專利名稱：使用離子交換和凝膠過濾色譜進行痘病毒純化的方法
使用離子交換和凝膠過濾色譜進行痘病毒純化的方法相關申請本申請要求于2008年2月12日提交的美國順序號61/065，484的優(yōu)先權。研究領域本文描述了用于分離載體例如痘病毒載體和禽痘(例如金絲雀痘、ALVAC)載體的方法。背景知識多種不同類型的色譜方法已經用于純化病毒。陰離子交換色譜是用于病毒純化的最常用的色譜柱純化方法。它已經用于純化各種病毒，包括HIV-I O^rior等，1995 ； 1996)、 仙臺病毒(Eveleth等，2000)、重組腺伴隨病毒(Huyghe等，1995 ；Kaludov等，2002)和慢病毒(Yamada等，2003)。也已經使用陽離子交換色譜(Gao等，2000)。已經證明大小排阻色譜(SEC)是用于病毒純化的潛在的通用方法(Braas等，1996)。重組腺病毒或重組腺伴隨病毒已經用疏水作用色譜(HIC)分離，疏水作用色譜(HIC)已經用于重組腺病毒或重組腺伴隨病毒的純化，無論是以結合模式還是洗脫模式(Huyghe等，19%)或以流過模式 (flow-throughmode) (Snyder和Flotte，2002)。而且陶瓷羥基磷灰石(CHT)已經成功用于純化莫洛尼鼠白血病病毒(Kuiper等，200 。已經證明親和純化也可用于純化多種類型的病毒，尤其是具有脂質包膜的那些(Millipore數(shù)據表；0，Neil和Balkovic, 1993 ；0，Neil 和Balkovic，1993 ；Tamayose等，1996)?；诟嗡氐挠H和色譜樹脂已經用于純化病毒，包括重組腺伴隨病毒(Clark 等，1999 Jolotukhin 等，1999 ；Auricchio 等，2001 ；Summerford和 Samulski, 1999)和單純皰疹病毒(0'Keeffe等，1999)。本領域仍然需要另外的改進純化方法。為此，本文提供用于純化痘病毒的改進方法。概述本文提供使用包括但不限于凝膠過濾和/或離子交換色譜的一個或多個層析步驟來純化痘病毒的方法。在某些實施方案中，痘病毒是禽痘病毒(例如金絲雀痘、ALVAC)。附圖簡述

圖1. IOL規(guī)模ANX離子交換分批吸附(batch adsorption)圖。圖2.對于不同操作剪切速率的優(yōu)化操作的TMP。圖3.在不同TMP和剪切速率下的TFF性能(內腔ID 0. 5mm)。圖4.在不同TMP和剪切速率下的TFF性能(內腔ID Imm)。圖5.在不同TMP和剪切速率下的TFF性能-濃縮澄清的ALVAC/CEF。發(fā)明詳述本文提供用于純化重組痘病毒載體或“野生型”痘病毒載體(例如痘病毒顆粒、病毒體)的方法，所述方法包括使粗制痘病毒制備物(或其衍生物，例如半純化的痘病毒制備物)經歷離子交換色譜，得到污染物水平減少的痘病毒制備物。痘病毒制備物是其中存在著完整痘病毒顆?；虿《倔w(其可簡單地稱為痘病毒)的制備物。痘病毒顆?；虿《倔w可以是例如野生型的、減毒的、非重組的或重組的。污染物(例如非痘病毒成分)是并非完整痘病毒顆?；虿《倔w的成分。污染物通常是生物性的(例如不包括緩沖劑、賦形劑等)并且可包括例如非載體DNA和/或RNA、游離載體DNA和/或RNA、其它RNA和/或DNA、非載體肽或蛋白質、其它游離肽或蛋白質等。在一些實施方案中，所述方法使得存在于粗制痘病毒中的最高達約或具體80%至99%的總蛋白(包括肽)和/或總核酸(例如DNA、RNA)的污染物被去除。在一些實施方案中，存在于粗制痘病毒制備物中的最高達約或具體80%、 85^^90^^95%或99%的總蛋白(包括肽)和/或總核酸(例如DNA、RNA)的污染物被去除。在一個實施方案中，所述方法包括使粗制痘病毒制備物經歷離子交換色譜，得到基本上(substantially)不含污染物的痘病毒制備物(“基本上純化的痘病毒制備物”)。 基本上純化的制備物是基本上不含污染物的，其中這些污染物總量以重量計占所述制備物的約或具體20-30%以下(不包括載體、賦形劑等)。在某些實施方案中，制備物是基本上純化的，其中污染物總量以重量計總體上占所述制備物的約或具體20-30%、20-22.5%、 22. 5-25 %、25-27. 5 %或30 %以下，或相對于痘病毒本身。當存在于粗制痘病毒制備物中的至少約或具體80%至89%的污染物(其并非是痘病毒部分)已從所述制備物中去除，所述制備物也可認為是基本上純化的。在一個實施方案中，所述方法包括使粗制痘病毒制備物經歷離子交換色譜，得到實質上(essentially)不含污染物的痘病毒制備物(“實質上純化的痘病毒制備物”)。實質上純化的制備物是實質上不含污染物的，其中這些污染物總量以重量計占所述制備物的約或具體10-20%以下(不包括載體、賦形劑等)。