專利名稱：一種人氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、其編碼序列、制法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及一種人N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hNAT-1)的cDNA序列，本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)主要由A、ASC、B、GLY、IMINO、L、N、PHE和X等系統(tǒng)完成(physiological reviews Vol.78 No.4 October 1998，pp.969-1054)。
其中，N系統(tǒng)還有三個(gè)亞型在肝臟中作用的N型、在骨骼肌中作用的Nm和在神經(jīng)系統(tǒng)中作用的Nb。所有這些亞型在轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸和精氨酸是都表現(xiàn)為鈉離子依賴性。肝臟中的N系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白在用鋰離子代替鈉離子的條件下將會(huì)表現(xiàn)出更好的活性(J.Biol.Chem.，Vol.275，Issue 31，23707-23717)。
N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體對于尿素循環(huán)和肝臟中新合成的谷氨酸輸出都有重要作用。這些轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)可以通過組氨酸阻斷。此外，N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)在腦組織中的研究表明，它可能參與血腦屏障的作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97，Issue 7，3230-3235)。
Gu S等人分離并鑒定了一個(gè)編碼小鼠膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的cDNA。該cDNA推測得到的多肽由505個(gè)高度疏水的氨基酸殘基組成，所形成的蛋白有9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，將氨基末端置于細(xì)胞質(zhì)中而將羧基末端定位于細(xì)胞表面。該轉(zhuǎn)運(yùn)體主要在肝臟中表達(dá)，在腎、腦、心臟中也有表達(dá)。在肝臟中，它主要定位在細(xì)胞的質(zhì)膜上，在重要的血管附近表達(dá)量較高，然后順著其通向次要血管的方向逐步遞減，這表達(dá)譜顯示它在肝細(xì)胞生理學(xué)上可能起到很重要的作用(Proc Natl Acad Sci USA2000 Mar 28；97(7)3230-5)。
Nakanishi T等人從大鼠的腦組織中又克隆出了N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的第二個(gè)亞型，并稱之為SN2(Am J Physiol Cell Physiol 2001 Dec；281(6)C1757-68)。
然而，到目前為止，本發(fā)明的hNAT-1尚未有人報(bào)道。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種蛋白，該蛋白被命名為人氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(hNAT-1)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的hNAT-1蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種hNAT-1核酸序列和蛋白的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人hNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸117-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸117-1487位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸117-1487位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的hNAT-1蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有hNAT-1蛋白活性的多肽的方法，該方法包括
(a)將編碼具有hNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hNAT-1蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸117-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hNAT-1蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hNAT-1蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hNAT-1蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為1516個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于117-1487位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hNAT-1蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有HNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中117-1487位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框117-1487位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中117-1487位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸117-1487位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸117-1487位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人HNAT-1相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hNAT-1蛋白多肽”指具有hNAT-1蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人hNAT-1相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括hNAT-1蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與hNAT-1 