洗脫并且包括該 至少一種其他糖型的第一一種或多種級(jí)分；并且（d)從第一一種或多種級(jí)分排除第二一種 或多種級(jí)分，其中該第二一種或多種級(jí)分在第一一種或多種級(jí)分之前或之后從該離子交換 柱洗脫并且包含高甘露糖糖型，并且其中相對(duì)于在加載到該離子交換柱上之前樣品中高甘 露糖糖型的量，在第一一種或多種級(jí)分中高甘露糖糖型的量減少。
[0056]在一個(gè)實(shí)施例中，該離子交換柱是陽離子交換柱，并且在包含至少一種其他糖型 的第一一種或多種級(jí)分之后從該陽離子交換柱洗脫包含高甘露糖糖型的第二一種或多種 級(jí)分。
[0057]在另一實(shí)施例中，該離子交換柱是陰離子交換柱，并且在包含至少一種其他糖型 的第一一種或多種級(jí)分之前從該陰離子交換柱洗脫包含高甘露糖糖型的第二一種或多種 級(jí)分。
[0058]在又另一實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)量在第一一種或多種級(jí)分或第二一種或 多種級(jí)分中高甘露糖糖型的量的步驟。在另一實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括在加載樣品之 后并且在使洗脫緩沖液通過離子交換柱之前洗涂離子交換柱的步驟。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施例中，該糖蛋白是抗體，包括但不局限于在本申請(qǐng)中在上文"抗體"部 分、或其他地方描述的那些。
[0060] 在另一實(shí)施例中，在第一一種或多種級(jí)分中單克隆抗體的高甘露糖糖型的量小于 單克隆抗體的總量的2%。在另一實(shí)施例中，在第一一種或多種級(jí)分中單克隆抗體的高甘露 糖糖型的量小于單克隆抗體的總量的1 %。在又另一實(shí)施例中，相對(duì)于加載到離子交換柱上 之前樣品中單克隆抗體的高甘露糖糖型的量，在第一一種或多種級(jí)分中單克隆抗體的高甘 露糖糖型的量減少了至少100-、50-、10-、9-、8-、7-、6-、5-、4-、3-、或2-倍。 6. 從樣品中分離高甘露糖糖型的方法
[0061] 在本申請(qǐng)中描述的方法還可W用于在包含糖蛋白的樣品中分離或富集高甘露糖 糖型。在一個(gè)實(shí)施例中，該糖蛋白是抗體。
[0062] 因此，一個(gè)實(shí)施例是針對(duì)分離樣品中糖蛋白的高甘露糖糖型的方法，其中該樣品 包括糖蛋白的高甘露糖糖型和至少一種其他糖型，該方法包括：(a)在允許糖蛋白保留到 離子交換柱上的條件下，將樣品加載到離子交換柱上；化）使洗脫緩沖液通過該離子交換 柱，W便從該離子交換柱洗脫該糖蛋白；(C)收集從該離子交換柱上洗脫并且包含該高甘 露糖糖型的第一一種或多種級(jí)分；并且（d)從該第一一種或多種級(jí)分排除第二一種或多種 級(jí)分，其中該第二一種或多種級(jí)分在該第一一種或多種級(jí)分之前或之后從該離子交換柱洗 脫并且包含該至少一種其他糖型，由此分離該樣品中的該高甘露糖糖型。
[0063] 在一個(gè)實(shí)施例中，該離子交換柱是陽離子交換柱，并且在包含至少一種其他糖型 的第二一種或多種級(jí)分之后從該陽離子交換柱洗脫包含高甘露糖糖型的第一一種或多種 級(jí)分。
[0064] 在另一實(shí)施例中，該離子交換柱是陰離子交換柱，并且在包含至少一種其他糖型 的第二一種或多種級(jí)分之前從該陰離子交換柱洗脫包含高甘露糖糖型的第一一種或多種 級(jí)分。
[0065] 在又另一實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括測(cè)量在第一一種或多種級(jí)分或第二一種或 多種級(jí)分中高甘露糖糖型的量的步驟。在另一實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括在加載樣品之 后并且在使洗脫緩沖液通過離子交換柱之前洗涂離子交換柱的步驟。