在某些情況下，實質上純化的制備物的污染物總量以重量計總體上占所述制備物的約或具體10-20%、10-12. 5%U2. 5-15%, 15-17. 5%或20%以下，或相對于痘病毒本身。當至少約或具體90%至95%的污染物已從所述制備物中去除，所述制備物也可認為是實質上純化的。在一個實施方案中，所述方法包括使粗制痘病毒制備物經歷所述純化工藝，得到不含污染物的痘病毒制備物(“純化的痘病毒制備物”)。純化的痘病毒制備物不含污染物， 其中污染物總量以重量計占所述制備物的約或具體0-10%以下(不包括載體、賦形劑等)。 在某些實施方案中，制備物不含污染物，其中這些污染物總量以重量計總體上占所述制備物的約或具體0-10%、7. 5-10%、5-7. 5%、2. 5-5%或以下，或相對于痘病毒本身。當存在于所述粗制痘病毒制備物中的至少約或具體95 %至99 %或100 %的污染物(其并非是痘病毒部分)已從所述制備物中去除，所述制備物也可認為是純化的。也提供用于純化痘病毒的方法，所述方法包括在相對于污染物而言，在提供痘病毒與所述基質選擇性相互作用的條件下，使含有痘病毒和至少一種污染物的樣品(例如細胞裂解物)與離子交換色譜基質接觸，并將痘病毒從所述基質上洗脫下來?？赏ㄟ^任何方式達到“選擇性相互作用”，所述方式例如在讓痘病毒比污染物更有效地結合基質的條件下，使樣品暴露給基質，或者通過利用讓痘病毒仍保持與基質結合而使污染物從基質上釋放的洗滌和/或洗脫條件。在某些這類方法中，可使含有痘病毒和污染物的樣品(例如細胞裂解物)與相對于污染物而言與痘病毒選擇性相互作用的離子交換基質接觸，并將結合的痘病毒從基質上洗脫下來。從部分純化的樣品(例如細胞裂解物、濃縮細胞裂解物)中分離痘病毒的另一方法包括(a)提供含有痘病毒的部分純化的樣品；(b)在痘病毒與基質結合的條件下，使所述部分純化的樣品與包含離子交換基質的固體支持物接觸；和(c)將結合的痘病毒從所述固體支持物上洗脫下來。
在進一步純化之前，粗制痘病毒制備物(例如細胞裂解物或濃縮細胞裂解物)可以是部分純化的，以提供部分純化的樣品?？稍偈共糠旨兓臉悠方洑v進一步純化。當痘病毒在細胞中培養(yǎng)并需要部分純化的制備物時，可以采用以下方法收獲含有痘病毒的細胞；通過例如酶解(例如胰蛋白酶和/或核酸酶)或其它方法來裂解細胞，使細胞破裂，得到粗制痘病毒制備物；任選通過例如離心或切向流過濾(TFF)來澄清粗制制備物；使粗制痘病毒制備物經歷純化步驟例如凝膠過濾，以得到半純化的痘病毒制備物；而且，使用例如離子交換色譜，使半純化的痘病毒制備物經歷進一步純化，得到基本上純化的、實質上純化的或純化的痘病毒制備物。粗制痘病毒制備物和半純化的痘病毒制備物通常各自可含有的污染物總量以重量計占制備物的約或具體30%以上(不包括載體、賦形劑等)。通常，半純化的痘病毒制備物所含有的污染物比粗制痘病毒制備物所含有的更少。也可包括其它純化手段，以產生基本上純化的、實質上純化的或純化的痘病毒制備物。對于本領域技術人員來說，許多合適的凝膠過濾基質(也稱為凝膠過濾樹脂)都是可得到的。這類樹脂包括例如Sephacryl (例如s-i00HR、s-200HR、s-300HR、s-400HR)、 Sephadex (例如親脂型(羥基烷氧基丙基-葡聚糖，I型、Vi型或IX型)、G-io、 G-15、G-25、G-50、G-75、G-100)、Sepharose (例如 6B、CL-6B、4B、CL_4B、2B、CL-2B)、 Superdex (例如 30、75、200)、Superose (例如 12、6)、Toyopearl HW (例如冊-40、 HW-50、HW-55、HW-65、HW-75)、Ultrogel (例如基質A、AcA)。優(yōu)選的凝膠過濾基質可以 ^ Sepharose 4 Fast Flow ^ Sepharose 6 Fast Flow?？梢园凑毡绢I域已知方法來平衡凝膠過濾基質。例如，正如本文用于痘病毒純化所示，PH介于約7. 0-9. 0之間的Tris-HCl 緩沖液(例如5mM、10mM、15mM、20mM)可能是合適的。在某些實施方案中，可優(yōu)選pH約7. 0、 7.5、8.0、8.5或9.0。在某些其它實施方案中，可優(yōu)選pH約9. 0。其它凝膠過濾基質和緩沖劑系統(tǒng)的使用是本領域已知的，并且可適用于進行本文所述的方法。對于本領域技術人員來說，許多合適的離子交換色譜基質(也稱為離子交換樹脂)都是可得到的。離子交換基質可選自任何可得到的那些，例如強陰離子交換劑、弱陰離子交換劑、強陽離子交換劑和弱陽離子交換劑。示例性的基質包括例如Q Sepharose Fast Flow、SPSepharose Fast Flow、CM Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow 禾口 ANX Sepharose 4Fast Flow 等。