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hNAT-1多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含hNAT-1多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了hNAT-1多肽的可溶性片段。通常，該片段具有hNAT-1多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供hNAT-1蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然hNAT-1多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括hNAT-1多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)hNAT-1的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有hNAT-1多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼hNAT-1的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測hNAT-1核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于hNAT-1多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對hNAT-1 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于hNAT-1基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與hNAT-1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制hNAT-1蛋白的分子，也包括那些并不影響hNAT-1蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的hNAT-1基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的hNAT-1基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)hNAT-1或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷hNAT-1功能的抗體以及不影響hNAT-1功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用hNAT-1基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與hNAT-1基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
在本發(fā)明中，人hNAT-1的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人睪丸λgt10cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物A1GTACGGAATG CCGGAAGGGC CGG；B1 C TTCCAGATTT CAAATGTTAC AG為正向引物；A2CACAGTATAT GGGCAATATT GAG；B2 TTCTTGTAAGAAGTAG GAAAATA為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、64℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到的PCR片斷，大小分別為約九百和七百個(gè)堿基對的片段及雜質(zhì)。去除雜質(zhì)，用NcoI分別酶切上述兩個(gè)片段，然后連接，得到目的片段。將核苷酸序列裝入載體，導(dǎo)入宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞就可表達(dá)出相應(yīng)蛋白，經(jīng)過分離純化就將得到本發(fā)明的hNAT-1蛋白。
本發(fā)明的hNAT-1蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST軟件進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特征序列，而且與其他物種的N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有一定的相似性。
本發(fā)明的hNAT-1蛋白與其他物種的N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體都有一定的相似性。N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體對于尿素循環(huán)和肝臟中新合成的谷氨酸輸出都有重要作用。這些轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)可以通過組氨酸阻斷。此外，N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)在腦組織中的研究表明，它可能參與血腦屏障的作用。該類轉(zhuǎn)運(yùn)體主要在肝臟中表達(dá)，在腎、腦、心臟中也有表達(dá)。在肝臟中，它定位在重要血管周圍肝細(xì)胞的細(xì)胞膜上，表達(dá)量隨著血管漸漸分支為小血管而下降，這暗示這類轉(zhuǎn)運(yùn)體在肝臟中可能有重要的生理作用。
