本發(fā)明屬于卷煙主流煙氣中重要化學成分分析的
技術領域：
，涉及一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，具體涉及一種采用多維液相色譜與質譜聯用技術分析卷煙煙氣中亞硝胺類化合物釋放量的方法。
背景技術：
：煙草特有亞硝胺(TSNAs，Tobacco-SpecificNitrosamines)是發(fā)現僅存在于煙草和煙氣中的非揮發(fā)性亞硝胺。一般認為，煙草特有亞硝胺是在煙草調制過程中通過煙草生物堿硝化作用形成的。煙草特有亞硝胺(TSNAs)主要包括是4-(N-甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基降煙堿(NNN)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙堿(NAT)，其結構如下式。其中，NNN和NNK被國際癌癥研究署(IARC)認定為一類致癌物，而NAB和NAT被證實對動物有致癌性。由于卷煙煙氣有超過五千種成分且組成復雜，目前主流的方法主要有高效氣相色譜-熱能分析(GC-TEA)法和液相色譜質譜聯用法(LC-MS)。但是，GC-TEA法存在前處理步驟煩瑣、樣品分析時間長、檢測靈敏度較低等缺點，而LC-MS法有基質干擾嚴重，方法的靈敏度、檢測限較低等問題。多維液相色譜(MDLC)，即將樣品在第一根液相色譜柱的洗脫液依次注入后面的色譜柱進行分離的液相色譜聯用技術，其與質譜(MS)聯用是目前對復雜樣品分離分析最受重視的手段之一，因此對于卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的測定方法有必要進行進一步的探討和研究。技術實現要素：鑒于以上所述現有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，用于解決現有技術中缺乏高準確度、重現性好、檢測限低、二次分離后樣品不易污染質譜離子源，適應于樣品批量檢測的卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法的問題。為實現上述目的及其他相關目的，本發(fā)明提供一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，對卷煙煙氣進行樣品前處理，采用多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)對前處理所得待測樣品進行定性定量分析，所述多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)包括依次連接的第一維液相色譜裝置、第二維液相色譜裝置、質譜裝置。較佳地，所述卷煙煙氣中亞硝胺包括有N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、4-(甲基亞硝基氨基)-l-(3-比啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙草堿(NAT)。較佳地，所述樣品前處理包括以下步驟：1)選取卷煙煙支，點燃后采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣；2)將濾片進行超聲萃取后靜置、離心，取上清液過濾后，即得待測樣品。優(yōu)選地，在步驟1)中，所述濾片為劍橋濾片。所述劍橋濾片的直徑為44mm。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述濾片置于EP管中進行萃取。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述萃取溶液為0.05-0.2mol/L乙酸銨(NH4Ac)水溶液。更優(yōu)選地，所述萃取溶液為0.1mol/L乙酸銨(NH4Ac)水溶液。所述乙酸銨水溶液，通過稱取乙酸銨，用水完全溶解后，轉移至容量瓶中，加水定容得到。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述超聲萃取的時間為30-50min。更優(yōu)選地，所述超聲萃取的時間為40min。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述靜置時間為4-6min。更優(yōu)選地，所述靜置時間為5min。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述離心條件為：離心時間：4-6min；離心轉速：2700-3300rpm。更優(yōu)選地，所述離心條件為：離心時間：5min；離心轉速：3000rpm。優(yōu)選地，在步驟2)中，所述過濾的方式為水相濾膜過濾方式。更優(yōu)選地，所述水相濾膜的孔徑為0.22μm。較佳地，所述采用多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)對前處理所得待測樣品進行定性定量分析，包括以下步驟：A)配制標準樣品；A1)分別稱取NAB、NAT、NNN、NNK的標準品，加入甲醇定容，配成混合標準儲備溶液；優(yōu)選地，所述NAB、NAT、NNN、NNK的標準品的濃度均為0.5mg/ml。優(yōu)選地，所述混合標準儲備溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的濃度均為50μg/ml。A2)分別稱取d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK，加入甲醇定容，配成內標溶液；優(yōu)選地，所述內標溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為5μg/ml。優(yōu)選地，所述d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK為氘代試劑。