[0066] 在一個(gè)實(shí)施例中，該糖蛋白是抗體，包括但不局限于在本申請(qǐng)中在上文"抗體"部 分、或其他地方描述的那些。
[0067] 在另一實(shí)施例中，相對(duì)于加載到離子交換柱上之前樣品中單克隆抗體的高甘露糖 糖型的量，在第一一種或多種級(jí)分中單克隆抗體的高甘露糖糖型的量增加了 1〇-、2〇-、30、 40-、50-、60-、70-、80-、90-、100-、200-、或大于 200-倍。 7. 組合物
[0068] 在本申請(qǐng)中描述的方法提供了用于從糖蛋白樣品中減少或除去高甘露糖糖型而 生成具有非常低水平的高甘露糖糖型的組合物的機(jī)制。
[0069] 因此，另一方面針對(duì)包括糖蛋白（例如單克隆抗體）的組合物，其中該糖蛋白包括 至少兩個(gè)N-聯(lián)寡糖，并且其中在該組合物中，小于2%的糖蛋白是高甘露糖糖型。在一個(gè)實(shí) 施例中，在該組合物中小于1%的糖蛋白是高甘露糖糖型。在一個(gè)實(shí)施例中，該糖蛋白是抗 體，包括但不局限于在本申請(qǐng)中在上文"抗體"部分、或其他地方描述的那些。
[0070] 在本申請(qǐng)中描述的方法還提供了用于從糖蛋白樣品中分離或富集高甘露糖糖型 而生成具有非常濃縮的水平的高甘露糖糖型的組合物的機(jī)制。
[0071] 因此，另一方面針對(duì)包括糖蛋白（例如單克隆抗體）的組合物，其中該糖蛋白包括 至少兩個(gè)N-聯(lián)寡糖并且其中在該組合物中，至少10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80 %、90 %、或95 %的糖蛋白是高甘露糖糖型。在一個(gè)實(shí)施例中，該糖蛋白是抗體，包括但不 局限于在本申請(qǐng)中在上文"抗體"部分、或其他地方描述的那些。 實(shí)例
[0072] 在此引用的所有專利、專利申請(qǐng)、和公開參考文獻(xiàn)都通過引用W其全文特此結(jié)合。 盡管已經(jīng)參考它的優(yōu)選實(shí)施例具體地示出和描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理 解，可W在不偏離由所附權(quán)利要求書所涵蓋的本發(fā)明的范圍的情況下在其中進(jìn)行形式和細(xì) 節(jié)上的各種改變。 實(shí)例1
[0073]mAb7. 159. 2 (ATCC登錄號(hào)PTA-7424)是全人類IgG2A單克隆抗體分子，組成為； 兩個(gè)相同的重鏈和兩個(gè)相同的輕鏈，具有約151kDa的總分子量。消光系數(shù)是1.54(mg/ 血）1畑11，并且pi是在7. 8和8. 8之間。存在兩個(gè)N-聯(lián)寡糖的糖基化位點(diǎn)，一個(gè)在F油區(qū) 中的重鏈中，在殘基Asn-73處，并且一個(gè)在Fc區(qū)中，在殘基Asn-296處（圖1)。在運(yùn)兩個(gè) 位點(diǎn)的寡糖都主要是復(fù)合型的。取決于細(xì)胞克隆和生物反應(yīng)器條件，mAb7. 159. 2的高甘 露糖5糖型可W在約3%-11 %之間變化（數(shù)據(jù)未示出）。在Fc區(qū)中的CH2結(jié)構(gòu)域上和在 Fab區(qū)中Vh結(jié)構(gòu)域上存在的聚糖示出在圖2中。除了在Fc區(qū)和Fab區(qū)運(yùn)二者上都存在的 其他聚糖，F(xiàn)油區(qū)還具有更高比例的在自然中是酸性的成熟的唾液酸化的聚糖。Fc區(qū)具有 更高比例的更不成熟的糖型，例如高甘露糖5糖型。
[00… PQRQS。服50 (應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedSiosystems)，卡爾斯己德 (Carlsbad)，加利福尼亞州）陽離子交換色譜被用作精制步驟，W便除去mAb7. 159. 2純化 過程中工藝相關(guān)的和產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)。色譜加載物和產(chǎn)物的分析示出，柱有效地除去了抗 體的聚集物和高甘露糖5糖型（"M5")運(yùn)二者（表1)。因此，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，W便進(jìn)一步理 解除去高甘露糖5糖型背后的機(jī)制。 表1 :在離子交換色譜步驟中聚集物和M5糖型的去除