綜上所述，本發(fā)明的hNAT-1具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特征序列，而且與其他物種的N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有一定的相似性，可對氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)起到調(diào)控作用，從而對細(xì)胞的營養(yǎng)乃至整個(gè)生物體的生理活動(dòng)，尤其是對肝細(xì)胞生理活動(dòng)起到調(diào)控作用。這些生理作用包括激素的分泌，細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡，細(xì)胞間的相互作用等等。
將本發(fā)明的hNAT-1核酸、其反義鏈及片段制成探針，可檢測hNAT-1基因異常；將hNAT-1蛋白序列制成試劑盒或藥物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長增殖分化，促進(jìn)組織切除乃至器官摘除后的傷口愈合。將本發(fā)明的hNAT-1核酸反義鏈或hNAT-1抗體制成試劑盒可用于減輕或輔助治療由于hNAT-1表達(dá)量過高而導(dǎo)致的疾病，也可輔助臨床上腫瘤和癌癥的診斷，預(yù)防及治療。此外，本發(fā)明hNAT-1還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白，例如可將本發(fā)明hNAT-1的N端與鼠TF的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。針對本發(fā)明hNAT-1的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜瞿康钠闻cpGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后獲得全長cDNA序列，共1516bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于117-1487位核苷酸。
根據(jù)得到的全長cDNA序列推導(dǎo)出hNAT-1的氨基酸序列，共456個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
實(shí)施例2hNAT-1在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼hNAT-1的cDNA序列，用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hNAT-1 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’GGAG GGATCCATGG AGGCGTCCTG GGGGA，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的hNAT-1的部分編碼序列；3′端引物序列為5’ATTT CTGCAGTTTA TTAATCCAAT CAAAA，該引物含有PstI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和hNAT-1的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和PstI消化pQE-9載體和插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用NcoI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗(yàn)證hNAT-1的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的hNAT-1。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫hNAT-1?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘呤褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白，純化后的蛋白可以結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對含PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實(shí)施例3hNAT-1在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼hNAT-1的cDNA序列下列寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hNAT-1 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-GGAG GGATCCATGG AGGCGTCCTG GGGGA該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的hNAT-1的部分編碼序列；3′端引物序列為5’-ATTT CTGCAGTTTA TTAATCCAAT CAAAA該引物含有PstI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和hNAT-1的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用BamHI及PstI消化pcDNA3載體和插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用NcoI酶切鑒定插入片段大小及方向，并測序驗(yàn)證hNAT-1的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
此外，用常規(guī)方法對表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實(shí)施例4同源比較用實(shí)施例2和實(shí)施例3得到的hNAT-1蛋白(SEQ ID NO.2)本發(fā)明的hNAT-1蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST軟件進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特征序列，而且與其他物種的N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有一定的相似性。
本發(fā)明的hNAT-1的蛋白序列中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特征序列為GVSFGLSVFNLMNAIMGSGILGLAYVMANTGVFGFSFLLLTVALLASYSVHLLLSMCIQTAVTSYEDLGLFAFGLPGKLVVAGTIIIQNIGAMSSYLLIIKTELPAAIAEFLTGDYSRYWYLDGQTLLIIICVGIVFPLALLPKIGFLGYTSSLSFFFMMFFALVVIIKKWSIPCPLTLNYVEKGFQISNVTDDCKPKLFHFSKESAYALPTMAFSFLCHTSILPIYCELQSPSKKRMQNVTNTAIALSFLIYFISALFGYLTFYDKVESELLKGYSKYLSHDVVVMTVKLCILFAVLLTVPLIHFPARKAVTMMFFSNFPFSWIRHFLITLALNIIIVLLAIYVPDIRNVFGVVGASTSTCLIFIFPGLFYLKLSREDFLSWKKLGAFVLLIFGILVGNFSLALIIFDWIN(SEQ ID NO 2中43-455)。