具體的，所述d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK分別為氘代N-亞硝基去甲基煙堿、氘代N-亞硝基新煙草堿、氘代N-亞硝基假木賊堿、氘代4-(甲基亞硝基氨基)-l-(3-比啶基)-1-丁酮。所述d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK為商品化試劑，其化學性質穩(wěn)定，適于作為內標。A3)分別移取不同體積的步驟A1中混合標準儲備溶液，再分別加入一定體積的步驟A2中內標溶液，用甲醇定容配制為一系列不同濃度的混合標準溶液。優(yōu)選地，所述混合標準溶液的濃度為0-10ng/ml。優(yōu)選地，所述混合標準溶液內，d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為1ng/ml。B)樣品定性檢測：分別將步驟A)配制的標準樣品和經樣品前處理后待測樣品進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，通過第一維液相色譜裝置進行餾分后，由所述第二維液相色譜裝置進行分離，再由所述質譜裝置進行測定，比較保留時間、質譜掃描進行定性，確定待測樣品中4種亞硝胺成分；C)樣品定量檢測：分別將步驟A)配制的標準樣品和經樣品前處理后待測樣品進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，通過第一維液相色譜裝置進行餾分后，由所述第二維液相色譜裝置進行分離，再由所述質譜裝置進行測定，采用內標標準曲線法進行MRM定量，獲得待測樣品中4種亞硝胺成分的含量。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置進行餾分是將步驟A1配制的混合標準儲備溶液和經樣品前處理后待測樣品溶液通過第一維液相色譜裝置進行餾分。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第二維液相色譜裝置進行分離，再由所述質譜裝置進行測定是指將步驟A3配制的混合標準溶液與待測樣品的稀釋溶液通過第二維液相色譜裝置進行分離，再由所述質譜裝置進行測定。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置的色譜條件為：第一維液相色譜：正相液相色譜；色譜柱：強陽離子交換色譜柱(SCX)；檢測波長：220-240nm；柱溫：25-35℃；流速：0.5-1.5mL/min；進樣量：5-15μl；流動相A相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；流動相B相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+0.1-1.0mol/LKCl+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；梯度洗脫。更優(yōu)選地，所述第一維液相色譜裝置的色譜條件為：第一維液相色譜：WatersACQUITYUPLC；色譜柱：WatersSpherisorbS5SCX(4.6*150mm,5μm)；檢測波長：230nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min；進樣量：10μl；流動相A相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；流動相B相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+0.5mol/LKCl+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；梯度洗脫。上述百分比％為體積百分比。最優(yōu)選地，如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序為：0-5min，A相：B相體積比為100：0-90：10；5-5.1min，A相：B相體積比為90：10-60：40；5.1-15min，A相：B相體積比為60：40-0：100；15-15.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；15.1-40min，A相：B相體積比為100：0-100：0。表1第一維液相色譜裝置的梯度洗脫保留時間T(min)流動相A相流動相B相01000590105.1604015010015.11000401000優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第二維液相色譜裝置的條件為：第二維液相色譜：反相液相色譜(RPLC)；色譜柱：C18柱；柱溫：25-35℃；流速：0.2-0.3mL/min；進樣量：5-15μl；流動相A相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％H2O+2-8％CH3CN；流動相B相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％CH3CN+2-8％H2O；梯度洗脫。更優(yōu)選地，所述第二維液相色譜裝置的條件為：第二維液相色譜：AgilentTechnologies1260Infinity反相液相色譜(RPLC)；色譜柱：WatersCortecsC18(2.1*150mm,2.7μm)；柱溫：30℃；流速：0.25mL/min；進樣量：10μl；流動相A相：5mmol/LNH4Ac+95％H2O+5％CH3CN；流動相B相：5mmol/LNH4Ac+95％CH3CN+5％H2O；梯度洗脫。上述百分比％為體積百分比。最優(yōu)選地，如表2所示，所述梯度洗脫的具體程序為：0-10min，A相：B相體積比為100：0-100：0；10-20min，A相：B相體積比為100：0-0：100；20-22min，A相：B相體積比為0：100-0：100；22-22.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；22-25min，A相：B相體積比為100：0-100：0。