使用離子交換色譜來控制高甘露糖糖型的水平的方法
【專利說明】使用離子交換色譜來控制高甘露糖糖型的水平的方法 背景
[0001] 在細(xì)胞中合成的多膚經(jīng)常經(jīng)歷翻譯后修飾。祀向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)巧時的大多數(shù)多膚被 糖基化，即，在稱為糖基化的過程期間，酶促地將糖殘基（或寡糖）添加至多膚。糖基化的 多膚也稱為糖蛋白。在真核細(xì)胞中，在ER的腔中，特定寡糖（包括14N-乙酷葡糖胺、甘露 糖、和葡萄糖殘基）被附接至多膚的精氨酸殘基。因?yàn)楣烟强偸寝D(zhuǎn)移至精氨酸殘基的側(cè)鏈 上的畑2基團(tuán)，所W運(yùn)一寡糖稱為N-聯(lián)的或天冬酷胺聯(lián)的寡糖。N-聯(lián)寡糖被添加至序列天 冬酷胺-X-絲氨酸或天冬酷胺-X-蘇氨酸中存在的天冬酷胺殘基上，其中X是除了脯氨酸 W外的任何氨基酸。因此，運(yùn)兩個序列（Asn-X-Ser或Asn-X-T虹）的功能為N-聯(lián)糖基化的 信號。此外，高爾基復(fù)合體中的一系列糖基轉(zhuǎn)移酶可W將糖殘基添加至多膚中的絲氨酸或 蘇氨酸的徑基側(cè)鏈（0H)，運(yùn)是一個稱為0-聯(lián)糖基化的過程。
[0002] 在N-聯(lián)寡糖的附接后，可W在邸和高爾基復(fù)合體運(yùn)二者中發(fā)生糖殘基的進(jìn)一步 修飾。在邸中，葡萄糖殘基可W與某些甘露糖殘基一起從寡糖修整。在高爾基復(fù)合體中， 多種酶起到移除甘露糖殘基和/或添加其他糖殘基（包括N-乙酷葡糖胺、半乳糖、和唾液 酸）的作用。在成熟糖蛋白中發(fā)現(xiàn)了兩大類N-聯(lián)寡糖：復(fù)合寡糖和高甘露糖寡糖。在高爾 基復(fù)合體中，高甘露糖寡糖典型地沒有添加至它們的新糖。它們包含兩個N-乙酷葡糖胺和 多個甘露糖殘基，最初存在于附接至ER中的多膚的寡糖前體中的通常接近數(shù)字巧）。從另 一方面來說，復(fù)合寡糖可W包含多于一個的原兩個N-乙酷葡糖胺連同可變個數(shù)的半乳糖 和唾液酸殘基，并且在某些例子中，是海藻糖。唾液酸殘基的獨(dú)特性在于它們是僅有的帶有 凈負(fù)電荷的糖蛋白的糖殘基。
[0003] 多膚的糖基化可W影響它們的特性和功能。例如，抗體分子的糖基化可W影響 重要的免疫系統(tǒng)功能，例如抗原的補(bǔ)體活化、從身體的清除、W及效價。在IgG分子中，用 于Clq的結(jié)合位點(diǎn)、補(bǔ)體活化的第一補(bǔ)體位于Fc區(qū)中的Ch2結(jié)構(gòu)域（莫里森（Morrison)， S.L.等人，（1994)免疫學(xué)家燈heImmunologist)，2,119-124)。在抗體上高甘露糖寡糖（例 如高甘露糖5)的存在通常導(dǎo)致從身體的更快清除，降低了它的效價（賴特（Wri曲t)，A.等 人（1998)免疫學(xué)雜志（JournalofImmunology)，160,3393-3402)。由于運(yùn)些糖型對清 除、免疫原性、和功效的作用，高水平的高甘露糖5糖型可W是治療性抗體的關(guān)注問題（帕 西斯（Pacis)等人，（2011)生物技術(shù)與生物工程度iotechnologyandBioengineering)， 108(10) :2348-58)。從另一方面來說，其他研究已經(jīng)示出，高甘露糖抗體，產(chǎn)生于糖基化抑 制劑的存在下，具有更大ADCC活性和對Fc丫Rllla的更大親和力（帕西斯（Pacis)等人， (2011)生物技術(shù)與生物工程度iotechnologyandBioengineering) ,108(10) :2348-58)。