本發(fā)明的hNAT-1蛋白與其他物種的N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體都有一定的相似性。N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體對于尿素循環(huán)和肝臟中新合成的谷氨酸輸出都有重要作用。這些轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)可以通過組氨酸阻斷。此外，N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)在腦組織中的研究表明，它可能參與血腦屏障的作用。該類轉(zhuǎn)運(yùn)體主要在肝臟中表達(dá)，在腎、腦、心臟中也有表達(dá)。在肝臟中，它定位在重要血管周圍肝細(xì)胞的細(xì)胞膜上，表達(dá)量隨著血管漸漸分支為小血管而下降，這暗示這類轉(zhuǎn)運(yùn)體在肝臟中可能有重要的生理作用。
綜上所述，本發(fā)明的hNAT-1具有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特征序列，而且與其他物種的N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有一定的相似性，可對氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)起到調(diào)控作用，從而對細(xì)胞的營養(yǎng)乃至整個(gè)生物體的生理活動(dòng)，尤其是對肝細(xì)胞生理活動(dòng)起到調(diào)控作用。這些生理作用包括激素的分泌，細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡，細(xì)胞間的相互作用等等。
將本發(fā)明的hNAT-1核酸、其反義鏈及片段制成探針，可檢測hNAT-1基因異常；將hNAT-1蛋白序列制成試劑盒或藥物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長增殖分化，促進(jìn)組織切除乃至器官摘除后的傷口愈合。將本發(fā)明的hNAT-1核酸反義鏈或hNAT-1抗體制成試劑盒可用于減輕或輔助治療由于hNAT-1表達(dá)量過高而導(dǎo)致的疾病，也可輔助臨床上腫瘤和癌癥的診斷，預(yù)防及治療。此外，本發(fā)明hNAT-1還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白，例如可將本發(fā)明hNAT-1的N端與鼠TF的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。針對本發(fā)明hNAT-1的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
本發(fā)明的hNAT-1除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明hNAT-1還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白，例如可將本發(fā)明hNAT-1的N端與鼠CKR的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明hNAT-1的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例2或3獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀hNAT-1基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
實(shí)例6作為微矩陣的底物微矩陣，又稱為DNA芯片。通過使用一些著名的生物軟件(如LASERGENESOFTWARE(DNASTAR)，來選擇將hNAT-1全長cDNA、EST、或基因片段作為微矩陣的底物樣品。然后通過使用噴墨技術(shù)及一系列化學(xué)方法如射線、化學(xué)、熱力學(xué)、機(jī)械方法等把樣品固定在載體上，如玻璃上，得到芯片(Schena，M.et al.(1995)Science 270467-470；and Shalon，D.et al.(1996)Genome Res.6639-645.)，形成的元件有點(diǎn)狀、條形等等。一塊典型的芯片通常含有一定數(shù)量的元件。雜交反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的探針，然后用掃描儀來檢測發(fā)生雜交反應(yīng)的元件及反應(yīng)的程度。探針與每一個(gè)芯片元件的互補(bǔ)性和結(jié)合量都可通過對掃描出的圖像的分析來判斷。
雜交結(jié)果可用于檢測出hNAT-1基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象，理解由于hNAT-1表達(dá)不正常引起的疾病的分子基礎(chǔ)，并可改進(jìn)及監(jiān)測相關(guān)藥劑的活性。
實(shí)施例7試劑盒的制備試劑盒1它含有(1)特異性擴(kuò)增hNAT-1的引物對和使用說明。該試劑盒還可含有或不含有將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的所需試劑。其中，該特異性引物的序列衍生自SEQ ID NO1的序列。對逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以檢測樣品中是否含有hNAT-1的核酸序列。該試劑盒還可含有進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的其他試劑，例如緩沖液等。
此外，較佳地，至少一個(gè)所用的引物跨越了兩個(gè)外顯子，因?yàn)榇藭r(shí)對應(yīng)于hNAT-1的基因組序列將不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。
