專(zhuān)利名稱(chēng)：用于固定生物分子和細(xì)胞的聚合物涂覆的基底的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及制備通過(guò)排列來(lái)固定生物分子或細(xì)胞的基底的方法，特別涉及具有用于結(jié)合生物分子或細(xì)胞的側(cè)官能團(tuán)的聚合物涂層的基底。本發(fā)明還涉及利用聚合物涂覆的基底制備的生物陣列。
背景技術(shù)：
近來(lái)，對(duì)于在各種固體表面上通過(guò)固定多核苷酸、蛋白和細(xì)胞來(lái)構(gòu)成生物陣列已引起廣泛關(guān)注。多核苷酸陣列已被成功地用于基因表達(dá)分析、DNA合成和測(cè)序、變異檢測(cè)、多態(tài)性篩選、連鎖分析以及對(duì)基因轉(zhuǎn)錄中可選擇的剪接變體的篩選(美國(guó)專(zhuān)利第5,474,796號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,037,124號(hào))。蛋白陣列已被用于免疫分析、酶分析、帶圖案的細(xì)胞生長(zhǎng)、肽庫(kù)、光數(shù)據(jù)存儲(chǔ)及圖象檢測(cè)和處理(A.S.Blaws和W.M.Reichert，Protein Patterning，Biomaterials 19595-609，1998)。已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞陣列可用于藥物傳輸中，其中需要細(xì)胞對(duì)生物活性化合物的生理反應(yīng)的高產(chǎn)量及高含量篩選(美國(guó)專(zhuān)利第6,103,479號(hào))。
有多種方法(包括吸附、紫外線交聯(lián)和共價(jià)結(jié)合)可用于在固體載體上固定生物分子和細(xì)胞。在表面上吸附生物分子是由離子力、疏水力、或Van der Waals吸引力驅(qū)動(dòng)的相對(duì)簡(jiǎn)單的方法。然而，這種方法無(wú)法將的生物分子和細(xì)胞充分穩(wěn)定地固定在基底上。該方法也不能精確地結(jié)合生物分子和細(xì)胞，而這在生物陣列中是所需要的。
紫外線交聯(lián)涉及用光化學(xué)物質(zhì)引發(fā)基底，當(dāng)被紫外線激活時(shí)光化學(xué)物質(zhì)可與目標(biāo)生物分子結(jié)合。然而該方法是隨機(jī)過(guò)程，其不能形成精確的陣列結(jié)構(gòu)。此外，用光化學(xué)物質(zhì)引發(fā)的基底對(duì)紫外光敏感，這將為其存儲(chǔ)和使用帶來(lái)困難。
更穩(wěn)定且精確地固定生物分子的方法是其與表面的共價(jià)結(jié)合。然而，由于天然的生物分子和未改性的基底間較弱的相互作用，為提高其有效結(jié)合經(jīng)常需要對(duì)生物分子和其基底進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，美國(guó)專(zhuān)利第5,215,882號(hào)公開(kāi)了用伯胺修飾核酸，然后在還原劑存在下經(jīng)修飾的核酸與帶有自由醛基的固體基底反應(yīng)。對(duì)于在基底上固定生物分子還有其他大量的報(bào)道，該基底被修飾成帶有各種活性基團(tuán)，包括羥基、羧基、胺、肼、環(huán)氧化物、溴乙?；ⅠR來(lái)酰亞胺和硫醇基(例如參見(jiàn)國(guó)專(zhuān)利第6,013,789號(hào)背景部分中所討論的內(nèi)容及A.S.Blaws和W.M.Reichert，Biomaterials 19595-609，1998)。
其他研究者使用雙功能交聯(lián)劑如硅烷來(lái)固定生物分子(美國(guó)專(zhuān)利第5,474,796號(hào))。近來(lái)，本發(fā)明(美國(guó)專(zhuān)利第6,268,141號(hào))的受讓人報(bào)道了可在氟化酰基活化的基底上固定未改性的生物聚合物。然而，基底表面的化學(xué)引發(fā)通常會(huì)產(chǎn)生凈電荷，這在隨后過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致生物分子與化學(xué)修飾的基底發(fā)生所不希望的非特異性靜電結(jié)合。
此外，當(dāng)生物聚合物和基底的表面性能不匹配時(shí)，即使基底包含較高濃度的反應(yīng)基團(tuán)，在基底上結(jié)合生物分子特別是生物聚合物極其困難。例如，因?yàn)槭顾芤褐械纳锞酆衔锝咏砻嬖谀芰拷嵌群芾щy，所以親水性表面將對(duì)疏水性生物聚合物有排斥性(美國(guó)專(zhuān)利第5,250,613)。
為改進(jìn)生物聚合物的固定，同時(shí)防止其自發(fā)地吸附于固體載體上，美國(guó)專(zhuān)利第5,250,613號(hào)教導(dǎo)了在帶負(fù)電荷的固體表面上吸附水溶性的用親水性非離子聚合物引發(fā)的聚乙烯亞胺(PEI)的共軛物，然后使生物聚合物與表面起反應(yīng)。另外，美國(guó)專(zhuān)利第5,250,613號(hào)建議將親水性非離子聚合物與生物聚合物連接，然后使得到的產(chǎn)物與PEI起反應(yīng)來(lái)形成共軛物，然后共軛物吸附于帶負(fù)電荷表面上。然而，該方法需要多種復(fù)雜的步驟，包括在表面上引發(fā)負(fù)電荷及在非離子聚合物和PEI間產(chǎn)生接枝聚合物。