[0004] 抗體分子的糖基化典型地取決于細(xì)胞培養(yǎng)條件，包括其中培育抗體分子的宿主細(xì) 胞和抗體的類型（拉朱（Ra化），T.S. (2003)生物過程國際度ioProcessInternational.)， 4,44-53)。對于在制造治療性抗體期間控制高甘露糖5糖型的水平的目前所作努力是針 對操縱細(xì)胞培養(yǎng)過程而不是純化過程（帕西斯（Pacis)等人，（2011)生物技術(shù)與生物工程 度iotechnologyandBioengineering) ,108(10): 2348-58)?？贵w的糖型水平典型地并不 受下游純化過程條件的影響。
[0005] 作為雜質(zhì)的在治療性抗體中的高甘露糖糖型的存在會影響安全性或功效。然而， 在其中旨在設(shè)計用于治療性抗體W觸發(fā)免疫系統(tǒng)來產(chǎn)生針對療法的抗體的情況下，一致地 更高量的潛在更致免疫的高甘露糖糖型會是優(yōu)選的。因此，對于在制造治療性抗體期間控 制高甘露糖5糖型的水平存在需要，W便確保產(chǎn)品質(zhì)量（安全性和功效）。本發(fā)明描述了可 W用于獲得具有受控水平的高甘露糖糖型的治療性抗體的加工策略，取決于正制造的治療 性抗體的特定需要。 發(fā)明概述
[0006] 本披露提供了使用離子交換色譜來減少糖蛋白樣品（例如抗體樣品）中的高甘露 糖糖型的量的方法。運(yùn)些方法可W用于產(chǎn)生具有非常低水平的高甘露糖糖型的糖蛋白組合 物。因此，另一方面針對包括糖蛋白（例如單克隆抗體）的組合物，其中該糖蛋白包括至少 兩個N-聯(lián)寡糖，并且其中在該組合物中，小于2 %的糖蛋白是高甘露糖糖型。
[0007] 本發(fā)明披露了減少樣品中糖蛋白的高甘露糖糖型的量的方法，該糖蛋白包括糖蛋 白的高甘露糖糖型和至少一種其他糖型。該方法包括在允許糖蛋白保留到離子交換柱上的 條件下，將樣品加載到離子交換柱上；使洗脫緩沖液通過該離子交換柱，W從該離子交換柱 上洗脫糖蛋白，收集從該離子交換柱洗脫并且包括至少一種其他糖型的第一一種或多種級 分；并且從第一一種或多種級分排除在第一一種或多種級分之前或之后從該離子交換柱洗 脫并且包含高甘露糖糖型的第二一種或多種級分，其中相對于在加載到該離子交換柱上之 前樣品中高甘露糖糖型的量，在第一一種或多種級分中高甘露糖糖型的量減少。
[0008] 在一些實(shí)施例中，除了其他之外，洗脫緩沖液可W包括含有鹽類（例如氯化鋼、硫 酸鋼、硫酸錠、精氨酸）的至少一種緩沖液。該洗脫緩沖液可W包括至少一種緩沖液類，例 如巧樣酸鹽、乙酸鹽、憐酸鋼、Tris、或甘氨酸等。洗脫緩沖液可W是含有鹽類的至少一種緩 沖液和來自緩沖液類的至少一種緩沖液的組合。在3. 5和8. 0之間的抑條件的變化還可 W潛在地用于實(shí)現(xiàn)高甘露糖糖型分離。
[0009] 在另一方面，本披露提供了使用離子交換色譜來分離或富集糖蛋白樣品（例如抗 體樣品）中的高甘露糖糖型的方法。運(yùn)些方法可W用于產(chǎn)生具有非常濃縮的水平的高甘露 糖糖型的糖蛋白組合物。因此，另一方面針對包括糖蛋白（例如單克隆抗體）的組合物，其 中該糖蛋白包括至少兩個N-聯(lián)寡糖并且其中在該組合物中，至少50%的糖蛋白是高甘露 糖糖型。 附圖簡要說明
[0010] 結(jié)合在其中并且構(gòu)成了本說明書的一部分的【附圖說明】了某些實(shí)施例，并且與書面 說明一起，用于解釋在此披露的抗體和方法的某些原理。
[0011] 圖1示出在Fc區(qū)的句2結(jié)構(gòu)域和F油區(qū)的Vh結(jié)構(gòu)域上具有N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)的 mAb7. 159. 2(ATCC登錄號PTA-7424)抗體的簡化物理結(jié)構(gòu)。