優(yōu)選的介質是 ANXS印harose 4 Fast Flow 樹脂，其可用例如pH介于約7. 0-9. 0之間的Tris-HCl緩沖液(例如5mM、10mM、15mM、20mM)來平衡。 優(yōu)選，緩沖液可以是IOmM Tris-HCl，pH約在7. 0、7. 5、8. 0、8. 5或9. 0。其它離子交換基質和緩沖劑系統(tǒng)的使用是本領域已知的，并且可適用于進行本文所述的方法。在本文所述的某些方法中，通過使結合在離子交換基質上的痘病毒與洗脫緩沖液接觸，而進行洗脫。如上所述，在某些實施方案中，優(yōu)選為了痘病毒而選擇基質和/或洗脫系統(tǒng)。例如，可利用初步洗脫步驟從樹脂上去除大部分污染物，然后再進行洗脫步驟，將痘病毒顆粒從基質上移出。作為一個或多個前述洗脫步驟的替代或與其組合，也可利用洗脫步驟先將大部分痘病毒顆粒從基質上移出，而留下與基質結合的污染物。也可采用洗滌步驟，去除污染物，使大部分與基質結合的材料是痘病毒成分。在這樣的情況下，可使用一步洗脫步驟從樹脂上移出結合的痘病毒顆粒。通常，鹽溶液用作洗脫緩沖液。任何合適的鹽都可用于洗脫緩沖液。在某些實施方案中，可使用氯化鈉(NaCl)。而且在一些實施方案中，可使用高鹽緩沖液。高鹽緩沖液通常是約或具體300mM、600mM或IM的鹽(例如NaCl)。例如，可在含有約或具體300mM、600mM或IM NaCl的合適緩沖液中進行洗脫。任何合適的緩沖液都可使用，例如Tris CL(例如5、10、15或20mM)緩沖液。在某些實施方案中，優(yōu)選使用緩沖液，例如PH約或具體7. 0,7. 5,8. 0,8. 5或9. 0的含有高鹽濃度(例如300mM、600mM 或1M)的Tris進行洗脫。其它洗脫緩沖液的使用是本領域已知的，并且可適用于進行本文所述的方法。部分純化的樣品例如細胞裂解物可以經歷幾種方法中的任何方法，包括例如硫酸銨沉淀、滲析、大小排阻分級、密度梯度分級、蔗糖墊超速離心或暴露給酶。示例性的酶包括例如蛋白酶(例如胰蛋白酶)、內切核酸酶(例如benzonase)或其它酶。這些方法中的任何方法都可在任何其它方法之前使用、單獨使用或組合使用，并且可在樣品經歷離子交換色譜之前使用，得到基本上純化的、實質上純化的或純化的痘病毒制備物。本文所述的方法可用于分離病毒，包括但不限于痘病毒(Smith等，1983，Gene, 25(1) 21-8 ；Moss 等，1992，Biotechnology，20 :345-62 ；Moss 等，1992，Curr. Top. Microbiol. Immunol.，158 :25-38 ；Moss 等，1991. Science, 252 :1662-1667)。示例性的痘病毒是痘苗病毒及其衍生物例如NYVAC和修飾的Ankara病毒(MVA)、禽痘、雞痘、金絲雀痘、 ALVAC和ALVAC( 等。痘病毒可以是重組的，是指痘病毒基因組中含有外源核酸序列。重組痘病毒可呈例如重組痘病毒顆粒(或者稱為重組病毒體)的形式。NYVAC (vP866)衍生自痘苗病毒哥本哈根疫苗株，即通過缺失編碼已知或潛在毒力因子的基因組的6個非必要區(qū)(參見例如美國專利號5，364，773和5，494，807)。缺失基因座也經工程化成為受體基因座，用于插入外源基因。缺失區(qū)是胸苷激酶基因(TK ；J2R)； 出血區(qū)(U ;B13R+B14R) ；A型包含體區(qū)(ATI ；A26L)；血凝素基因(HA ;A56R)；宿主范圍基因區(qū)(C7L-K1L)；和大亞基核糖核苷酸還原酶(I4L)。NYVAC是經基因工程改造的痘苗病毒病毒株，是通過編碼毒力和宿主范圍相關的基因產物的18個可讀框的特異性缺失而產生的。 已經證明NYVAC可用于表達腫瘤抗原(參見例如美國專利號6，265, 189)。依據布達佩斯條約的條款，將 NYVAC(vP866)、vP994、vCP205、vCP1433、placZH6H4Lreverse、pMPC6H6K3E3 和 PC3H6FHVB也保藏在ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏日期為1997年3月6日，保藏號分別為 VR-2559、VR-2558、VR-2557、VR-2556、ATCC-97913、ATCC-97912 和 ATCC-97914。