近來(lái)，利用帶有PEI層的固體基底來(lái)固定陣列格式的氨基修飾的多核苷酸的另一種方法得到公開(kāi)(美國(guó)專(zhuān)利第6,150,103號(hào))。然而，該方法也需要多個(gè)步驟。因此，由該技術(shù)制得的陣列相當(dāng)昂貴且質(zhì)量不一致。此外，該方法需要在生物聚合物中加入增稠劑以確保每一滴生物聚合物將置于陣列中所需要的位置。加入增稠劑會(huì)對(duì)陣列的生物分子結(jié)合能力產(chǎn)生不良影響。
很多研究者也使用商業(yè)可得到的聚合物涂覆的載玻片來(lái)制造生物芯片。然而，商業(yè)可得到的基底如涂覆有聚-L-賴(lài)氨酸的載玻片利用次級(jí)結(jié)合化學(xué)，而用丙烯酰胺或戊二醛來(lái)浸涂或噴涂載片得到的其他基底可提供具有有限保質(zhì)期的非均勻涂覆表面。此外，為結(jié)合一種類(lèi)型的生物分子(例如核酸)而設(shè)計(jì)的商業(yè)基底可能不適于結(jié)合其他生物分子(例如蛋白)。
因此，現(xiàn)有的方法和基底不能提供便利、廉價(jià)且可靠的過(guò)程來(lái)制備生物分子或細(xì)胞陣列。從而，需要研發(fā)具有較佳成本效益、快速、可靠且靈活的制備生物陣列的方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供使基底的物理和化學(xué)性能適合于與該基底結(jié)合的生物分子物質(zhì)的性能的方法。本發(fā)明的另一目的是提供具有合理保質(zhì)期的固定基底，其在周?chē)鷹l件下穩(wěn)定、廉價(jià)且物理粗糙。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有在位置特異性位置處和在高密度下適于固定生物分子和細(xì)胞的表面的基底。
這些和其他目的在本發(fā)明中得以實(shí)現(xiàn)，其中通過(guò)在惰性或活性固體基底上利用能引入新化學(xué)和選定的表面性能(例如疏水性、親水性、兩性)的靈活涂覆方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。從而，本發(fā)明一個(gè)方面提供制備用于固定生物分子或細(xì)胞的基底的方法。該方法包括如下步驟(a)提供帶有表面的固體載體；及(b)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法在該表面上沉積聚合涂層，其中該聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合該生物分子或細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法是化學(xué)氣相沉積法(CVD)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法是等離子體-引發(fā)的接枝法。
本發(fā)明的聚合涂層可包括羧酸化的聚合物。羧酸化的聚合涂層可通過(guò)將羧基轉(zhuǎn)化成能結(jié)合生物分子或細(xì)胞的基團(tuán)而活化。在一個(gè)實(shí)施方案中，羧酸化的聚合物通過(guò)將羧基轉(zhuǎn)化成氟化酰基基團(tuán)而活化。
聚合涂層的材料優(yōu)選是通過(guò)以下方法來(lái)選擇，即其表面性能可增強(qiáng)側(cè)基和生物分子或細(xì)胞間的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇的聚合涂層材料可最大化聚合涂層和被結(jié)合的生物分子或細(xì)胞間的非共價(jià)吸引力，包括離子力、疏水力、或Van der Waals力。例如，當(dāng)生物分子或細(xì)胞的外表面是疏水性的，那么聚合涂層優(yōu)選是疏水性的。
本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)上述方法制得的用于固定生物分子和細(xì)胞的基底。
本發(fā)明的另一方面提供用于固定生物聚合物或細(xì)胞的基底。該基底包括由聚合材料構(gòu)成的固體載體。該固體載體具有至少一個(gè)適合在其表面結(jié)合第一種生物分子或第一種細(xì)胞的第一種側(cè)官能團(tuán)。該基底還包括沉積在該基底表面上的聚合涂層。該聚合涂層增強(qiáng)了該第一種生物分子或該第一種細(xì)胞與該第一官能團(tuán)的結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明提供了使生物分子和細(xì)胞與固體載體結(jié)合的方法。該方法包括如下步驟(a)提供生物分子或細(xì)胞；
(b)提供固體載體；(c)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法將聚合涂層沉積在載體的表面上以形成涂覆基底，其中聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合生物分子或細(xì)胞；及(d)使該生物分子或細(xì)胞在允許該生物分子或細(xì)胞與該側(cè)官能團(tuán)結(jié)合的條件下與該涂覆基底接觸。
本發(fā)明的另一方面提供通過(guò)包括如下步驟的方法制得的生物陣列(a)提供多個(gè)生物分子或細(xì)胞；(b)提供帶有表面的固體載體；(c)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法將聚合涂層沉積在載體的表面上以形成涂覆基底，其中聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合該生物分子或細(xì)胞；及(d)使該生物分子或細(xì)胞在允許該生物分子或細(xì)胞與該側(cè)官能團(tuán)結(jié)合的條件下與該涂覆基底上的不連續(xù)位置處的側(cè)官能團(tuán)接觸，從而形成生物陣列。
