °C 和 300 μ mol HT2S-1 (14小時(shí)亮循環(huán)和10小時(shí)暗循環(huán))培養(yǎng)4天，所述0A30G培養(yǎng)基被裝入在 25 °C下的500毫升錐形瓶中。表 5
葡萄糖30克酵母提取物6克胰蛋白胨9克磷酸二氫鉀1克七水合硫酸鈉0.2克氯化鈉0.5克EDTA鈉鹽0.2克二水合氯化鈣0.2克提取實(shí)施例巖藻黃質(zhì)的提取和分析將培養(yǎng)實(shí)施例1、2、3和4中的液體培養(yǎng)物的每一個(gè)的100毫升進(jìn)行離心，從而去 除上清液。將沉淀的藻類取出并用冷凍干燥器(由Fuji Medical Science Co.，Ltd.制 造)冷凍干燥。作為結(jié)果，回收了干藻類0. 264克(培養(yǎng)實(shí)施例1)、0. 427克(培養(yǎng)實(shí)施 例2)、0. 213克(培養(yǎng)實(shí)施例3)、0. 162克(培養(yǎng)實(shí)施例4)、0. 702克(培養(yǎng)實(shí)施例5)和 0.681克(培養(yǎng)6)。隨后，將3毫升丙酮加入0.1克的每一種干藻類，用渦旋混合器充分?jǐn)嚢枰蕴崛r藻黃質(zhì)。使用Myshoridisk H-13-5 (由Tosoh Co.，Ltd.制造)從提取物溶 液中去除殘余物。所得濾液在減壓下濃縮。濃縮物用作分析樣品。巖藻黃質(zhì)用帶有TSK gel-0DS80Ts(由 Tosoh, Co.，Ltd.制造，4. 6 毫米(直徑)X 150 毫米)的 HPLC (SCL IOA 470納米，由Shimadzu Co.，Ltd.制造；流速1. O米/分鐘)進(jìn)行分析，從而通過(guò)使用算術(shù)式 1所示的計(jì)算式確定制得的巖藻黃質(zhì)的產(chǎn)率和生產(chǎn)率。在本文中，由Wako Pure Chemical Co.，Ltd.制造的巖藻黃質(zhì)用作標(biāo)準(zhǔn)巖藻黃質(zhì)試劑。作為結(jié)果，由培養(yǎng)實(shí)施例1中的Ochromonas danica CS-4菌株生產(chǎn)的巖藻黃質(zhì) 為0. 538毫克/0. 1克干藻類，而生產(chǎn)率為2. 03毫克/升/天。類似地，由培養(yǎng)實(shí)施例2中 的Pinguiochrysis pyriformis MBIC 10782菌株生產(chǎn)的巖藻黃質(zhì)為0. 640毫克/0. 1克干 藻類，而生產(chǎn)率為3. 90毫克/升/天。在培養(yǎng)實(shí)施例3中，由三角褐指藻CCAP 1052/A生 產(chǎn)的巖藻黃質(zhì)為0. 583毫克/0. 1克干藻類，而生產(chǎn)率為1. 55毫克/升/天。在培養(yǎng)實(shí)施 例4中，由Pavlova pinguis AC19生產(chǎn)的巖藻黃質(zhì)為0. 792毫克/0. 1克干藻類，而生產(chǎn)率 為1. 28毫克/升/天。在培養(yǎng)實(shí)施例5中，由Ochromonas danica CS-4菌株生產(chǎn)的巖藻 黃質(zhì)為0. 428毫克/0. 1克干藻類，而生產(chǎn)率為4. 29毫克/升/天。在培養(yǎng)實(shí)施例6中， 由Ochromonasdanica CS-4菌株生產(chǎn)的巖藻黃質(zhì)為0. 409毫克/0. 1克干藻類，而生產(chǎn)率為 3. 98 毫克 / 升 / 天。此外，將 5%氯化氫甲醇加入 Pinguiochrysispyriformis MBIC10782 菌株的提取物溶液中在90°C下反應(yīng)2天以進(jìn)行甲醇分解。在己烷中提取脂肪酸甲酯，所得 提取物用氮?dú)鉂饪s以用于氣相色譜(GC17A ；由Shimadzu Co.，Ltd.制造)分析。包含6. 4 毫克/0. 1克干藻類的二十碳五烯酸。算術(shù)式1生產(chǎn)率=[干藻類(克)/lL培養(yǎng)基]X [巖藻黃質(zhì)(毫克)/1克干藻類]/[以天 計(jì)的培養(yǎng)時(shí)間]工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了一種有效制備巖藻黃質(zhì)的方法，以及在該方法中使用的巖藻黃質(zhì)生 產(chǎn)率為0. 5毫克/升/天或更多，優(yōu)選1. O毫克/升/天或更多，更優(yōu)選2. O毫克/升/天 或更多的微藻，通過(guò)該方法，實(shí)現(xiàn)了巖藻黃質(zhì)的大規(guī)模制備，同時(shí)可獲得含有高度不飽和脂 肪酸的巖藻黃質(zhì)而無(wú)需復(fù)雜的純化方法等。
權(quán)利要求
1. 一種巖藻黃質(zhì)的制備方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0. 5毫克 /升/天或更多的微藻以及從培養(yǎng)藻類提取并分離巖藻黃質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中所述培養(yǎng)基為含有包括糖的有機(jī) 物質(zhì)的培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中所述微藻為屬于菠蘿藻綱、金 藻綱、硅藻綱或定鞭藻綱的微藻。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中屬于菠蘿藻綱的微藻為 Pinguiochrysis 屬的微藻。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中屬于金藻綱的微藻為棕鞭藻屬的 微藻。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中屬于硅藻綱的微藻為褐指藻屬的 微藻。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法，其中屬于定鞭藻綱的微藻為屬于顆石 藻或巴夫藻屬的微藻。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的巖藻黃質(zhì)的制備方法制備含有高度不飽和 脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，該方法包括自培養(yǎng)物收集巖藻黃質(zhì)并同時(shí)收集高度不飽和脂肪酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，其中所述高 度不飽和脂肪酸為具有20或更多個(gè)碳原子的高度不飽和脂肪酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，其中所述 高度不飽和脂肪酸為二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的至少一種。
11.用于如權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的方法中的巖藻黃質(zhì)生產(chǎn)率為0.5毫克/升/ 天或更多的微藻。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種有效制備巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，該方法能夠大規(guī)模制備巖藻黃質(zhì)；以及用于該方法中的微藻。特別地公開(kāi)了一種制備巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)的方法，其特征在于培養(yǎng)微藻，更特別地屬于菠蘿藻綱、金藻綱、硅藻綱或定鞭藻綱的微藻，和自培養(yǎng)藻類提取/分離巖藻黃質(zhì)或含有高度不飽和脂肪酸的巖藻黃質(zhì)；以及用于制備上述各個(gè)巖藻黃質(zhì)組分的微藻。
文檔編號(hào)C12P7/64GK102007216SQ20098011380
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月22日
發(fā)明者沖田裕司, 加藤美砂子, 杉本慎一, 泉田仁 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人御茶之水女子大學(xué), 日本水產(chǎn)株式會(huì)社