修飾的病毒Ankara (MVA)先前已有描述，例如美國專利號5，185，146和 6, 440, 422 ；Sutter 等(B.Dev. Biol. Stand. Basel, Karger84 :195-200(1995)) ；Antoine 等 (Virology 244 :365-396,1998) ；Sutter 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10847-10851, 1992) ；Meyer 等(J. Gen.Virol.72 :1031-1038,1991) ；Mahnel 等(Berlin Munch. Tierarztl. ffochenschr. 107 :253-256,1994) ；Mayr 等(Zb1. Bakt. Hyg. I，Abt.Org. B167 375-390 (1987)；和 Mickl 等(Dtsch. med. ffschr. 99 :2386-2392 (1974))。MVA 可得自 ATCC， 保藏號 VR-1508 和 VR-1566。也可使用本文所述的方法來純化基于ALVAC的重組病毒(即ALVAC-I和ALVAC-2) (參見例如美國專利號5，756，103)。ALVAC(2)與ALVAC(I)相同，不同之處在于ALVAC(2) 基因組包含處于痘苗病毒啟動子控制之下的痘苗病毒E3L和K3L基因(美國專利號 6，130，066 ；Beattie 等，1995a, 1995b, 1991 ；Chang 等，1992 ；Davies 等，1993)。已經證明 ALVAC(I) ^P ALVAC(2)都可用于表達外源 DNA 序列，例如 TAs (Tartaglia 等，1993a，b ；美國專利號5，833，975)。依據布達佩斯條約的條款，將ALVAC保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209，USA)，ATCC 保藏號 VR-2547，保藏日期為1996年11月14日。也可使用本文所述的方法來純化TROVAC病毒。TROVAC是指減毒雞痘，它是衍生自雞痘病毒FP-I疫苗株的噬斑-克隆分離物，所述疫苗株已經批準用于一日齡小雞的免疫接種。同樣依據布達佩斯條約的條款，將TROVAC保藏在ATCC (美國典型培養(yǎng)物保藏中心)，保藏號2553，保藏日期為1997年2月6日。本文也提供含有由本文所述方法純化的病毒的藥用組合物。合適的藥用組合物通?？砂ㄖ辽僖环N病毒和藥學上可接受的載體和/或賦形劑(例如其并不認為是污染物)。 本文所用的術語“藥學上可接受的載體”是指適于實現(xiàn)或增強本文所述藥物遞送的一種或多種配制材料。制劑可包括緩沖液、鹽、糖和/或本領域已知的類似化合物。合適的組合物可包括液體制劑，例如無菌制備的用于胃腸外、皮下、皮內、肌內或靜脈內給藥的無菌混懸劑、糖漿劑、乳劑或酏劑。另外，所述組合物可以與藥物同時給予或序貫給予。人或其它哺乳動物的合適的日用量可有寬范圍的變化，取決于所給予的病毒類型、患者的情況和其它因素，但可使用常規(guī)方法來確定。也提供包含用本文所述的方法來純化病毒的試劑的試劑盒。該試劑盒可包含例如緩沖液、濾器等，使技術人員可以進行本文所述的方法。另外，所述試劑盒可包含用于進行本文所述的方法的使用指南。本文所用的縮略語包括如下CPE 細胞病理效應；CCID5tl 細胞培養(yǎng)物感染劑量 50% ；CEF 雞胚成纖維細胞；CHT 陶瓷羥基磷灰石；CIM 對流相互作用介質；CV 柱體積； EBA 膨脹床吸附；EB14細胞系由VIVALIS France得自雞胚干細胞的穩(wěn)定二倍體細胞系；EDTA 乙二胺四乙酸；EEV 胞外包膜病毒；ELISA 酶聯(lián)免疫吸附測定；FBS 胎牛血清； FF 快速流動；G 離心單元；GEQ 基因組當量；IMV 胞內成熟病毒；LMH 升/平方米/小時； MOI 感染復數(shù)；PBS 磷酸緩沖鹽水；QT35 來自日本鵪鶉的化學誘導的纖維肉瘤；qPCR 定量聚合酶鏈式反應；RT 室溫；TFF 切向流過濾；TMP 跨膜壓力；WFI 注射用水細胞病理效應(CPE)定義為細胞結構上的形態(tài)學改變的觀察結果，例如細胞變圓并從底物上脫落、細胞裂解、形成合胞體和因病毒感染而形成包含體。CCID50是指感染50% 所給批次的接種細胞培養(yǎng)物所需的病毒稀釋度。所述測定依賴于殺細胞的病毒顆粒的存在和檢測。宿主細胞在96孔板中生長成匯合的健康單層，向其中加入等分試樣的病毒稀釋液。在孵育期間，病毒復制和后代病毒體釋放而感染健康細胞。讓CPE發(fā)展一段時間，然后統(tǒng)計存在或不存在CPE的孔。病毒懸液的“滴度”，表示為每單位體積的感染單位，是在懸液中在指定條件下能產生感染灶或細胞病理效應的病毒顆粒的評價值。痘病毒滴度隨所用細胞類型、感染方法和孵育條件的不同而異?！癎EQ”或基因組當量表示1基因組當量等于0. 3 飛克DNA。根據以下以示例性方式給出的實施例，將會更好地理解本發(fā)明及其許多優(yōu)勢。 實施例本文所述的方法可用于純化病毒例如痘病毒。