試劑盒2該試劑盒含有針對hNAT-1的特異性的抗體(例如實(shí)施例5中制備的多克隆抗體，或者用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗hNAT-1的單克隆抗體)，和使用說明。該試劑盒用于直接檢測樣品中是否存在或缺失hNAT-1蛋白。先通過特異性免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，然后用常規(guī)技術(shù)檢測免疫復(fù)合物。
試劑盒3該試劑盒含有可特異性地與hNAT-1的mRNA雜交的探針。它還可含有或不含有雜交緩沖液。該試劑盒通過核酸分子與hNAT-1特異性探針之間的雜交反應(yīng)來檢測樣品中是否存在hNAT-1的核酸分子。
試劑盒也可用于檢測出基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象，并檢測出一系列與本發(fā)明的hNAT-1相關(guān)的基因，從而對相關(guān)疾病的診斷、治療起輔助作用。
實(shí)例8制成藥物本發(fā)明的hNAT-1蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等可作為藥物，可促進(jìn)燙傷燒傷、組織切除乃至器官摘除后的傷口愈合，防止傷口感染。將本發(fā)明的hNAT-1核酸反義鏈或hNAT-1抗體制成試劑盒可用于減輕或輔助治療由于hNAT-1表達(dá)量過高而導(dǎo)致的疾病，也可輔助臨床上腫瘤和癌癥的診斷，預(yù)防及治療。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
此外，本發(fā)明hNAT-1核酸(編碼序列或反義序列)可以直接引入細(xì)胞，以提高h(yuǎn)NAT-1的表達(dá)水平或者抑制hNAT-1的過度表達(dá)。本發(fā)明的hNAT-1蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因hNAT-1缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
當(dāng)本發(fā)明的hNAT-1蛋白多肽被用作藥物時(shí)，治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
序列表<210>1<211>1516<212>核苷酸<213>人類<220><221>編碼序列<222>(117)..(1487)<223><400>1gtacggaatg ccggaagggc cgggctcaaa gctccgcctc tggcgcgacc gacgactgga60gcgcagggca ggggtagagg ctcgtagatg gaactggtag tcagctggag agcagc atg119Met1gag gcg tcc tgg ggg agc ttc aac gct gag cgg ggc tgg tat gtc tct 167Glu Ala Ser Trp Gly Ser Phe Asn Ala Glu Arg Gly Trp Tyr Val Ser5 10 15gtc cag cag cct gaa gaa gcg gag gcc gaa gag ttg agt ccg ttg cta 215Val Gln Gln Pro Glu Glu Ala Glu Ala Glu Glu Leu Ser Pro Leu Leu20 25 30agc aac gaa ctt cac aga cag cga tcc cca ggt gtt tca ttt ggt tta 263Ser Asn Glu Leu His Arg Gln Arg Ser Pro Gly Val Ser Phe Gly Leu35 40 45tca gtg ttt aat ttg atg aat gcc atc atg gga agt ggc atc ctt ggc 311Ser Val Phe Asn Leu Met Asn Ala Ile Met Gly Ser Gly Ile Leu Gly50 55 60 65tta gct tat gtt atg gct aat acc ggt gtc ttt gga ttt agc ttc ttg 359Leu Ala Tyr Val Met Ala Asn Thr Gly Val Phe Gly Phe Ser Phe Leu70 75 80ctg ctg aca gtt gct ctc ctg gct tct tac tca gtc cat ctt ctg ctt 407Leu Leu Thr Val Ala Leu Leu Ala Ser Tyr Ser Val His Leu Leu Leu85 90 95agt atg tgt att cag aca gct gta aca tct tat gaa gat ctt gga ctc 455Ser Met Cys Ile Gln Thr Ala Val Thr Ser Tyr Glu Asp Leu Gly Leu100 105 110ttt gca ttt gga tta cct gga aag ttg gtg gtg gca ggc acc ata ata 503Phe Ala Phe Gly Leu Pro Gly Lys Leu Val Val Ala Gly Thr Ile Ile115 120 125att cag aat att gga gct atg tca tct tat ctt tta att att aaa aca 551Ile Gln Asn Ile Gly Ala Met Ser Ser Tyr Leu Leu Ile Ile Lys Thr130 135 140 145gag ctt cct gct gct att gca gaa ttt ttg act gga gac tat agt aga 599Glu Leu Pro Ala Ala Ile Ala Glu Phe Leu Thr Gly Asp Tyr Ser Arg150 155 160tat tgg tat ctt gat gga caa aca cta cta ata atc ata tgt gtt ggc 647Tyr Trp Tyr Leu Asp Gly Gln Thr Leu Leu Ile Ile Ile Cys Val Gly165 170 175att gtg ttc cct ctt gca ctt ctt ccc aaa ata ggc ttt ctt ggc tac 695Ile Val Phe Pro Leu Ala Leu Leu Pro Lys Ile Gly Phe Leu Gly Tyr180 185 190aca agt agt tta tca ttt ttc ttt atg atg ttc ttt gct ctt gtg gta 743Thr Ser Ser Leu Ser Phe Phe Phe Met Met Phe Phe Ala Leu Val Val195 200 205ata att aaa aaa tgg tcc atc cct tgt cct ctg aca tta aat tat gta 791Ile Ile Lys Lys Trp Ser Ile Pro Cys Pro