[007引在下表1B中列出的條件下，用1. 1cmX17. 3cm(直徑X高度）POROS'"服50(應(yīng) 用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems)，卡爾斯己德（Carlsbad),加利福尼亞州）柱進(jìn)行 線性梯度洗脫（LG巧研究： 表1B柱條件
[0076] 在用mAb7. 159. 2和其他IgG抗體（對(duì)照Abl、對(duì)照Ab2和對(duì)照Ab3)進(jìn)行LGE研 究期間，收集0. 5CV級(jí)分并且使用A280nm、高壓尺寸排阻色譜（HPSEC)和寡糖曲線分析對(duì)運(yùn) 些級(jí)分進(jìn)行分析，W便確定級(jí)分中的單體、聚集物、和高甘露糖5糖型的改變。作為對(duì)照運(yùn) 行，用mAb7. 159. 2作為加載物進(jìn)行一步洗脫運(yùn)行，并且使用20mM巧樣酸鋼、39mM氯化鋼、 pH5. 4洗脫產(chǎn)物。
[0077] 使用mAb7. 159. 2進(jìn)行制備規(guī)模尺寸排阻色譜（SEC)，W便通過寡糖分析分離和 表征聚集物和單體。還用分析離子交換色譜QEC)和唾液酸測(cè)定分析來自mAb7. 159. 2LGE 運(yùn)行的級(jí)分。
[0078] 來自具有步驟洗脫的對(duì)照運(yùn)行的POROS'tHS50(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems)，卡爾斯己德（Carlsbad),加利福尼亞州）級(jí)分的分析示出，與在洗脫中相比， 在剝離中高甘露糖5糖型的濃度大了約五倍（圖3)，表明在該剝離期間已經(jīng)除去高甘露糖 5糖型。來自LGE運(yùn)行的mAb7. 159. 2級(jí)分的HPSEC和寡糖曲線分析證實(shí)，高甘露糖5糖型 洗脫在梯度的更晚級(jí)分中（圖4)。
[0079] 用對(duì)照461(1肖61)和對(duì)照462(1肖61)進(jìn)行11；6運(yùn)行，運(yùn)兩個(gè)對(duì)照分別包含33%和 2 %的高甘露糖糖型。如在圖5中示出，對(duì)照Ab1的寡糖曲線分析指示不存在高甘露糖5糖 型的分離。對(duì)照Ab2也示出類似曲線（數(shù)據(jù)未示出），因此，表明初始高甘露糖5糖型含量 并不影響在離子交換色譜步驟期間的它的除去。
[0080] 為了測(cè)試是否僅用IgG2抗體觀察到高甘露糖5糖型的除去，用對(duì)照Ab3 (IgG2)進(jìn) 行LGE運(yùn)行。如在圖6中示出，用對(duì)照Ab3運(yùn)行并未導(dǎo)致高甘露糖5糖型的除去，指示運(yùn)一 行為并不是IgG2抗體的特定特性。
[008。mAb7. 159. 2LGE級(jí)分的分析示出，存在伴隨高甘露糖5糖型的增加的聚集物中的 相應(yīng)增加，表明高甘露糖5糖型除去可能與聚集物除去相關(guān)。進(jìn)行SEC來分離聚集物和單 體。寡糖分析示出，在單體和聚集物中的高甘露糖5糖型水平分別是2. 9%和2. 3%，指示 聚集物的和高甘露糖5糖型的除去是非關(guān)聯(lián)的。
[0082] 不旨在受任何理論束縛，顯現(xiàn)在離子交換色譜期間mAb7. 159. 2高甘露糖5糖型 的除去可能是由于抗體分子上的電荷差異（圖7)。包含F(xiàn)ab區(qū)中的唾液酸的更成熟的糖 型是相對(duì)更酸性的并且在洗脫的早期級(jí)分中被除去。更少Fab唾液酸化的并且因此更不成 熟的并且更堿性的糖型在洗脫的更晚級(jí)分中被除去。在對(duì)照Abl、對(duì)照Ab2