表2第二維液相色譜裝置的梯度洗脫保留時間t/min流動相A相流動相B相0100010100020010022010022.11000251000優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述質譜裝置的條件為：質譜：三重四極桿質譜；電離方式：ESI；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；MRM條件：見表3；清洗進樣針程序：needlewash20-40s；質譜流路切換：從8-12min開始掃描，26-30min結束。更優(yōu)選地，所述質譜裝置的條件為：質譜：AgilentTechnologies6460TripleQuadMS三重四極桿質譜；電離方式：ESI；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；MRM條件：見表3；清洗進樣針程序：needlewash30s；質譜流路切換：從10min開始掃描，28min結束。表3MRM條件母離子(m/z)子離子(m/z)FragmentorCE(eV)NNK208.1122.1608NAB192.1162.1604NAT190.1160.1604NNN178.1148.1505優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置進行餾分后采用中心切割法，獲得4種亞硝胺成分的餾分。所述4種亞硝胺成分的餾分包括NNK、NNN、NAT、NAB餾分。所述中心切割法為多維色譜中常用的分離方法，在本發(fā)明的二維液相色譜中，即將第一維液相色譜分離出的目標物餾分的色譜峰的切割完整轉移至第二維液相色譜，其它非目標物餾分不進第二維液相色譜。更優(yōu)選地，所述4種亞硝胺成分的餾分是通過第二維液相色譜裝置分離，并經質譜裝置通過質譜檢測質荷比確定每個色譜峰對應的物質。所述4種亞硝胺成分的質荷比數值見表3。所述NNK餾分的母離子質荷比為208.1，字離子質荷比為122.1；所述NAB餾分的母離子質荷比為192.1，字離子質荷比為162.1；所述NAT餾分的母離子質荷比為190.1，字離子質荷比為160.1；所述NNN餾分的母離子質荷比為178.1，字離子質荷比為148.1。更優(yōu)選地，所述4種亞硝胺成分的餾分為編號為6、7、8、9、10、11的6個餾分。如表4所示，所述編號為6、7、8、9、10、11的6個餾分物質分別為：編號為6餾分物質為NNK；編號為7餾分物質為NNK；編號為8餾分物質為NNN；編號為9餾分物質為NNN；編號為10餾分物質為NAT；編號為11餾分物質為NAB。表4餾分物質餾分67891011物質NNKNNKNNNNNNNATNAB優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置與第二維液相色譜裝置之間還設有第二維捕集柱。更優(yōu)選地，所述第二維捕集柱的條件為：色譜柱：C18柱；流動相A相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；流動相B相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％H2O+2-8％CH3CN；梯度洗脫。進一步優(yōu)選地，所述第二維捕集柱的條件為：色譜柱：WatersCortecsC18柱(2.7μm,2.1×10mmi.d.)；流動相A相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；流動相B相：5mmol/LNH4Ac+95％H2O+5％CH3CN；梯度洗脫。上述百分比％為體積百分比。最優(yōu)選地，所述梯度洗脫的具體程序為：0-30min，A相：B相體積比為100：0-0：100。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第一維液相色譜裝置包括有依次連通的第一維液相色譜泵、進樣二位六通閥、第一維色譜柱、紫外檢測器。更優(yōu)選地，所述進樣二位六通閥設有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進樣口，所述第4接口經管線依次連通第5接口、第2接口、第3接口，由第3接口經管線連通第一維液相色譜泵的進樣端，所述第1接口經管線連通第一維液相色譜泵的出樣端，所述第6接口經管線連通第一維色譜柱，所述第1接口與第6接口相連通。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述第二維液相色譜裝置包括相連通的第二維液相色譜泵、第二維色譜柱。優(yōu)選地，所述步驟B)或C)中，所述多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)還包括有連通閥，所述連通閥分別與第一維液相色譜裝置中的紫外檢測器、第二維液相色譜裝置中的第二維液相色譜泵、第二維色譜柱相連通。更優(yōu)選地，所述連通閥為二位十通閥或二位六通閥。進一步優(yōu)選地，所述二位十通閥設有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第8接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經管線與紫外檢測器的出樣端相連通，所述第10接口經管線與第二維捕集柱的進樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經管線依次連通第9接口、第8接口、第5接口、第4接口、第二維色譜柱進樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經管線與質譜儀相連通。所述二位十通閥中將第8接口與第5接口短接后，即第9接口與第4接口直接連接，其結構與所述二位六通閥相同，但是預留第8接口、第5接口可以在需要兩個捕集柱切換時使用。