Leu Thr Leu Asn Tyr Val210 215 220 225gag aaa ggc ttc cag att tca aat gtt aca gat gat tgt aag cca aag 839Glu Lys Gly Phe Gln Ile Ser Asn Val Thr Asp Asp Cys Lys Pro Lys230 235 240ctc ttt cat ttc tcc aaa gag agt gct tat gcc tta cca acc atg gct 887Leu Phe His Phe Ser Lys Glu Ser Ala Tyr Ala Leu Pro Thr Met Ala245 250 255ttt tca ttt ctc tgc cat acc tca ata ttg ccc ata tac tgt gaa ctt 935Phe Ser Phe Leu Cys His Thr Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Cys Glu Leu260 265 270caa agt cct tca aag aaa aga atg cag aat gtt acc aat aca gca att 983Gln Ser Pro Ser Lys Lys Arg Met Gln Asn Val Thr Asn Thr Ala Ile275 280 285gct tta agt ttt ctc att tat ttt ata tct gca ctc ttt ggg tac ctc 1031Ala Leu Ser Phe Leu Ile Tyr Phe Ile Ser Ala Leu Phe Gly Tyr Leu290 295 300 305act ttt tat gac aaa gtg gag tca gaa tta cta aaa ggt tat agt aaa 1079Thr Phe Tyr Asp Lys Val Glu Ser Glu Leu Leu Lys Gly Tyr Ser Lys310 315 320tac tta tca cat gat gtt gtt gtc atg act gtg aag tta tgc ata cta 1127Tyr Leu Ser His Asp Val Val Val Met Thr Val Lys Leu Cys Ile Leu325 330 335ttt gct gtg ctt ttg aca gtc cct cta atc cac ttc cct gcc aga aaa 1175Phe Ala Val Leu Leu Thr Val Pro Leu Ile His Phe Pro Ala Arg Lys340 345 350gct gta aca atg atg ttt ttc tcc aat ttt cca ttc tca tgg att cgc 1223Ala Val Thr Met Met Phe Phe Ser Asn Phe Pro Phe Ser Trp Ile Arg355 360 365cat ttt ttg atc act cta gca ctc aat att atc atc gtt tta ctt gca 1271His Phe Leu Ile Thr Leu Ala Leu Asn Ile Ile Ile Val Leu Leu Ala370 375 380 385ata tat gtt cct gac att aga aat gta ttt ggt gta gtt ggt gcc agt 1319Ile Tyr Val Pro Asp Ile Arg Asn Val Phe Gly Val Val Gly Ala Ser390 395 400aca tca aca tgt ttg att ttt ata ttc cca gga cta ttt tat ctt aaa1367Thr Ser Thr Cys Leu Ile Phe Ile Phe Pro Gly Leu Phe Tyr Leu Lys405 410 415ctt agc aga gag gat ttt ctg tca tgg aaa aag ctt ggg gca ttc gtt1415Leu Ser Arg Glu Asp Phe Leu Ser Trp Lys Lys Leu Gly Ala Phe Val420 425 430ttg ctc atc ttt gga att ttg gtt ggg aat ttt agt tta gca ctc atc1463Leu Leu Ile Phe Gly Ile Leu Val Gly Asn Phe Ser Leu Ala Leu Ile435 440 445att ttt gat tgg att aat aaa taa aagaaatatt ttcctacttc ttacaagaa1516Ile Phe Asp Trp Ile Asn Lys450 455<210>2<211>456<212>氨基酸<213>人類<400>2Met Glu Ala Ser Trp Gly Ser Phe Asn Ala Glu Arg Gly Trp Tyr Val1 5 10 15Ser Val Gln Gln Pro Glu Glu Ala Glu Ala Glu Glu Leu Ser Pro Leu
20 25 30Leu Ser Asn Glu Leu His Arg Gln Arg Ser Pro Gly Val Ser Phe Gly35 40 45Leu Ser Val Phe Asn Leu Met Asn Ala Ile Met Gly Ser Gly Ile Leu50 55 60Gly Leu Ala Tyr Val Met Ala Asn Thr Gly Val Phe Gly Phe Ser Phe65 70 75 80Leu Leu Leu Thr Val Ala Leu Leu Ala Ser Tyr Ser Val His Leu Leu85 90 95Leu Ser Met Cys Ile Gln Thr Ala Val Thr Ser Tyr Glu Asp Leu Gly100 105 110Leu Phe Ala Phe Gly Leu Pro Gly Lys Leu Val Val Ala Gly Thr Ile115 120 125Ile Ile Gln Asn Ile Gly Ala Met Ser Ser Tyr Leu Leu Ile Ile Lys130 135 140Thr Glu Leu Pro Ala Ala Ile Ala Glu Phe Leu Thr Gly Asp Tyr Ser145 150 155 160Arg Tyr Trp Tyr Leu Asp Gly Gln Thr Leu Leu Ile Ile Ile Cys Val165 170 175Gly Ile Val Phe Pro Leu Ala Leu Leu Pro Lys Ile Gly Phe Leu Gly180 185 190Tyr Thr Ser Ser Leu Ser Phe Phe Phe Met Met Phe Phe Ala Leu Val195 200 205Val Ile Ile Lys Lys Trp Ser Ile Pro Cys Pro Leu Thr Leu Asn Tyr210 215 220Val Glu Lys Gly Phe Gln Ile Ser Asn Val Thr Asp Asp Cys Lys Pro225 230 235 240Lys Leu Phe His Phe Ser Lys Glu Ser Ala Tyr Ala Leu Pro Thr Met245 250 255Ala Phe Ser Phe Leu Cys His Thr Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Cys Glu