本發(fā)明具有多種經(jīng)濟(jì)和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以理解本發(fā)明的涂覆方法允許快速和均勻在惰性材料上引入功能基。此外，本發(fā)明的聚合涂層的表面性能很容易與被結(jié)合的生物分子的性能相匹配，從而增強(qiáng)生物分子-基底或細(xì)胞-基底的結(jié)合。因此，本發(fā)明提供構(gòu)造生物陣列的多樣和具有成本效益的方法，該方法能克服現(xiàn)有技術(shù)中多步方法的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的上述和其他特征以及其得以實(shí)現(xiàn)的方法通過(guò)下面結(jié)合附圖的說(shuō)明將變得更加明顯和更易理解。這些附圖僅描述了本發(fā)明典型的實(shí)施方案，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖1是闡明本發(fā)明的陣列表面形成及其在生物分子結(jié)合中的應(yīng)用的圖。
圖2是柱狀圖，其用來(lái)將用本發(fā)明射頻等離子體放電-化學(xué)氣相沉積(RFPD-CVD)方法制備的羧酸化聚合物所涂覆的基底的表面結(jié)合能力與現(xiàn)有技術(shù)中在氨氣中用RFPD制備的表面活化的基底的表面結(jié)合能力進(jìn)行比較。
發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的一個(gè)方面提供制備用于固定生物分子或細(xì)胞的方法。該方法包括如下步驟(a)提供帶有表面的固體載體；及(b)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法在該表面上沉積聚合涂層，其中該聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合生物分子或細(xì)胞。
這里用到的術(shù)語(yǔ)“生物分子”是指核酸、多核苷酸、多肽、蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)、藥物、半抗原、或其他小的有機(jī)分子(如染料)及其他類(lèi)似物。這里用到的“多核苷酸”指脫氧核糖核酸或核糖核酸的聚合物，其為分離的碎片形式或作為較大結(jié)構(gòu)的成分。這里用到的“多核苷酸”可以是DNA、RNA、DNA類(lèi)似物(如PNA(肽核酸))、或合成的寡核苷酸。DNA可是單鏈或雙鏈DNA，或由PCR技術(shù)擴(kuò)增的DNA。RNA可以是mRNA。DNA或RNA可包括二脫氧核苷酸。
多核苷酸的長(zhǎng)度可是3bp到10kb。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，多核苷酸的長(zhǎng)度約為50bp到10kb，優(yōu)選為100bp到1.5kb。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，合成的寡核苷酸的長(zhǎng)度約為3到100個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，寡核苷酸的長(zhǎng)度約為40到80個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，寡核苷酸的長(zhǎng)度約為15到20個(gè)核苷酸。
這里用到的術(shù)語(yǔ)“多肽”是指氨基酸聚合物，其中一個(gè)氨基酸的α-羧基通過(guò)肽鍵與另一個(gè)氨基酸的α-氨基連接。蛋白可包括一個(gè)或多個(gè)通過(guò)二硫鍵連接到一起多肽。蛋白的例子包括但不限于抗體、抗原、配體、受體等。
這里用到的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞”指任何活的或死的單細(xì)胞、多細(xì)胞、組織或細(xì)胞片段、細(xì)胞隔膜、脂質(zhì)體制劑或亞細(xì)胞器官(如線粒體、核糖體或細(xì)胞核)。粘附和不粘附類(lèi)型的細(xì)胞都可被固定。細(xì)胞包括但不限于人類(lèi)的毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞、HeLa、A549和胸部的癌細(xì)胞系(如BT-474)。某些細(xì)胞系需要纖維連接蛋白或其他細(xì)胞穩(wěn)定化細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的共粘附。某些肽(如四肽、RGDS)可被結(jié)合以增強(qiáng)蛋白和細(xì)胞的結(jié)合。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的固體載體可以是能提供用于聚合涂層沉積表面的任何材料。固體載體的實(shí)例包括但不限于聚合材料和陶瓷材料、玻璃、陶瓷、天然纖維、硅樹(shù)脂、金屬及其復(fù)合物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的固體載體可由聚合材料制得，如聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚砜、PVDF、聚四氟乙烯及其復(fù)合物、摻和物或衍生物。
這里用到的術(shù)語(yǔ)“化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法”指任何包括利用化學(xué)等離子體來(lái)協(xié)助、引發(fā)或催化聚合材料形成的方法。化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法的實(shí)例包括但不限于化學(xué)氣相沉積(CVD)和等離子體-引發(fā)的接枝或其組合。