進一步優(yōu)選地，所述二位六通閥設有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經管線與紫外檢測器的出樣端相連通，所述第10接口經管線與第二維捕集柱的進樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經管線依次連通第9接口、第4接口、第二維色譜柱進樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經管線與質譜儀相連通。最優(yōu)選地，采用多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)進行分析時，將待分析的樣品溶液由進樣二位六通閥的第4接口進入，樣品溶液依次通過第5接口、第2接口、第3接口，進入第一維液相色譜泵的進樣端，再由第一維液相色譜泵的出樣端經第1接口、第6接口進入第一維色譜柱，在第一維色譜柱中有效去除干擾物質后，通過紫外檢測器，進入連通閥，通過二位十通閥的第1接口經第10接口進入第二維捕集柱，再從第二維捕集柱的出樣端經第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第8接口、第5接口、第4接口進入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進入質譜儀進行測定。最優(yōu)選地，采用多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)進行分析時，將待分析的樣品溶液由進樣二位六通閥的第4接口進入，樣品溶液依次通過第5接口、第2接口、第3接口，進入第一維液相色譜泵的進樣端，再由第一維液相色譜泵的出樣端經第1接口、第6接口進入第一維色譜柱，在第一維色譜柱中有效去除干擾物質后，通過紫外檢測器，進入連通閥，通過二位六通閥的第1接口經第10接口進入第二維捕集柱，再從第二維捕集柱的出樣端經第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第4接口進入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進入質譜儀進行測定。優(yōu)選地，所述步驟C)中，所述內標標準曲線法包括以下步驟：所述內標標準曲線法是指在標準溶液中加入內標物質，進行儀器測定，獲得標準工作曲線，進而測定含有內標物質的實際樣品濃度的方法。ⅰ、將步驟A)的A3中一系列不同濃度的混合標準溶液分別進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，分別獲得4種亞硝胺成分/相應內標物的二級選擇離子峰面積比與4種亞硝胺成分/相應內標物的質量濃度比的線性關系，繪制相應的標準工作曲線，分別計算得到4種亞硝胺成分標準工作曲線的回歸方程。進一步的，所述標準曲線中，以4種亞硝胺成分與相應內標物的二級選擇離子峰面積比為縱坐標(Y軸)，其4種亞硝胺成分與相應內標物的質量濃度比為橫坐標(X軸)。ⅱ、將經樣品前處理后待測樣品溶液，進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，將獲得的待測液中4種亞硝胺成分/相應內標物的二級選擇離子峰面積比，代入步驟ⅰ中相應的4種亞硝胺成分標準工作曲線的回歸方程，并根據加入相應內標物的已知質量濃度，計算得到待測樣品溶液中4種亞硝胺成分的質量濃度。如上所述，本發(fā)明的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，將煙氣樣品經過提取后上樣，采用中心切割多維液相色譜法對第一維液相色譜(SCX)餾分進行分離切割，餾分進入第二維液相色譜分離后進入質譜檢測。該方法具有以下有益效果：(1)本發(fā)明提供的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，通過第一維液相色譜分離后中心切割，有效去除煙氣中影響亞硝胺準確定量的干擾物質，降低基質的干擾。(2)本發(fā)明提供的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，通過兩維液相色譜分離除雜，進入質譜樣品干擾離子大大減少，質譜離子源不易被污染。(3)本發(fā)明提供的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，通過兩維液相的分離大大提高液相色譜的峰容量和檢測通量，方法具有靈敏度高、通量高的優(yōu)點。(4)本發(fā)明提供的一種卷煙煙氣中亞硝胺釋放量的分析方法，簡便快捷，準確度高、重現性好、檢測限低，適應于樣品的批量檢測。附圖說明圖1顯示為本發(fā)明的對卷煙煙氣中亞硝胺分析的第一維SCX液相色譜圖，其中，6、7為NNK；8、9為NNN；10為NAT；11為NAB。圖2顯示為本發(fā)明的卷煙煙氣中亞硝胺類化合物NNK的標準曲線圖。圖3顯示為本發(fā)明的卷煙煙氣中亞硝胺類化合物NAB的標準曲線圖。圖4顯示為本發(fā)明的卷煙煙氣中亞硝胺類化合物NAT的標準曲線圖。圖5顯示為本發(fā)明的卷煙煙氣中亞硝胺類化合物NNN的標準曲線圖。圖6顯示為本發(fā)明的一種多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)的整體結構示意圖。圖中，1、第一維液相色譜泵，2、進樣二位六通閥，21、第1接口，22、第2接口，23、第3接口，24、第4接口，25、第5接口，26、第6接口，3、第一維色譜柱，4、紫外檢測器，5、第二維捕集柱，6、連通閥，61、第1接口，62、第2接口，63、第3接口，64、第4接口，65、第5接口，66、第8接口，67、第9接口，68、第10接口，7、第二維液相色譜泵，8、第二維色譜柱，9、質譜儀。具體實施方式下面結合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護范圍。以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。以下實施例中使用的試劑及實驗用具均為常規(guī)使用的試劑及實驗用具，均可從市場上購買獲得。