用于遞送生物活性材料的支化聚胺的制作方法
【專利說明】用于遞送生物活性材料的支化聚胺
[0001] 聯(lián)合研發(fā)協(xié)議的各方
[0002] 本發(fā)明是在InternationalBusinessMachinesCorporation和theAgencyFor Science，TechnologyandResearch的聯(lián)合研發(fā)協(xié)議下做出的。
[0003] 背景
[0004] 本發(fā)明涉及用于遞送生物活性材料的支化聚胺，更具體地，涉及氨基甲酸酯官能 化的支化聚乙烯亞胺，其包含用于基因遞送的疏水氨基甲酸酯端基。
[0005] 基于核酸的療法在治療人類疾病上大有前景。理論上，不僅錯誤和缺陷基因可以 被功能基因修正和替換，而且多余的基因表達(dá)也可以通過使用RNA干預(yù)而被抑制到正常水 平。通常，有兩個主要類型的基因遞送載體，即病毒載體和非病毒載體。盡管病毒載體具有 優(yōu)越的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，但是病毒載體的致免疫和致癌的可能性限制了其臨床應(yīng)用。為了避免這 個問題，已經(jīng)報道了一些非病毒基因遞送系統(tǒng)，其包括（1)核酸與包括脂類、聚合物和肽在 內(nèi)的多種陽離子分子的絡(luò)合以及（2)核酸與諸如膽固醇和細(xì)胞穿透肽的天然配體的結(jié)合。 非病毒基因遞送載體正在受到更多的關(guān)注，這是由于其生物安全性、低生產(chǎn)成本、運(yùn)輸和儲 存方便、再生產(chǎn)性，以及用于靶向特定細(xì)胞類型的可調(diào)的官能性。
[0006] 在各種類型的非病毒載體中，支化聚乙烯亞胺（bPEI)，其含有伯、仲和叔胺基，提 供了高的體外基因轉(zhuǎn)染效率。具體地，具有25kDa的重均分子量（Mw)和約10kDa的數(shù)均分 子量（Mn)的在本文中稱為bPEI-25的bPEI被視為工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。bPEI-25在生理pH下具有高 陽離子電荷密度，其中bPEI-25的約20%的胺基團(tuán)（即伯胺）被質(zhì)子化。這使得bPEI-25能 夠與帶負(fù)電的核酸在寬泛的pH范圍內(nèi)靜電相互作用并且使它們能夠復(fù)合成納米粒子。一 旦bPEI-25/核酸納米復(fù)合物被細(xì)胞吸收同化，那么仲胺和叔胺促進(jìn)核酸從核內(nèi)體通過"質(zhì) 子海綿效應(yīng)"釋放。對于脫氧核糖核酸（DNA)，所釋放的核酸被攝入細(xì)胞核給予了高的基因 轉(zhuǎn)移效率。
[0007] 盡管有著高的基因轉(zhuǎn)染效率，bPEI-25的凈正電荷具有涉及以下的主要缺點，即， 涉及毒性、聚集以及bPEI-25/核酸復(fù)合物與細(xì)胞組分和非細(xì)胞組分（尤其在體內(nèi)）不期望 的非特異性相互作用。副反應(yīng)包括肝壞死、聚集的血小板的粘連以及更高劑量的全身注射 之后的休克。
[0008] 考慮到bPEI-25所面臨的細(xì)胞毒性問題，低分子量支化聚乙烯亞胺（Mw為約 2. 0kDa，Mn為約1. 8kDa，在本文中稱為bPEI-2)也已獲得關(guān)注，這是由于其有利的細(xì)胞毒性 譜。當(dāng)用于體內(nèi)治療目的時，低分子量使得bPEI-2可以從腎臟排泄。然而，bPEI-2的主要 缺點是其低效的轉(zhuǎn)染能力，使其不足以用作基因轉(zhuǎn)染載體。
[0009] 因此，對于開發(fā)更有效且細(xì)胞毒性更低的用于遞送生物活性材料的聚乙烯亞胺衍 生物，存在著持續(xù)的需求。
[0010] 概述
[0011] 因此，公開了支化聚胺，其包含：
[0012] 約45至約70個骨架叔胺基團(tuán)，約90至約140個骨架仲胺基團(tuán)，大于0的正數(shù)n' 個骨架末端伯胺基團(tuán)，以及大于〇的正數(shù)q個通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基團(tuán)：
【主權(quán)項】
1. 支化聚胺，其包含： 約45至約70個骨架叔胺基團(tuán)，約90至約140個骨架仲胺基團(tuán)，大于O的正數(shù)η'個骨 架末端伯胺基團(tuán)，以及大于〇的正數(shù)q個通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基團(tuán)： 其中：
(n' +q)為等于約45至約70的數(shù)， 通式（2)的星號鍵與所述支化聚胺的骨架氮連接， L'為包含3至30個碳的二價基團(tuán)，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于約 9 % 至約 47 %。
2. 如權(quán)利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺基本由η'個伯氮丙啶重復(fù)單元、 約90至約140個仲氮丙啶重復(fù)單元、約45至約70個叔氮丙啶重復(fù)單元以及q個通式（2) 的氨基甲酸酯基團(tuán)組成。
3. 如權(quán)利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺是數(shù)均分子量為約8500至約 15000的氨基甲酸酯官能化的支化聚乙烯亞胺。
4. 如權(quán)利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺在N/P 10至N/P 50下為非細(xì)胞 毒性的。
5. 如權(quán)利要求1所述的支化聚胺，其中L'包含糖部分。
6. 如權(quán)利要求5所述的支化聚胺，其中所述糖部分為甘露糖、半乳糖或葡萄糖部分。
7. 如權(quán)利要求1所述的支化聚胺，其中qAn'+q) X 100%等于約9%至約25%。
8. 如權(quán)利要求1所述的支化聚胺，其中q/(n'+q) X 100%等于約9%至約12%。
9. 如權(quán)利要求1所述的支化聚胺，其中所述氨基甲酸酯基團(tuán)是不帶電的。
10. 如權(quán)利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺不含季胺基團(tuán)。