[0012] 圖2示出在mAb7. 159. 2抗體的Fc和F油區(qū)上存在的主要寡糖。Man=甘露糖； GlcNAc=N-乙酷葡糖胺；化C=海藻糖；Gal=半乳糖；NANA=N-乙酷神經(jīng)氨酸，也稱為 唾液酸；并且2AB= 2-氨基苯甲酯胺（用于聚糖分析的巧光標(biāo)記）。
[001引圖3示出在POROS"服50 (應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems)，卡爾斯 己德（Carlsbad),加利福尼亞州）上mAb7. 159. 2抗體的對照運(yùn)行的色譜圖，具有對產(chǎn)物中 的高甘露糖5糖型（"Man5")進(jìn)行洗脫和濃縮的步驟。
[0014] 圖4示出來自線性梯度洗脫運(yùn)行的mAb7. 159.2產(chǎn)物，具有在該梯度的更晚級分 中洗脫的高甘露糖5糖型（"M5")。
[0015] 圖5示出采用了對照Abl抗體（IgGl)的線性梯度洗脫運(yùn)行并未導(dǎo)致從其他糖型 分離高甘露糖5糖型。
[0016] 圖6示出采用了對照Ab3抗體（IgG2)的線性梯度洗脫運(yùn)行并未導(dǎo)致從其他糖型 分離高甘露糖5糖型。
[0017] 圖7示出對于采用了mAb7. 159. 2抗體的線性梯度洗脫運(yùn)行的不同級分的保留時 間和吸光度值。在不同級分中可見電荷差異，其中早期的級分是更酸性的并且更晚的級分 是更堿性的。
[0018] 圖8示出在mAb7. 159. 2線性梯度洗脫級分中存在的糖型的相對比例，其中在早 期的級分中洗脫更成熟的糖型（例如唾液酸化的糖型），在更晚的級分中洗脫更不成熟的 糖型（例如高甘露糖5糖型）。
[0019] 圖9示出在mAb7. 159. 2線性梯度洗脫級分中存在的唾液酸（NANA)的量，其中在 陽離子交換色譜期間，糖型移除的趨勢的圖示具有重疊。
[0020] 圖10示出在mAb7. 159. 2運(yùn)行通過PO民OS'iXS(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems)，卡爾斯己德（Carlsbad)，加利福尼亞州）柱后，高甘露糖5糖型的分離。 [00引]圖11示出在mAb7. 159. 2運(yùn)行通過Nuvia?S(伯樂實(shí)驗(yàn)室公司度ioRad L油oratories)，赫拉克勒斯化ercules)，加利福尼亞州）柱后，高甘露糖5糖型的分離。
[0022] 圖 12 示出在mAb7. 159. 2 運(yùn)行通過Eshmuno。S(ApEMDMillipore公司，達(dá)姆施 塔特值armsta化），德國）柱后，高甘露糖5糖型的分離。
[0023] 圖13示出在mAb7. 159. 2運(yùn)行通過Capt〇TMS(通用電氣生命科學(xué)公司（GE HealthcareLifeSciences),皮斯卡塔韋（Piscataway)，新澤西州）柱后，高甘露糖5糖型 的分離。 詳細(xì)說明
[0024] 現(xiàn)在將詳細(xì)參考不同的示例性實(shí)施例，在附圖中說明了運(yùn)些示例性實(shí)施例的實(shí) 例。應(yīng)理解，提供W下詳細(xì)說明來給予讀者對本發(fā)明的多個方面的某些實(shí)施例、特征、和細(xì) 節(jié)的更充分理解，并且不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。 1.定義
[0025] 為了更容易理解本發(fā)明，首先限定了某些術(shù)語。貫穿