有機(jī)薄膜的CVD已被成功地用于很多技術(shù)領(lǐng)域，從在陶瓷或陶器材料上的裝飾涂層到半導(dǎo)體芯片表面上的電路連線，再到切割工具和支撐面上的耐磨損涂層。例如，美國(guó)專(zhuān)利第4,091,166號(hào)教導(dǎo)了包含光學(xué)或熱塑性基底的三氟化硼的沉積，從而增強(qiáng)了耐擦傷或耐磨損性。美國(guó)專(zhuān)利第5,514,424號(hào)描述了在固體上沉積通過(guò)等離子體-引發(fā)的聚合而得到的氟化聚合物薄層，從而降低了水和固體間的摩擦系數(shù)且增強(qiáng)了所述表面的防水性。美國(guó)專(zhuān)利第6,287,990號(hào)公開(kāi)了在基底上沉積較低介質(zhì)常數(shù)的膜，從而形成半導(dǎo)體裝置。
通過(guò)CVD沉積的薄膜顯現(xiàn)出許多令人滿意的特性，包括易于準(zhǔn)備、一致性、復(fù)雜基底的一致覆蓋度、對(duì)多種基底的優(yōu)異粘合及具有產(chǎn)生獨(dú)特化學(xué)性的能力。此外，覆蓋層薄膜不能顯著地滲透到基底中，所以不會(huì)影響基底的機(jī)械性能(美國(guó)專(zhuān)利第5,002,794和5,153,072號(hào))。然而在本發(fā)明之前，CVD方法還未用于生物陣列的制備。這可能是因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)將等離子體沉積的薄膜作為不確定的化學(xué)結(jié)果(美國(guó)專(zhuān)利第5,002,794和5,153,072號(hào))。
等離子體-引發(fā)的接枝被用于例如為增強(qiáng)蛋白結(jié)合而在PTFE上接枝聚(丙烯酸)；或?yàn)闇p弱蛋白吸附和細(xì)胞結(jié)合而將聚環(huán)氧乙烷(PEO)接枝到塑料上。
令人意外的是本發(fā)明發(fā)現(xiàn)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法可用來(lái)在基底上引入所需的側(cè)官能團(tuán)，從而促進(jìn)生物分子和細(xì)胞與基底的結(jié)合。此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法可用來(lái)選擇性地修飾固體載體的表面，從而使其表面性能與所結(jié)合的生物分子或細(xì)胞的性能相匹配，因而可提高其間的表面相互作用。此外，當(dāng)本發(fā)明的基底用作生物陣列時(shí)，表面修飾可有益地增強(qiáng)結(jié)合的捕獲探針與分析物間的隨后結(jié)合。
通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合使聚合材料在固體載體上沉積是眾所周知的方法，因而沒(méi)有詳述。例如，當(dāng)使用CVD時(shí)，將待涂覆的固體載體放置在等離子體室內(nèi)，其通常經(jīng)過(guò)排空或被加壓到所需要的壓力。在等離子體室中產(chǎn)生或引入待沉積在載體上的涂層材料，并認(rèn)為等離子體的形式包括氣態(tài)蒸汽和固體微粒物質(zhì)。等離子體可包括原子、分子、離子和涂層材料的分子凝聚體，也包括任何所需要的反應(yīng)試劑和任何所不需要的雜質(zhì)的凝聚體。涂覆或沉積過(guò)程本身可通過(guò)將等離子體涂覆微粒濃縮于待涂覆的載體表面而發(fā)生。沉積室可在沉積“進(jìn)行”前進(jìn)行排空，以清除室中的雜質(zhì)，但一般而言化學(xué)氣相沉積是在大氣壓或正壓(高于大氣壓)水平下實(shí)現(xiàn)(美國(guó)專(zhuān)利第6,139,964號(hào))。
等離子體-引發(fā)的接枝中，該基底首先在稀有氣體等離子體中進(jìn)行預(yù)處理，如氬等離子體或氦等離子體。然后將單體或聚合物引進(jìn)等離子體室中，且與基底反應(yīng)。在化學(xué)氣相沉積(CVD)法中，聚合是在氣相中被引發(fā)的。例如，硅涂層可通過(guò)硅烷CVD法在表面上形成。涂層是分解高蒸汽壓的氣態(tài)化合物的結(jié)果。它們被輸送到基底表面，在那里通常通過(guò)在接近或在基底表面上的熱分解反應(yīng)而形成涂層。
“等離子體”最優(yōu)選的是電離氣體，其能從磁場(chǎng)得到足夠的電離能，并展示出較長(zhǎng)范圍的電磁力。等離子體能源包括但不限于直流、交流、射頻微波、振動(dòng)波和激光。低溫等離子體處理包括射頻等離子體放電(“RFPD”)、微波頻率等離子體放電(“MFPD”)和電暈放電(“CD”)；這些處理通常都僅影響固體材料的表面，而留下未改變的剩余材料。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用RFPD。
等離子體產(chǎn)生裝置可通過(guò)商業(yè)方式得到。例如，特別優(yōu)選的等離子體發(fā)生器可從Plasma Science，F(xiàn)oster City，Calif.(型號(hào)PS0150E射頻)得到。該裝置是優(yōu)選的，這是因?yàn)橐脷怏w的條件、功率、等離子體放電時(shí)間等能易于選擇、變化、最優(yōu)化及控制。這些參數(shù)能用較少實(shí)驗(yàn)達(dá)到最優(yōu)化，主要是因?yàn)槔缛绻芰?一般為瓦特)太高或等離子體放電的時(shí)間太長(zhǎng)，那么聚合涂層的物理?xiàng)l件將受到不利影響。這種不利影響通常表現(xiàn)為形成“易碎的”聚合物介質(zhì)。從而，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以使化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合涂層的有效沉積條件最優(yōu)化。