以下實施例中使用儀器如下：第一維色譜裝置(WatersACQUITYUPLC系統(tǒng)，Waters公司)、第二維色譜裝置(AgilentTechnologies1260Infinity系統(tǒng)，Agilent公司)、質譜裝置(AgilentTechnologies6460TripleQuadLC/MS系統(tǒng)，Agilent公司)、第一維色譜柱(WatersSpherisorbS5SCX柱(5μm,4.6×150mmi.d.)，Waters公司)、第二維捕集柱(WatersCortecsC18柱(2.7μm,2.1×10mmi.d.)，Waters公司)、第二維色譜柱(WatersCortecsC18柱(2.7μm,2.1×150mmi.d.)，Waters公司)、紫外檢測器(WatersACQUITYUPLC系統(tǒng)，Waters公司)。實施例11、樣品前處理選取卷煙煙支，點燃后采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣，使煙氣吸附于劍橋濾片上。將劍橋濾片置于EP管中加入萃取溶液，置于超聲波發(fā)生器內進行超聲萃取30-50min，萃取溶液為0.05-0.2mol/LNH4Ac水溶液，NH4Ac水溶液是通過稱取乙酸銨，用水完全溶解后，轉移至容量瓶中，加水定容得到。萃取后靜置5±1min，取萃取液置于離心機上離心5±1min，離心轉速為3000±300rpm，然后取上清液經0.22μm水相濾膜過濾后，移至色譜分析瓶中，即得待測樣品溶液。2、標準溶液的配制分別移取10ml濃度為0.5mg/ml的NAB、NAT、NNN、NNK的標準品，置于100mL容量瓶中，加入甲醇定容，配成混合標準儲備溶液?；旌蠘藴蕛淙芤褐蠳AB、NAT、NNN、NNK的濃度均為50μg/ml。同時，分別移取一定體積的d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK內標物，加入甲醇定容，配成內標溶液，內標溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為5μg/ml。分別準確移取不同體積混合標準儲備溶液，置于多個100mL容量瓶中，再分別準確加入一定體積的內標溶液，用甲醇定容，配制為一系列混合標準溶液。配制的系列混合標準溶液濃度為0-10ng/ml，其中內標物濃度為1ng/ml。3、樣品含量的測定分別將2配制的標準溶液和1中待測樣品溶液分別進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，即將混合標準儲備溶液和待測樣品溶液通過第一維液相色譜裝置進行餾分后，再將混合標準溶液與待測樣品溶液的稀釋溶液由所述第二維液相色譜裝置進行分離，再由所述質譜裝置進行測定，比較保留時間、質譜掃描進行定性，確定待測液中4種亞硝胺成分；同時采用內標標準曲線法進行MRM定量，獲得待測液中4種亞硝胺成分的含量。具體來說，內標標準曲線法是先將上述2中一系列不同濃度的混合標準溶液分別進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，分別獲得4種亞硝胺成分/相應內標物的二級選擇離子峰面積比與4種亞硝胺成分/相應內標物的質量濃度比的線性關系，繪制相應的標準工作曲線，以4種亞硝胺成分與相應內標物的二級選擇離子峰面積比為縱坐標(Y軸)，其4種亞硝胺成分與相應內標物的質量濃度比為橫坐標(X軸)，分別計算得到4種亞硝胺成分標準工作曲線的回歸方程。再將上述1中待測液進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，將獲得的待測液中4種亞硝胺成分/相應內標物的二級選擇離子峰面積比，代入相應的4種亞硝胺成分標準工作曲線的回歸方程，并根據加入相應內標物的已知質量濃度，計算得到待測液中4種亞硝胺成分的質量濃度。其中，所述第一維液相色譜裝置的色譜條件為：第一維液相色譜：正相液相色譜；色譜柱：強陽離子交換色譜柱(SCX)；檢測波長：220-240nm；柱溫：25-35℃；流速：0.5-1.5mL/min；進樣量：5-15μl；流動相A相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；流動相B相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+0.1-1.0mol/LKCl+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；梯度洗脫。如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序為：0-5min，A相：B相體積比為100：0-90：10；5-5.1min，A相：B相體積比為90：10-60：40；5.1-15min，A相：B相體積比為60：40-0：100；15-15.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；15.1-40min，A相：B相體積比為100：0-100：0。第一維液相色譜裝置進行餾分，如圖1所示，將譜圖中六個峰分別收取餾分，從左到右依次編號6、7、8、9、10、11，從而獲得編號為6、7、8、9、10、11的6個餾分。再采用中心切割法，將第一維液相色譜分離出的目標物餾分的色譜峰的切割完整轉移至第二維液相色譜，其它非目標物餾分不進第二維液相色譜。所述第二維液相色譜裝置的條件為：第二維液相色譜：反相液相色譜(RPLC)；色譜柱：C18柱；柱溫：：25-35℃；流速：0.2-0.3mL/min；進樣量：5-15μl；流動相A相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％H2O+2-8％CH3CN；流動相B相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％CH3CN+2-8％H2O；梯度洗脫。