基于色譜的純化工藝用于制備含有禽痘病毒例如ALVAC并且非禽痘DNA水平減少的組合物，以滿足對于疫苗安全性、穩(wěn)定性和效力的法規(guī)要求。以下描述了用于純化病毒的材料、優(yōu)化實驗和幾種示例性方法。I.材料這些實施例所用的緩沖液包括IOmM Tris-HCl緩沖液，pH 7. 4 ； IOmM Tris-HCl緩沖液，pH 9. 0 ；IOmM Tris-HCl/lM NaCl 緩沖液，pH7. 4 ；IOmM Tris-HCl/lM NaCl 緩沖液，pH 9.0。所用的其它試劑包括 0. 5M MgCl2UM EDTA、Benzonase 內切核酸酶(EM Industries, Inc.目錄號 1. 01694. 0002 和 1. 1697. 0002)、ALVAC-HIV (vCP1521)/EB14 收獲物、ALVAC 黑素瘤(VCP2264) /CEF收獲物、Trovax/雞胚成纖維細胞(CEF)和Trovax/鴨細胞系 (Cell&Viral Platform, AvP Canada)。本文所用的色譜基質包括kpharose 4FF弱陰離子交換劑(例如 ANXS印harose 4FF(GE Healthcare,目錄號 17-1沘7_01 和 171287-04))、 Sepharose 4FF(GE Healthcare,目錄號 17-0149-01 禾Π 17-0149-05)和 kpharose 6FF(GE Healthcare,目錄號 17-0159-01)。以下給出下述方法所用的設備的并非詳盡的列表=AKTAExplorer, Unicorn軟件，GE Healthcare ；BPG 色譜柱 100/500，GEHealthcare ；離心機(Jouan KR422,設備號 CEN1122RSM 1167) ；EasyLoad II 蠕動泵(Cole-Parmer Instrument Company,型號 77200-062 和型號 75四-10)；冰箱，-70°C (Sanyo, BIF0309) ；Profile star 5μπι深層過濾器(PALL，目錄號 ΒΥΑ050Ρ6) ；Profi Ie star 3 μ m 深層過濾器(PALL，目錄號 BYA030P6)； 硅膠管(3/16”和3/8”，Tygon,目錄號ABW0013) ；Virsonic 600超聲細胞破碎機(超聲波儀)；Misonix Flocell 連續(xù)流動室；TFF 柱(GE Healthcare，型號 UPF-500-C_3x2MA)；高壓滅菌器(Kuhlman, KG2119), Millipore polygard CN opticap XL5 深層過濾器(目錄號 KN1HA05HH1)；恒溫箱(SANYO, ID#M64，設定在 38士 1°C )；和水浴(Polyscience，型號 G-560)。II.方法A.示例性方法本文所述的純化工藝可用于純化基于痘病毒的疫苗。這類痘病毒包括但不限于 ALVAC病毒及其衍生物例如ALVAC-2。一般而言，所述方法包括以下步驟1.使用例如生物反應器，從細胞所產生的樣品中獲取痘病毒收獲物并通過離心濃縮(即10倍)所述收獲物；2.通過合適方法例如通過直接超聲處理的細胞破碎，釋放胞內痘病毒，得到粗制痘病毒制備物；3.使用例如用5 μ m和3 μ m深層過濾器連續(xù)過濾，澄清粗制痘病毒制備物；4.使用試劑例如Benzonase核酸酶，降解澄清的粗制痘病毒制備物中存在的游離 DNA ；5.通過凝膠過濾，使用合適的色譜基質和緩沖劑系統(tǒng)例如kpharose 4FF/6FF， 得到半純化的痘病毒制備物；6.用合適的離子交換基質例如kpharose 4FF (ANX)，純化基本上純化的、實質上純化的或純化的痘病毒制備物；和7.通過過濾(即切向流過濾)濃縮和交換緩沖液。本方法的一個具體的實施方案如下所述。如其中所示，從痘病毒收獲物中成功分離出純化的痘病毒制備物(ALVAC)。
B. ALVAC-HIV 載體的純化1.從例如生物反應器中所產生的樣品中獲取痘病毒收獲物并通過離心濃縮(即 10倍)在生物反應器(例如IOL-生物反應器)中，將ALVAC HIV生長在禽細胞系 EB14/074中。收獲培養(yǎng)物并等分到IL無菌離心瓶(700mL/瓶)中，用Jouan KR422離心機，在4°C于4000Xg離心40分鐘。棄去上清液，將細胞重懸于50mL IOmM Tris-HCl pH 7. 0-9.0(每瓶)。將所得混合物劇烈震蕩并移至IL無菌Nalgene瓶中。使?jié)饪s材料的終體積達到最初收獲物體積的1/10，用IOmM Tris-HCl pH 7. 0-9. 0，得到10倍(IOX)濃縮收獲物。將該濃縮收獲物貯存于-80°C冰箱，直至進一步使用。