可以使用大寬范圍的功率裝置、射頻及聚合表面與等離子體接觸的時(shí)間。這三種參數(shù)的范圍可提供有利的結(jié)果，其是約10～約500瓦的DC或AC功率水平，更優(yōu)選約100～約400瓦。接觸時(shí)間約為0.1～約30分鐘，最優(yōu)選約為2～10分鐘。還優(yōu)選的是利用射頻波；優(yōu)選約為1MHz～約50MHz，最優(yōu)選為10～20MHz。
本發(fā)明的聚合涂層能通過(guò)預(yù)形成帶有所需要的功能基和表面性能的聚合物的CVD而形成?？蛇x擇地，同時(shí)發(fā)生的化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合和帶有所需要的功能基的單體的沉積可形成本發(fā)明的聚合涂層。
本發(fā)明的聚合涂層包括具有能夠共價(jià)結(jié)合生物分子或細(xì)胞的側(cè)官能團(tuán)的任何聚合物。這些側(cè)官能團(tuán)的實(shí)例包括但不限于氟化酰基、酸酐、環(huán)氧化物、醛、酰肼、?；B氮化物、芳基疊氮化物、重氮化合物、苯甲酮、碳二亞胺、亞胺酸酯、異硫代氰酸酯、NHS酯、CNBr、馬來(lái)酰亞胺、甲苯磺酸、三氟乙基磺酰氯、馬來(lái)酸酐及羰基二咪唑。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以理解這些功能基可與生物分子和外層細(xì)胞表面的親核基團(tuán)起反應(yīng)，以共價(jià)結(jié)合生物分子或細(xì)胞。
親核基團(tuán)存在于可與本發(fā)明載體的側(cè)官能團(tuán)起反應(yīng)的生物分子上，其實(shí)例包括但不限于胺基、羥基、巰基和磷酸酯基。
相似地，親核基團(tuán)存在于可與本發(fā)明載體的側(cè)官能團(tuán)起反應(yīng)的細(xì)胞外表面，其實(shí)例包括但不限于糖蛋白表面抗原、蛋白側(cè)鏈胺基團(tuán)(如賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸)的糖基羥基部分或巰基(胱氨酸，蛋氨酸)或羥基(酪氨酸，色氨酸)殘基，以及表面蛋白的天冬氨酸、谷氨酸羧基側(cè)鏈。同樣地，某些膦基脂質(zhì)和甘油基脂質(zhì)包含能夠共價(jià)結(jié)合的羥基和胺功能性頭部基團(tuán)。親核反應(yīng)性遵循一般的順序R-S-＞R-NH2＞R-COO-≌R-O-，其中R指生物分子上的適當(dāng)側(cè)鏈基團(tuán)。
可選擇地，聚合涂層包括能被引發(fā)以形成適于共價(jià)結(jié)合生物分子和細(xì)胞的功能基的聚合物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合涂層包括羧酸化的聚合物，上述方法的沉積步驟(b)包括(c)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法在該表面上沉積該羧酸化的聚合物涂層，其中該羧酸化的聚合涂層包含至少一個(gè)懸掛羧基；及(d)通過(guò)將該羧基轉(zhuǎn)化成能結(jié)合生物分子或細(xì)胞的基團(tuán)來(lái)活化該羧酸化的聚合涂層。
通常沉積步驟(c)包括如下步驟(e)將羧酸化的單體和固體載體引進(jìn)等離子體室中；及(f)在足以使該羧酸化的單體自由基聚合形成羧酸化聚合物并在該固體載體上進(jìn)一步吸附形成的羧酸化聚合物的條件下，通過(guò)在該等離子體室中提供RFPD而在固體載體上形成該羧酸化的聚合涂層。
任何具有所需要的側(cè)官能團(tuán)的聚合單體都可用于形成本發(fā)明的聚合涂層。控制通過(guò)等離子體沉積方法制得的聚合薄膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)的方法對(duì)于本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員是公知的(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,153,072號(hào))，所以這里就不再詳述。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，利用硅烷化學(xué)加進(jìn)反應(yīng)性基團(tuán)。例如使用3-環(huán)氧丙氧丙基三甲基硅烷(TMS)可引進(jìn)環(huán)氧基團(tuán)，使用3-巰基丙基TMS可引進(jìn)硫醇基，使用3-氨基丙基TMS可引進(jìn)氨基。
當(dāng)需要羧酸化的聚合涂層時(shí)，聚合單體應(yīng)優(yōu)選包含羧基。適合的羧酸化單體的實(shí)例包括但不限于丙烯酸單體、乙烯基乙酸單體、羧基硅烷單體、羧基硅烷醇單體、甲基丙烯酸酯單體、丙烯酸酯單體及其混合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，如圖1所示，丙烯酸單體(I)及惰性基底被引入到等離子體室中[步驟(a)]。穿過(guò)電極產(chǎn)生RFPD，從而開(kāi)始自由基聚合，其中羧酸化的聚合物經(jīng)CVD吸附在基底表面上[步驟(b)]。隨后，羧基被轉(zhuǎn)化為氟化?；鵞步驟(c)]。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如圖1所示，硅烷化合物(II)通過(guò)CVD在固體載體上聚合和沉積。
本發(fā)明不限于特定羧基的活性化學(xué)。從而，盡管氟化?；罨迷诒景l(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，但是多種其他化學(xué)如NHS酯和羰基二咪唑也可使用。