如表3所示，所述梯度洗脫的具體程序為：0-10min，A相：B相體積比為100：0-100：0；10-20min，A相：B相體積比為100：0-0：100；20-22min，A相：B相體積比為0：100-0：100；22-22.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；22-25min，A相：B相體積比為100：0-100：0。所述質譜裝置的條件為：質譜：三重四極桿質譜；電離方式：ESI；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；MRM條件：見表4；清洗進樣針程序：needlewash20-40s；質譜流路切換：從8-12min開始掃描，26-30min結束。將經第一維液相色譜裝置餾分后獲得的編號為6、7、8、9、10、11的6個餾分稀釋后，通過第二維液相色譜裝置分離，并經質譜裝置通過質譜檢測質荷比確定每個色譜峰對應的物質。第一維液相色譜裝置中TSNAs出峰順序為NNK、NNK、NNN、NNN、NAT、NAB，第二維液相色譜裝置中TSNAs出峰順序為NNN、NNK、NAT、NAB。第一維液相色譜裝置與第二維液相色譜裝置之間還設有第二維捕集柱。所述第二維捕集柱的條件為：色譜柱：C18柱；流動相A相：5-15mmol/LKH2PO4+1-10mmol/LH3PO4+80-90％H2O+10-20％CH3CN(pH＝2-4)；流動相B相：1-10mmol/LNH4Ac+92-98％H2O+2-8％CH3CN；梯度洗脫。所述梯度洗脫的具體程序為：0-30min，A相：B相體積比為100：0-0：100。另外，本發(fā)明的多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)在具體測定時，如圖6所示，所述第一維液相色譜裝置包括有依次連通的第一維液相色譜泵、進樣二位六通閥、第一維色譜柱、紫外檢測器。如圖6所示，所述進樣二位六通閥設有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進樣口，所述第4接口經管線依次連通第5接口、第2接口、第3接口，由第3接口經管線連通第一維液相色譜泵的進樣端，所述第1接口經管線連通第一維液相色譜泵的出樣端，所述第6接口經管線連通第一維色譜柱，所述第1接口與第6接口相連通。如圖6所示，所述多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)還包括有連通閥，所述連通閥分別與第一維液相色譜裝置中的紫外檢測器、第二維液相色譜裝置中的第二維液相色譜泵、第二維色譜柱相連通。所述連通閥為二位十通閥或二位六通閥。所述二位十通閥設有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第8接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經管線與紫外檢測器的出樣端相連通，所述第10接口經管線與第二維捕集柱的進樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經管線依次連通第9接口、第8接口、第5接口、第4接口、第二維色譜柱進樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經管線與質譜儀相連通。所述二位六通閥設有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經管線與紫外檢測器的出樣端相連通，所述第10接口經管線與第二維捕集柱的進樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經管線依次連通第9接口、第4接口、第二維色譜柱進樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經管線與質譜儀相連通。采用多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)進行分析時，將待分析的樣品溶液由進樣二位六通閥的第4接口進入，樣品溶液依次通過第5接口、第2接口、第3接口，進入第一維液相色譜泵的進樣端，再由第一維液相色譜泵的出樣端經第1接口、第6接口進入第一維色譜柱，在第一維色譜柱中有效去除干擾物質后，通過紫外檢測器，進入連通閥，通過二位十通閥的第1接口經第10接口進入第二維捕集柱，再從第二維捕集柱的出樣端經第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第8接口、第5接口、第4接口進入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進入質譜儀進行測定；或者通過二位六通閥的第1接口經第10接口進入第二維捕集柱，再從第二維捕集柱的出樣端經第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第4接口進入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進入質譜儀進行測定。實施例21、樣品前處理選取卷煙煙支，點燃后采用濾片捕集方式捕集卷煙煙氣，使煙氣吸附于劍橋濾片上。將劍橋濾片置于50mlEP管中加入萃取溶液，置于超聲波發(fā)生器內進行超聲萃取40min，萃取溶液為50.0ml0.1mol/LNH4Ac水溶液，0.1mol/LNH4Ac水溶液是通過稱取3.85g乙酸銨，用水完全溶解后，轉移至500ml容量瓶中，加水定容得到。萃取后靜置5min，取2ml萃取液置于離心機上離心5min，離心轉速為3000rpm，然后取1ml上清液經0.22μm水相濾膜過濾后，移至色譜分析瓶中，即得待測樣品溶液。2、標準溶液的配制分別移取10ml濃度為0.5mg/ml的NAB、NAT、NNN、NNK的標準品，置于100mL容量瓶中，加入甲醇定容，配成混合標準儲備溶液。混合標準儲備溶液中NAB、NAT、NNN、NNK的濃度均為50μg/ml。