11. 如權(quán)利要求1所述的支化聚胺，其中所述支化聚胺能夠在基因轉(zhuǎn)染過程中充當(dāng)基 因載體。
12. 支化聚胺，其包含： 約45至約70個骨架叔胺基團(tuán)，約90至約140個骨架仲胺基團(tuán)，大于0的正數(shù)η'個骨 架末端伯胺基團(tuán)，以及大于〇的正數(shù)q個通式（4)的骨架末端氨基甲酸酯基團(tuán)：
其中 通式（4)的星號鍵與所述支化聚胺的骨架氮連接， R1為氫、甲基或乙基， R2為氫或包含1至27個碳的單價基團(tuán)， (n' +q)為等于約45至約70的數(shù)，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于約 9 % 至約 47 %。
13. 如權(quán)利要求12所述的支化聚胺，其中R2為酯*-C( = 0) 0R3,其中R3包含1至26個 碳。
14. 方法，其包括： 用環(huán)狀碳酸酯單體處理包含約45至約70個伯胺基團(tuán)、多個仲胺基團(tuán)和多個叔胺基團(tuán) 的支化第一聚合物而不使所述環(huán)狀碳酸酯單體聚合，從而形成包含以下的支化聚胺：i)約 45至約70個骨架叔胺基團(tuán)，ii)約90至約140個骨架仲胺基團(tuán)，iii)大于0的正數(shù)η'個 骨架末端伯胺基團(tuán)，以及iv)大于〇的正數(shù)q個通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯基團(tuán)： 其中：
(n' +q)為等于約45至約70的數(shù)， 通式（2)的星號鍵與所述支化聚胺的骨架氮連接， L'為包含3至30個碳的二價基團(tuán)，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于約 9 % 至約 47 %。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述環(huán)狀碳酸酯單體包含一種或多種保護(hù)基，并 且所述方法進(jìn)一步包括使所述支化聚胺脫保護(hù)。
16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述環(huán)狀碳酸酯為6元環(huán)的環(huán)狀碳酸酯。
17. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述支化第一聚合物為基本由以下組成的枝化聚 乙烯亞胺： 約45至約70個具有下述結(jié)構(gòu)的伯氮丙啶重復(fù)單元
約90至約140個具有下述結(jié)構(gòu)的仲氮丙啶重復(fù)單元
以及 約45至約70個具有下述結(jié)構(gòu)的叔氮丙啶重復(fù)單元
其中各星號鍵表示與所述骨架的另一重復(fù)單元的連接點。
18. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述環(huán)狀碳酸酯單體選自：
19.復(fù)合物，其包含： 基因；以及 支化聚胺，其包含約45至約70個骨架叔胺基團(tuán)，約90至約140個骨架仲胺基團(tuán)，大于 〇的正數(shù)η'個骨架末端伯胺基團(tuán)，以及大于〇的正數(shù)q個通式（2)的骨架末端氨基甲酸酯
基團(tuán)： 其中： (n' +q)為等于約45至約70的數(shù)， 通式（2)的星號鍵與所述支化聚胺的骨架氮連接， L'為包含3至30個碳的二價連接基團(tuán)，以及 q/ (n，+q) X 100 % 等于約 9 % 至約 47 %。
20. 如權(quán)利要求19所述的復(fù)合物，其中所述基因為siRNA。
21. 處理細(xì)胞的方法，其包括使所述細(xì)胞與權(quán)利要求19所述的復(fù)合物接觸。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞為人類腫瘤細(xì)胞。
23. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞為肝癌細(xì)胞。
24. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞為宮頸癌細(xì)胞。
25. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞為卵巢癌細(xì)胞。
26. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述細(xì)胞為人類間充質(zhì)干細(xì)胞。
27. 支化聚胺，其具有通式（5)的結(jié)構(gòu)：
其中j、k、m、n'和q表示大于0的摩爾數(shù)，j具有約185至約280的值，k具有約45至約 70的值，m具有約90至約140的值，（n' +q)具有約45至約70的值，以及qAn' +q) X 100% 具有約9 %至約47 %的值，并且各個Z'為選自以下的獨立部分
【專利摘要】支化聚胺包含約45至約70個骨架叔胺基團(tuán)，約90至約140個骨架仲胺基團(tuán)，大于0的正數(shù)n'個骨架末端伯胺基團(tuán)，以及大于0的正數(shù)q個通式(2)的骨架末端氨基甲酸酯基團(tuán)：-CH2-CH2-N-(C＝O)-O-L'-OH(2)，其中(n'+q)為等于約45至約70的數(shù)，通式(2)的星號鍵與支化聚胺的骨架氮連接，L'為包含3至30個碳的二價基團(tuán)，以及q/(n'+q)×100％等于約9％至約47％。
【IPC分類】A61K48-00, C08G73-02, A61K47-48
【公開號】CN104769011
【申請?zhí)枴緾N201380056847
【發(fā)明人】程薇, 丹尼爾·J·克迪, 阿曼達(dá)·C·恩格樂特, 詹姆士·L·海德瑞克, 張貝云, 楊川, 楊義燕
【申請人】囯際商業(yè)機(jī)器公司, 新加坡科技研究局
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2013年9月4日
【公告號】EP2895526A1, US8703197, US20140080215, WO2014042920A1