2.通過合適方法例如通過直接超聲處理的細胞破碎，釋放胞內痘病毒，得到粗制痘病毒制備物。對帶有連接入口 /出口管的超聲波儀進行高壓滅菌。將fesyload II蠕動泵接到超聲波儀的入口管線。通過以50mL/min流速泵送200mL10mM Tris-HCl pH 7. 0-9. 0緩沖液，使超聲波儀平衡并連線。以50mL/min流速，將IOX濃縮收獲物通過超聲波儀泵送。當樣品到達超聲波儀入口時，啟動超聲波儀，功率輸出55-65瓦。再通過超聲波儀出口將經超聲處理的收獲物收集到無菌瓶中。這就是粗制痘病毒制備物。3.使用例如用5 μ m和3 μ m深層過濾器連續(xù)過濾，澄清粗制痘病毒制備物對帶有連接入口 /出口管的5 μ m/3 μ m過濾器(PALL、BY050P6和BY030P6)進行高壓滅菌。將fesyload II蠕動泵接到5μπι過濾器的入口管線。通過以200mL/min泵流速泵送200mL IOmM Tris-HCl pH7. 0-9. 0，使深層過濾器平衡。將超聲處理的收獲物用等體積的IOmMTris-HCl pH 7. 0-9. 0緩沖液稀釋。以200mL/min流速將最高達500mL稀釋的收獲物通過一組5 μ m/3 μ m深層過濾器(5 μ m后接3 μ m過濾器)泵送，接著以400mL/min 流速收集剩余樣品。用50mL IOmM Tris-HClpH 7. 0-9. 0漂清深層過濾器，以驅趕保留的樣品。將澄清的粗制痘病毒制備物貯存于_80°C冰箱，直至進一步使用。4.使用試劑例如Benzonase核酸酶，降解澄清的粗制痘病毒制備物中存在的游離 DNA。將Benzonase核酸酶加入到預選擇量的澄清痘病毒制備物中，終濃度為10-50單位/ml。加入MgCl2 (核酸酶催化劑)，終濃度為2. OmM。將各組分在20士3°C混合容器中用磁力攪拌棒混合1-2小時(取決于具體制備物)。消化結束時，加入EDTA，終濃度為5mM，以終止酶反應。5.通過凝膠過濾，使用合適的色譜基質和緩沖劑系統(tǒng)例如kpharose 4FF/6FF， 得到半純化的痘病毒制備物。通過用IM NaOH填充柱子過夜，對柱子、適配器及其連接管消毒。然后放掉NaOH， 柱子、適配器及其連接管用2倍柱體積的注射用水(WFI)漂洗，再用1倍柱體積的70%乙醇消毒。然后在柱內填充10cm WFI或平衡緩沖液并將所需體積的樹脂(kpharose 4FF或 Sepharose 6FF)倒入柱內，裝填20cm高度的柱子。將WFI與kpharose4FF或kpharose 6FF介質混合，得到均勻溶液。用高度調節(jié)裝置，使頂端適配器位于液面上3-lOcm。將頂端適配器入口管與AKTAExplorer系統(tǒng)連接，并使用AKTA系統(tǒng)，將70%乙醇通過它泵入，消毒管線并潤濕柱網，以消除任何殘存空氣。讓樹脂沉降，直到看見l-2cm頂部澄清液層。將頂端適配器降低到澄清液層以下l-2cm，并將適配器O-環(huán)密封。將柱出口線與AKTA Explorer 系統(tǒng)連接。為了裝柱，使用AKTA系統(tǒng)，以23-30cm/hr泵送WFI或平衡緩沖液。當樹脂裝填到約20cm高度時，將頂端適配器降低到沉降樹脂床以上約0. 5cm,并通過順時針方向旋轉密封調節(jié)旋鈕將適配器O-環(huán)密封。 調節(jié)AKTA explorer系統(tǒng)，以高流速通過所有閥門，以降低背壓。以手動模式，用 IOOmL 70%Et0H消毒樣品線，再用200mL WFI 漂清并用 IOOmL IOmM Tris-HCl pH 7.0-9.0 平衡。如上所述地裝柱，樹脂用2倍柱體積的緩沖液(IOmM Tris-HCl pH 7.0-9.0)以 15-23cm/hr平衡，直到所有工藝參數(shù)(電導率和pH)曲線穩(wěn)定。在生物櫥(biocontainment cabinet)內，將AKTA樣品線放入準備上樣到柱中的澄清的痘病毒制備物中。上樣體積為 15-20%的柱體積。在具有以下參數(shù)的預定程序方法下，運行BPGlOOd. 5LS印harose 4FF或6FF)色譜儀·、流速 15cm/hr·用 50mL IOmM Tris-HCl pH 7. 0-9. 0 平衡·上樣體積15 %的柱體積·用 2 倍柱體積的 IOmM Tris-HCl pH 7. 0-9. 0 洗脫發(fā)現(xiàn)洗脫的第一峰含有70-90%病毒(500mL)，收集到500ml無菌Nalgene瓶中， 并將這半純化的痘病毒制備物貯存于4°C，直至進一步使用。6.用合適的離子交換基質例如S印harose 4FF (ANX)，純化基本上純化的、實質上純化的或純化的痘病毒制備物。