同時，分別移取一定體積的d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK內標物，加入甲醇定容，配成內標溶液，內標溶液中d4-NNN、d4-NAT、d4-NAB、d4-NNK的濃度均為5μg/ml。分別準確移取不同體積混合標準儲備溶液，置于多個100mL容量瓶中，再分別準確加入一定體積的內標溶液，用甲醇定容，配制為一系列混合標準溶液。配制的系列混合標準溶液濃度為0-10ng/ml，其中內標物濃度為1ng/ml。3、樣品含量的測定分別將2配制的標準溶液和1中待測樣品溶液分別進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，即將混合標準儲備溶液和待測樣品溶液通過第一維液相色譜裝置進行餾分后，再將混合標準溶液與待測樣品溶液的稀釋溶液(編號6、7、8、9、10、11的餾分分別用CH3CN稀釋100倍，每個餾分均進樣10μL)由所述第二維液相色譜裝置進行分離，再由所述質譜裝置進行測定，比較保留時間、質譜掃描進行定性，確定待測液中4種亞硝胺成分；同時采用內標標準曲線法進行MRM定量，獲得待測液中4種亞硝胺成分的含量。具體來說，內標標準曲線法是先將上述2中一系列不同濃度的混合標準溶液分別進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，分別獲得4種亞硝胺成分/相應內標物的二級選擇離子峰面積比與4種亞硝胺成分/相應內標物的質量濃度比的線性關系，繪制相應的標準工作曲線，以4種亞硝胺成分與相應內標物的二級選擇離子峰面積比為縱坐標(Y軸)，其4種亞硝胺成分與相應內標物的質量濃度比為橫坐標(X軸)，分別計算得到4種亞硝胺成分標準工作曲線的回歸方程。再將上述1中待測液進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，將獲得的待測液中4種亞硝胺成分/相應內標物的二級選擇離子峰面積比，代入相應的4種亞硝胺成分標準工作曲線的回歸方程，并根據加入相應內標物的已知質量濃度，計算得到待測液中4種亞硝胺成分的質量濃度。其中，所述第一維液相色譜裝置的色譜條件為：第一維液相色譜：WatersACQUITYUPLC；色譜柱：WatersSpherisorbS5SCX(4.6*150mm,5μm)；檢測波長：230nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min；進樣量：10μl；流動相A相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；流動相B相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+0.5mol/LKCl+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；梯度洗脫。如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序為：0-5min，A相：B相體積比為100：0-90：10；5-5.1min，A相：B相體積比為90：10-60：40；5.1-15min，A相：B相體積比為60：40-0：100；15-15.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；15.1-40min，A相：B相體積比為100：0-100：0。第一維液相色譜裝置進行餾分，如圖1所示，將譜圖中六個峰分別收取餾分，從左到右依次編號6、7、8、9、10、11，從而獲得編號為6、7、8、9、10、11的6個餾分。再采用中心切割法，將第一維液相色譜分離出的目標物餾分的色譜峰的切割完整轉移至第二維液相色譜，其它非目標物餾分不進第二維液相色譜。所述第二維液相色譜裝置的條件為：第二維液相色譜：AgilentTechnologies1260Infinity反相液相色譜(RPLC)；色譜柱：WatersCortecsC18(2.1*150mm,2.7μm)；柱溫：30℃；流速：0.25mL/min；進樣量：10μl；流動相A相：5mmol/LNH4Ac+95％H2O+5％CH3CN；流動相B相：5mmol/LNH4Ac+95％CH3CN+5％H2O；梯度洗脫。如表3所示，所述梯度洗脫的具體程序為：0-10min，A相：B相體積比為100：0-100：0；10-20min，A相：B相體積比為100：0-0：100；20-22min，A相：B相體積比為0：100-0：100；22-22.1min，A相：B相體積比為0：100-100：0；22-25min，A相：B相體積比為100：0-100：0。所述質譜裝置的條件為：質譜：AgilentTechnologies6460TripleQuadMS；電離方式：ESI；掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)；MRM條件：見表4；清洗進樣針程序：needlewash30s；質譜流路切換：從10min開始掃描，28min結束。將經第一維液相色譜裝置餾分后獲得的編號為6、7、8、9、10、11的6個餾分稀釋后，通過第二維液相色譜裝置分離，并經質譜裝置通過質譜檢測質荷比確定每個色譜峰對應的物質。第一維液相色譜裝置中TSNAs出峰順序為NNK、NNK、NNN、NNN、NAT、NAB，第二維液相色譜裝置中TSNAs出峰順序為NNN、NNK、NAT、NAB。第一維液相色譜裝置與第二維液相色譜裝置之間還設有第二維捕集柱。所述第二維捕集柱的條件為：色譜柱：WatersCortecsC18柱(2.7μm,2.1×10mmi.d.)；流動相A相：10mmol/LKH2PO4+5mmol/LH3PO4+85％H2O+15％CH3CN(pH＝3)；流動相B相：5mmol/LNH4Ac+95％H2O+5％CH3CN；梯度洗脫。所述梯度洗脫的具體程序為：0-30min，A相：B相體積比為100：0-0：100。另外，本發(fā)明的多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)在具體測定時，如圖6所示，所述第一維液相色譜裝置包括有依次連通的第一維液相色譜泵、進樣二位六通閥、第一維色譜柱、紫外檢測器。