當(dāng)使用氟化酰基活化時(shí)，活化步驟包括使羧基轉(zhuǎn)化為氟化?；?。根據(jù)本發(fā)明，用于在固體載體上形成氟化?；δ芑倪m當(dāng)試劑基本上包括羧基反應(yīng)性氟化劑。最優(yōu)選的反應(yīng)物是(二乙氨基硫)三氟化物(DAST)。其他適合的反應(yīng)物包括氰尿酰氟或四甲基氟甲酸六氟磷酸酯。聚合物的羧基可被轉(zhuǎn)化為氟化?；臈l件在以前已有描述(美國(guó)專(zhuān)利第6,268,141號(hào))。類(lèi)似的條件可被用于使本發(fā)明聚合涂層的羧基活化，所以在這里將不再討論這些條件。
預(yù)處理固體載體表面可增強(qiáng)縮合、聚合及聚合涂層的吸附。在一個(gè)實(shí)施方案中，等離子體蝕刻被用作表面預(yù)處理的方法。其他表面預(yù)處理的方法在本領(lǐng)域中是公知的，包括例如使用強(qiáng)酸如硫酸或在乙酸-酸酐的混合物中使用鉻(VI)氧化物的化學(xué)氧化。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，制備基底的方法還包括選擇聚合涂層材料的步驟。該材料是根據(jù)其形成帶有用于共價(jià)結(jié)合生物分子或細(xì)胞的所需要的側(cè)官能團(tuán)的聚合涂層的能力來(lái)選擇。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇的材料應(yīng)使得沉積的聚合涂層其表面特性可最大化涂層與生物分子或細(xì)胞間的非共價(jià)相互作用。這些非共價(jià)相互作用包括離子力、疏水力和Van der Waals吸引力，其可將生物分子或細(xì)胞與基底上的功能基共價(jià)結(jié)合。
在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合涂層的表面性能與被結(jié)合的生物分子或細(xì)胞的表面性能相匹配，從而使其間的吸引力最大化。例如，當(dāng)生物分子或細(xì)胞的外表面是疏水性時(shí)，聚合涂層優(yōu)選也是疏水性。當(dāng)聚合涂層將水排斥于其結(jié)構(gòu)之外或不允許下表面被潤(rùn)濕時(shí)，聚合涂層是疏水性的，從而能防止吸附親水性的生物分子。疏水性聚合表面的接觸角(∠，水)通常大于或等于100°，而親水性表面為∠45°?？杀挥糜谛纬墒杷酝繉拥木酆喜牧系膶?shí)例包括但不限于烷基硫醇、烷基硅烷及其混合物。例如，在等離子體聚合過(guò)程中引到基底上的甲基丙烯酸酯甲酯和六甲基二硅氧烷單體可被用于形成包含羧酸基的疏水性聚合物。相關(guān)表面的疏水性變化能通過(guò)各種等離子體表面處理實(shí)現(xiàn)。例如，在PDMS的氧等離子體氧化之后，各種烷基三氯硅烷能形成接觸角變化的自組裝單層(SAM)。
當(dāng)生物分子或細(xì)胞的外表面是親水性時(shí)，聚合涂層優(yōu)選也親水性的。當(dāng)聚合涂層允許表面被水和親水性生物分子潤(rùn)濕時(shí)，該聚合涂層是親水性的?？杀挥糜谛纬捎H水性涂層的聚合材料的實(shí)例包括但不限于聚乙二醇、聚羧酸和聚賴(lài)氨酸。
最后，當(dāng)生物分子或細(xì)胞的外表面具有陽(yáng)離子和陰離子功能基時(shí)，聚合涂層優(yōu)選地是兩性的。當(dāng)聚合涂層同時(shí)具備陰離子和陽(yáng)離子電荷時(shí)，聚合涂層是兩性的。可被用于形成兩性涂層的聚合材料的實(shí)例包括但不限于兩性硅烷、兩性洗滌劑或其他表面活性劑。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以理解本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)是其利用可控制的聚合和涂覆方法，其允許制備表面性能適于結(jié)合生物分子和細(xì)胞的基底。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，聚合涂層包括沉積時(shí)能形成不同表面性能的局部區(qū)域的聚合材料混合物。例如，涂層的一部分可是疏水性的，而另一部分是親水性或兩性的。當(dāng)需要將不同類(lèi)型的生物分子或細(xì)胞結(jié)合到同一載體上時(shí)，這種混合涂層特別適用。相似地，聚合材料的混合物可用于制備至少有兩種與不同類(lèi)型的生物分子或細(xì)胞起反應(yīng)的側(cè)官能團(tuán)的涂層。因此，這種實(shí)施方案在包含不同類(lèi)型的生物分子或細(xì)胞的陣列結(jié)構(gòu)中特別有用。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，沉積在固體載體上的聚合涂層是單硅烷、硅烷醇化合物、或硅烷或硅烷醇化合物混合物的單層。當(dāng)使用硅烷或硅烷醇化合物的混合物時(shí)，每種化合物可有不同的功能基和/或表面性能?？梢允褂霉柰榛蚬柰榇嫉幕旌衔?，例如疏水性硅烷與反應(yīng)性硅烷(有側(cè)官能團(tuán)的硅烷)的混合物或親水性硅烷與反應(yīng)性硅烷的混合物，從而最優(yōu)化與被結(jié)合的生物分子或細(xì)胞的相互作用。
例如，正十八烷基三甲氧基硅烷的自組裝單層(AM)可在SiO2表面上形成。接著，牛血清蛋白(BSA)在SAM表面上形成單層。BSA可被用作固定其他生物分子(如抗體)的平臺(tái)?？梢栽诨妆砻嫔系牟贿B續(xù)位置上印刷SAM，從而產(chǎn)生SAM涂層和SiO2的表面圖案。SiO2表面可用不同的SAM涂覆或進(jìn)行等離子體聚合，從而用包含其他功能基的聚合物形成新表面。因而，識(shí)別細(xì)胞表面抗原的抗體能用來(lái)固定特殊的細(xì)胞類(lèi)型，而其他周?chē)鷧^(qū)域能用來(lái)固定細(xì)胞生長(zhǎng)因子或穩(wěn)定劑(例如纖維連接蛋白)時(shí)。