將合適體積(干樹脂體積等于含病毒的凝膠過濾流分的體積)的ANX Sepharose 4FF (GE Healthcare,目錄號 17-1287-01 和 171287-04)樹脂漿液(在 20% 乙醇中)倒入 2L Nalgene瓶(裝有磁力攪拌器)中，讓樹脂沉降。用蠕動泵，以200ml/min流速泵送去除乙醇。樹脂用2倍樹脂體積的WFI洗滌2次，然后用2倍樹脂體積的IOmM Tris-HCl pH7. 0-9. 0 平衡(2次)。讓樹脂沉降，以200-500ml/min速度泵出緩沖液。將等體積樣品加入到沉降的樹脂中，在20士3°C混合1小時。讓樹脂沉降，以200-500ml/min泵速泵出未結合的樣品。 樹脂用2倍樹脂體積的IOmM Tris-HCl pH 7. 0-9. 0洗滌2次。再讓樹脂沉降，所得洗滌樣品以200-500ml/min泵速泵出。病毒用2倍樹脂體積的IOmMTris-HCl pH 7. 0-9. 0/1M NaCl 洗脫3次，得到純化的痘病毒制備物。再讓樹脂沉降，洗脫液以200-500ml/min流速泵入無菌瓶中。用 54μπι 過濾器(Millipore polygard CN optical XL5)以 500_1000mL/min 泵速，將剩余樹脂從洗脫池中移出。7.通過過濾(即切向流過濾(TFF))濃縮和交換緩沖液。將TFF柱的入口(進料)線與蠕動泵連接管相連并夾住一個滲透物出口。將70% 乙醇泵過柱體并對柱體和連線浸泡過夜，以溶解貯存用甘油并消毒系統(tǒng)。柱體用10-12L WFI漂洗，泵速200mL/min，跨膜壓力(TMP)O. 2-0. 4巴，以去除乙醇并測試水通量。通過測定滲透物流速和TMP進行清潔水通量試驗通量[升，平方米，小時(LMH)/巴]={[滲透物流速(mL/min)/柱面積 (m2) ] X 0. 06} /TMP (巴)對于新柱體而言，通量應大于分析證書上所標明的399LMH/巴。通過夾住滲透物線，以200mL/min的錯流速率，循環(huán)0. 5-1L IOmMTris-HCl pH 7. 0-9. 0達30分鐘，使柱體平衡。以8000-10000sec-l的剪切速率和0. 4-1巴的TMP，將樣品濃縮至洗脫合并液原始體積的1/10至1/3。用3倍體積的IOmM Tris-HCl pH 7. 0-9. 0的連續(xù)滲濾，進行緩沖液交換。將滲濾的樣品濃縮至所需體積。將滲透物線夾住，以上述剪切速率，將濃縮物循環(huán) 5-10分鐘。收集濃縮樣品體積并測定。通過以上述剪切速率泵入200mL IOmM Tris-HCl pH 7. 0-9. 0而洗滌系統(tǒng)并收集洗滌液。通過通入IL 70%乙醇，以消毒系統(tǒng)。本實施方案的概述如下所示表 權利要求
1.一種用于純化痘病毒的方法，所述方法包括使粗制痘病毒制備物經歷離子交換色譜，得到基本上不含污染物的痘病毒制備物。
2.一種用于純化痘病毒的方法，所述方法包括使粗制痘病毒制備物經歷離子交換色譜，得到實質上不含污染物的痘病毒制備物。
3.一種用于純化痘病毒的方法，所述方法包括使粗制痘病毒制備物經歷離子交換色譜，得到不含污染物的痘病毒制備物。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述粗制痘病毒制備物首先經歷凝膠過濾，以得到半純化的痘病毒制備物。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其中所述粗制痘病毒制備物經核酸酶處理并經歷凝膠過濾，以得到半純化的痘病毒制備物。
6.一種用于純化痘病毒的方法，所述方法包括在相對于污染物而言，提供痘病毒與所述基質選擇性相互作用的條件下，使含有痘病毒和至少一種污染物的樣品與離子交換色譜基質接觸，并將痘病毒從所述基質上洗脫下來。
7.一種從樣品中純化痘病毒的方法，所述方法包括提供包含相對于污染物而言與痘病毒選擇性結合的離子交換基質的固體支持物，用洗滌緩沖液洗滌所述基質以去除污染物， 并且將結合的痘病毒從所述固體支持物上洗脫下來。
8.權利要求7的方法，其中通過使結合在所述固體支持物上的痘病毒與高鹽溶液接觸而進行洗脫。
9.權利要求7的方法，其中所述樣品是細胞裂解物。
10.權利要求9的方法，其中在色譜柱中提供所述固體支持物。
11.一種從部分純化的樣品中分離痘病毒的方法，所述方法包括(a)提供含有痘病毒的部分純化的樣品；(b)在痘病毒與基質結合的條件下，使所述部分純化的樣品與包含離子交換基質的固體支持物接觸；和(c)將結合的痘病毒從所述固體支持物上洗脫下來。
12.權利要求11的方法，其中所述部分純化的樣品在步驟(a)之前，已經通過選自以下的方法而部分純化硫酸銨沉淀、滲析、大小排阻分級、密度梯度分級和蔗糖墊超速離心。
13.權利要求12的方法，其中在色譜柱中提供所述固體支持物。
14.權利要求12的方法，其中所述接觸是在溶液中進行。