如圖6所示，所述進樣二位六通閥設有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第6接口，所述第4接口為進樣口，所述第4接口經管線依次連通第5接口、第2接口、第3接口，由第3接口經管線連通第一維液相色譜泵的進樣端，所述第1接口經管線連通第一維液相色譜泵的出樣端，所述第6接口經管線連通第一維色譜柱，所述第1接口與第6接口相連通。如圖6所示，所述多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)還包括有連通閥，所述連通閥分別與第一維液相色譜裝置中的紫外檢測器、第二維液相色譜裝置中的第二維液相色譜泵、第二維色譜柱相連通。所述連通閥為二位十通閥或二位六通閥。所述二位十通閥設有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第5接口、第8接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經管線與紫外檢測器的出樣端相連通，所述第10接口經管線與第二維捕集柱的進樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經管線依次連通第9接口、第8接口、第5接口、第4接口、第二維色譜柱進樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經管線與質譜儀相連通。所述二位六通閥設有第1接口、第2接口、第3接口、第4接口、第9接口、第10接口，所述第1接口與第10接口相連通，所述第1接口經管線與紫外檢測器的出樣端相連通，所述第10接口經管線與第二維捕集柱的進樣端相連通，所述第二維捕集柱的出樣端經管線依次連通第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵的進樣端，所述第二維液相色譜泵的出樣端經管線依次連通第9接口、第4接口、第二維色譜柱進樣端，所述第二維色譜柱的出樣端經管線與質譜儀相連通。采用多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)進行分析時，將待分析的樣品溶液由進樣二位六通閥的第4接口進入，樣品溶液依次通過第5接口、第2接口、第3接口，進入第一維液相色譜泵的進樣端，再由第一維液相色譜泵的出樣端經第1接口、第6接口進入第一維色譜柱，在第一維色譜柱中有效去除干擾物質后，通過紫外檢測器，進入連通閥，通過二位十通閥的第1接口經第10接口進入第二維捕集柱，再從第二維捕集柱的出樣端經第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第8接口、第5接口、第4接口進入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進入質譜儀進行測定；或者通過二位六通閥的第1接口經第10接口進入第二維捕集柱，再從第二維捕集柱的出樣端經第3接口、第2接口、第二維液相色譜泵、第9接口、第4接口進入第二維色譜柱，在第二維色譜柱分離出TSNAs，進入質譜儀進行測定。實施例3如上述實施例2中2所示，分別準確移取混合標準儲備溶液，采用甲醇定容，配制濃度為0.25、0.5、1.0、2.5、25、50和100ng/mL的一系列混合標準溶液，其中內標物濃度為10ng/ml。將上述配制好的一系列不同濃度的混合標準溶液分別進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)檢測，以4種亞硝胺成分與相應內標物的二級選擇離子峰面積比為縱坐標(Y軸)，其4種亞硝胺成分與相應內標物的質量濃度比為橫坐標(X軸)，進行回歸分析，得到回歸方程及其相關系數，如表5、圖2-5所示。由表5、圖2-5可知，回歸方程的線性關系良好，相關系數R2＝0.9817～0.9997。對混合標準溶液中的目標物響應信號，采用最低濃度標樣重復進樣10次，進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)分析，以3倍信噪比為方法的檢出限(LOD)，10倍信噪比為定量限(LOQ)，換算為樣品含量后得出目標物的方法檢出限為0.023～0.045ng/ml，定量限為0.076～0.151ng/ml，具有較高的靈敏度。表5工作曲線和檢出限y：離子峰面積比；x：濃度比實施例4選取已知亞硝胺濃度的卷煙煙氣樣品，加入已知濃度的混合標準溶液，然后進行上述實施例2中1的前處理，并進行多維液相色譜質譜聯用系統(tǒng)分析，按照樣品與加標量＝1：1/2或1：1或1：2，計算其回收率。同時對同一待測樣品溶液進行平行測定5次(n＝5)，得到4種亞硝胺成分的精密度測定數據，結果見表6。表64種亞硝胺成分的回收率和精密度由表6可以看出，目標物的回收率在93.4～106.2％之間，日內相對標準偏差(RSD)小于6％，日間相對標準偏差(RSD)小于9％，說明本發(fā)明方法的回收率高、準確性和重復性好，可以滿足定量需要。實施例5采用如實施例2中的本發(fā)明的分析方法測定常規(guī)卷煙煙氣樣品中4種亞硝胺的含量，具體結果見表7。由表7可知，獲得的TSNAs含量：NNK5.37ng/cig，NAB2.89ng/cig，NAT5.52ng/cig，NNN7.68ng/cig，與經典方法樣品的含量水平一致，該方法具有較好的準確性，可以應用于大批量實際樣品的分析測定中。其中，樣品的含量(ng/cig)是將本發(fā)明的分析方法測定的樣品濃度(ng/mL)×20mL/20cig后獲得。表7實際卷煙煙氣樣品中4種亞硝胺的含量序號成分名稱樣品的含量(ng/cig)1NNK5.372NAB2.893NAT5.524NNN7.68所以，本發(fā)明有效克服了現有技術中的種種缺點而具高度產業(yè)利用價值。上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬
技術領域：
中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。當前第1頁1 2 3