本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)等離子體反應(yīng)修飾固體載體的表面，以使表面基團(tuán)發(fā)生位置特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生表面-涂層圖案。因而，塑料基底可被物理掩蔽，例如通過(guò)用帶有不連續(xù)圖案孔的網(wǎng)來(lái)覆蓋基底，從而形成暴露和覆蓋區(qū)域。接著利用反應(yīng)性等離子體使暴露區(qū)域經(jīng)等離子體氧化、蝕刻或以其他方式處理以形成表面功能基，如胺或羥基。例如，塑料基底可在CF4-O2等離子體中被氧化和蝕刻，或在氨等離子體沉積方法中將胺基團(tuán)引到暴露的表面上。通過(guò)這種途徑，將暴露區(qū)域經(jīng)表面處理，而覆蓋區(qū)域保持為原始的基底。然后可除去掩蔽，并在等離子體聚合過(guò)程中進(jìn)一步涂覆帶圖案的基底。
可選擇地，等離子體-處理的暴露區(qū)域可被其他表面基團(tuán)獨(dú)立且位置特異性地涂覆。這可通過(guò)在經(jīng)處理區(qū)域和/或未處理區(qū)域上印刷化學(xué)物質(zhì)以形成不同的接近表面化學(xué)來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，氧化區(qū)域可包含使暴露區(qū)域?yàn)橛H水性的羧基，而未處理區(qū)域保持疏水性。然后通過(guò)在縮合劑如EDAC/NHS存在下使蛋白的賴(lài)氨酰殘基與基底羧基起反應(yīng)使生物分子(如蛋白)與暴露區(qū)域共價(jià)結(jié)合，縮合劑能催化反應(yīng)性羧基酯的形成。接著這些將與蛋白側(cè)鏈胺基團(tuán)縮合。烯丙基醇等離子體產(chǎn)生表面羥基，接著其可用于將聚環(huán)氧乙烷接枝到暴露表面上。這種表面表現(xiàn)出基本上減弱的蛋白吸附。
本發(fā)明也提供通過(guò)上述方法制備的用于固定生物聚合物或細(xì)胞的基底。因?yàn)楸景l(fā)明的基底尤其適用于制備用于評(píng)估和鑒定生物活性的生物分子和細(xì)胞陣列，所以在一個(gè)實(shí)施方案中固體載體是帶有至少一個(gè)平坦表面的裝置的形式。固體載體的尺寸能變化且取決于固定的生物分子和細(xì)胞的最終用途。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以理解，例如固定在小型化的固體載體上的生物聚合物的陣列已被研發(fā)多年。這些固體載體的大小以mm2為單位，且能有大量不同的固定生物聚合物，其中每一種不同的生物聚合物結(jié)合在小型化的固體載體上的不同位置特異性的位置處。
測(cè)量尺形式的固體載體也屬于本發(fā)明的范疇。本領(lǐng)域公知的是通常的測(cè)量尺每一邊是可測(cè)量幾厘米的矩形形狀。另一方面，用來(lái)為整個(gè)基因組測(cè)序的較大生物聚合物(如多核苷酸陣列)可有一米或更大的尺度。為提供大量不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)(包括專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備)，適合的固體載體也被澆鑄成各種形狀。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的固體載體可由多孔或非多孔材料制成。根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的固體載體可是線狀、薄片狀、薄膜狀、凝膠體、隔膜狀、珠狀、板狀和類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，固體載體可由平板裝置形式的塑料制成，其具有不連續(xù)的分離區(qū)域(孔狀、槽狀、底座狀、疏水性或親水性片狀、沖切的粘合貯藏器狀、或可形成孔的層壓襯墊狀、或其他防止流體流動(dòng)的物理?yè)醢?。這種固體載體的實(shí)例包括但不限于微塊板等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，固體載體由不能共價(jià)結(jié)合生物分子或細(xì)胞的惰性材料制成。該惰性材料的實(shí)例包括未改性的聚合材料、陶瓷材料、金屬、天然纖維、硅樹(shù)脂、玻璃及其復(fù)合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，固體載體包括具有至少一個(gè)適于結(jié)合第一種生物分子或第一種細(xì)胞的第一種側(cè)官能團(tuán)的材料，例如聚合物。在此實(shí)施方案中，聚合涂層可包括至少一個(gè)適于共價(jià)結(jié)合第二種生物分子或第二種細(xì)胞的第二種側(cè)官能團(tuán)。該第一種和該第二種側(cè)官能團(tuán)可相同或不同。該第一種和該第二種功能基可以是任何共價(jià)結(jié)合生物分子或細(xì)胞的基團(tuán)。例如，該第一種和該第二種功能基可獨(dú)立地選自氟化?；⑺狒h(huán)氧化物、醛、酰肼、酰基疊氮化物、芳基疊氮化物、重氮化合物、苯甲酮、碳二亞胺、亞胺酸酯、異硫代氰酸酯、NHS酯、CNBr、馬來(lái)酰亞胺、甲苯磺酸、三氟乙基磺酰氯、馬來(lái)酸酐和羰基二咪唑。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，包括結(jié)合的第一功能基的下層載體被能提高載體結(jié)合生物分子或細(xì)胞能力的聚合材料涂覆。