260 265 270Leu Gln Ser Pro Ser Lys Lys Arg Met Gln Asn Val Thr Asn Thr Ala275 280 285Ile Ala Leu Ser Phe Leu Ile Tyr Phe Ile Ser Ala Leu Phe Gly Tyr290 295 300Leu Thr Phe Tyr Asp Lys Val Glu Ser Glu Leu Leu Lys Gly Tyr Ser305 310 315 320Lys Tyr Leu Ser His Asp Val Val Val Met Thr Val Lys Leu Cys Ile325 330 335Leu Phe Ala Val Leu Leu Thr Val Pro Leu Ile His Phe Pro Ala Arg340 345 350Lys Ala Val Thr Met Met Phe Phe Ser Asn Phe Pro Phe Ser Trp Ile355 360 365Arg His Phe Leu Ile Thr Leu Ala Leu Ash Ile Ile Ile Val Leu Leu370 375 380Ala Ile Tyr Val Pro Asp Ile Arg Asn Val Phe Gly Val Val Gly Ala385 390 395 400Ser Thr Ser Thr Cys Leu Ile Phe Ile Phe Pro Gly Leu Phe Tyr Leu405 410 415Lys Leu Ser Arg Glu Asp Phe Leu Ser Trp Lys Lys Leu Gly Ala Phe420 425 430Val Leu Leu Ile Phe Gly Ile Leu Val Gly Asn Phe Ser Leu Ala Leu435 440 445Ile Ile Phe Asp Trp Ile Asn Lys45045權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸117-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列是SEQ ID NO.1中核苷酸117-1487位的序列。
4.一種分離的hNAT-1蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有hNAT-1蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有hNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hNAT-1蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸117-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hNAT-1蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hNAT-1蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hNAT-1蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸117-1487位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的hNAT-1蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸
15.一種試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子。
16.一種試劑盒，其特征在于，它含有權(quán)利要求12所述的抗體。
17.一種權(quán)利要求1所述DNA分子的應(yīng)用，其特征在于，它作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)或者用制造基因芯片；或者用于制備藥物以預(yù)防、診斷或治療由于hNAT-1編碼基因異常而引起的疾病。
18.一種權(quán)利要求4所述蛋白多肽的應(yīng)用，其特征在于，它應(yīng)用與篩選人氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的激動(dòng)劑或抑制劑；或者用于制備藥物以預(yù)防、診斷或治療由于hNAT-1表達(dá)異常而引起的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明提供了一種人N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(human N system amino acids transporter，hNAT－1)、其編碼序列、制法及用途。本發(fā)明的hNAT－1具有跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的特征序列并與已發(fā)現(xiàn)的N系統(tǒng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似。將本發(fā)明的hNAT－1核酸、其反義鏈或片段制成探針，可檢測hNAT－1基因異常；將hNAT－1蛋白或其抑制劑制成藥物或試劑盒，可對氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)起到調(diào)控作用，從而對細(xì)胞的營養(yǎng)乃至整個(gè)生物體的生理活動(dòng)，尤其是對肝細(xì)胞生理活動(dòng)起到調(diào)控作用。
文檔編號C07K14/435GK1401770SQ0213729
公開日2003年3月12日 申請日期2002年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月29日
發(fā)明者余龍, 唐麗莎, 郭金虎 申請人:復(fù)旦大學(xué)