15.權利要求1的方法，其中所述離子交換基質選自強陰離子交換劑、弱陰離子交換劑、強陽離子交換劑和弱陽離子交換劑。
16.權利要求11的方法，其中所述離子交換基質選自Qkpharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow、CM Sepharose FastFlow、DEAE Sepharose Fast Flow 和 ANX Sepharose 4Fast Flow。
17.權利要求16的方法，其中所述離子交換基質是ANXkpharose 4Fast Flow0
18.一種用于從細胞培養(yǎng)物中純化痘病毒的方法，所述方法包括以下步驟a)收獲含有痘病毒的細胞；b)破碎所述細胞，得到粗制痘病毒制備物；c)所述粗制痘病毒制備物經歷凝膠過濾，得到半純化的痘病毒制備物；和d)所述半純化的痘病毒制備物經歷陰離子交換色譜，得到純化的痘病毒制備物。
19.一種用于從細胞培養(yǎng)物中純化痘病毒的方法，所述方法包括以下步驟a)使感染了痘病毒的細胞裂解，得到粗制痘病毒制備物；b)使步驟a)所得到的所述粗制痘病毒制備物在用 IOmM Tris-HCl，ρΗ7· 0-9. 0 平衡的 S印harose 4Fast Flow 或 S印harose 6Fast Flow樹脂上進行凝膠過濾，得到半純化的痘病毒制備物；c)使步驟b)所得到的所述半純化的痘病毒制備物在用IOmM Tris-HCl, pH 7. 0-9. 0平衡的ANXS印harose 4Fast Flow 樹脂上進行陰離子交換色譜，以使痘病毒吸附于所述樹脂上；和d)用IOmM Tris-HCl, pH 7. 0-9. 0/1M NaCl，將步驟d)中吸附的痘病毒洗脫下來。
20.權利要求19的方法，其中所述粗制痘病毒制備物在進行步驟b)之前經過澄清。
21.一種從污染物中純化重組痘病毒病毒體的方法，所述方法包括(a)將痘病毒載體引入合適的宿主細胞；(b)培養(yǎng)所述宿主細胞，得到痘病毒病毒體；(c)從步驟(b)的所述宿主細胞中制備裂解物；(d)將所述裂解物通過陰離子交換色譜基質，從而使所述重組痘病毒結合在陰離子交換色譜基質上；和(f)將痘病毒從陰離子交換色譜基質上洗脫下來。
22.權利要求21的方法，其中通過超聲處理制備步驟(c)的所述裂解物，并且用核酸酶處理所述裂解物，然后進行步驟(d)。
23.權利要求21的方法，其中步驟(c)的所述裂解物經歷凝膠過濾色譜，然后進行步驟⑷。
24.權利要求23的方法，其中通過超聲處理制備步驟(c)的所述裂解物，并且用核酸酶處理所述裂解物，然后進行凝膠過濾。
25.權利要求21的方法，其中所述離子交換基質選自強陰離子交換劑、弱陰離子交換劑、強陽離子交換劑和弱陽離子交換劑。
26.權利要求21的方法，其中所述離子交換基質選自Qkpharose Fast Flow, SP S印harose Fast Flow、CM Sepharose FastFlow、DEAE Sepharose Fast Flow 和 ANX Sepharose 4Fast Flow。
27.權利要求21的方法，其中所述離子交換基質是ANXkpharose 4Fast Flow0
28.一種用于得到純化的痘病毒制備物的方法，所述方法包括以下步驟的組合(a)從細胞培養(yǎng)樣品中獲取痘病毒收獲物；(b)從所述樣品所含細胞中釋放胞內痘病毒，得到粗制痘病毒制備物；(c)通過過濾澄清所述粗制痘病毒制備物；(d)用核酸酶處理步驟(c)的所述制備物；(e)使步驟(d)的所述制備物經歷凝膠過濾，得到半純化的痘病毒制備物；(f)所述半純化的痘病毒制備物經歷離子交換色譜，得到純化的痘病毒制備物。
29.權利要求觀的方法，其中步驟(f)使用選自以下的離子交換基質強陰離子交換劑、弱陰離子交換劑、強陽離子交換劑和弱陽離子交換劑。
30.權利要求觀的方法，其中步驟(f)使用選自以下的離子交換基質QSepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow>CMSepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow 和 ANXS印harose 4Fast Flow。
31.權利要求21的方法，其中步驟(f)使用離子交換基質ANXkpharose 4Fast Flow.
全文摘要
本文提供使用包括但不限于凝膠過濾和/或離子交換色譜的一個或多個層析步驟來純化痘病毒的方法。
文檔編號C12N7/00GK102257134SQ200980113708
公開日2011年11月23日 申請日期2009年2月12日 優(yōu)先權日2008年2月12日
發(fā)明者Y·熊 申請人:賽諾菲巴斯德有限公司