例如，聚合涂層的材料可被選來(lái)提供更具有親水性(或疏水性或兩性，帶電或親合性基分子識(shí)別)并包圍該第一功能基的局部環(huán)境。帶電的基團(tuán)例如可從磺酸基提供電荷。親合性基團(tuán)包括抗體、蛋白A等的配體-結(jié)合區(qū)。通過(guò)改變包圍該第一功能基的局部環(huán)境，可增強(qiáng)生物分子或細(xì)胞在載體上的吸附。接著，吸附于基底上的生物分子或細(xì)胞將與第一功能基更有效地結(jié)合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法被用于增加下層載體反應(yīng)點(diǎn)的數(shù)量。例如，給出有一定數(shù)量的第一側(cè)官能團(tuán)的載體，就能制成有第二側(cè)官能團(tuán)的聚合涂層，其也有利于生物分子和細(xì)胞的結(jié)合。因此，就能形成具有更密集定位的生物分子或細(xì)胞結(jié)合基團(tuán)的基底。
本發(fā)明的基底適于結(jié)合生物分子和細(xì)胞。從而，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供使生物分子和細(xì)胞與固體載體結(jié)合的方法。該方法包括如下步驟(a)提供生物分子或細(xì)胞；(b)提供帶有表面的固體載體；(c)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法將聚合涂層沉積在表面上以形成涂覆基底，其中聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合生物分子或細(xì)胞；及(d)使該生物分子或細(xì)胞在允許該生物分子或細(xì)胞與該側(cè)官能團(tuán)結(jié)合的條件下與該涂覆基底接觸。
在足以使生物分子或細(xì)胞結(jié)合到固體載體上的條件下使其接觸而將生物分子或細(xì)胞結(jié)合到本發(fā)明的涂覆基底上。如果條件可使生物分子或細(xì)胞的外表面與聚合涂層的側(cè)官能團(tuán)反應(yīng)而使生物分子或細(xì)胞與基底共價(jià)結(jié)合，那么條件就是充分的。例如美國(guó)專(zhuān)利第6,268,141中所述的，當(dāng)側(cè)官能團(tuán)是氟化?；鶗r(shí)，生物分子如多核苷酸可通過(guò)將聚合涂層中的氟化物基團(tuán)與生物分子的親核試劑進(jìn)行置換而結(jié)合到固體載體上。
例如，5’-氨基改性的寡核苷酸可與用端基如氟化?；?、醛或環(huán)氧化物活化的表面聚合物反應(yīng)。糖蛋白的碳水化合物部分可被高碘酸鹽氧化成醛，然后與含有表面酰肼基團(tuán)的聚合載體反應(yīng)。相似地，細(xì)胞如酵母、細(xì)菌或其他微生物可經(jīng)戊二醛處理結(jié)合到固體載體上。
HeLa或3T3細(xì)胞經(jīng)過(guò)用纖維連接蛋白覆蓋的表面而進(jìn)行間接結(jié)合。纖維連接蛋白可通過(guò)戊二醛交聯(lián)進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。脂質(zhì)可通過(guò)頭部基團(tuán)的反應(yīng)共價(jià)結(jié)合到表面上。例如，具有胺(R-PO3O-CH2CH2NH3+)頭部基團(tuán)的磷脂酰乙醇胺可通過(guò)雜雙功能交聯(lián)劑如SPDP連接到硫醇活化的表面上。相反，磷脂尾部基團(tuán)可通過(guò)吸附結(jié)合到含有自組裝單層烷基鏈的聚合物表面上。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案，其中側(cè)官能團(tuán)是氟化?；?，生物分子是多核苷酸，使多核苷酸與涂覆的基底接觸的步驟在水性緩沖液存在下進(jìn)行，其pH優(yōu)選為中性或堿性。在中性或堿性pH條件下使氟化?；δ芑c多核苷酸接觸使得多核苷酸與聚合涂層表面直接結(jié)合。本發(fā)明中，堿性pH條件是指pH大于8的條件。如果堿性pH條件可使多核苷酸與固體載體結(jié)合，那么就是足夠的。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的堿性pH條件其pH約為9～12。應(yīng)該理解堿性pH條件根據(jù)所用的方法可以變化。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以結(jié)合本發(fā)明的公開(kāi)確定特定結(jié)合反應(yīng)的堿性pH條件。
本發(fā)明的涂覆基底可通過(guò)本領(lǐng)域中公知的方法與生物分子和細(xì)胞接觸。例如，接觸步驟可通過(guò)螺線管或壓電驅(qū)動(dòng)的非接觸噴墨印刷來(lái)實(shí)現(xiàn)?？蛇x擇地，可以使用實(shí)心或開(kāi)放毛細(xì)裝置接觸印刷、微流體通道印刷、絲綢篩選及使用以電化學(xué)或電磁力為基礎(chǔ)的印刷裝置技術(shù)。
也可通過(guò)手動(dòng)點(diǎn)樣使涂覆基底與生物分子接觸。手動(dòng)點(diǎn)樣的實(shí)例包括但不限于用移液管或Biomek針工具進(jìn)行手動(dòng)點(diǎn)樣。在這種情況下，優(yōu)選的水性堿可以是pH為9～10的碳酸氫鈉和碳酸鈉。在另一個(gè)實(shí)施方案中，固體載體通過(guò)噴墨印刷技術(shù)與未改性的多核苷酸接觸。利用商業(yè)可得到的噴墨印刷機(jī)的熱噴墨印刷技術(shù)和美國(guó)專(zhuān)利第4,877,745號(hào)中所述的壓電微噴墨印刷技術(shù)可被用于將未改性的多核苷酸點(diǎn)到固體載體上。在這種情況下，水性堿可以是pH約為10～12的LiCl鹽溶液。
應(yīng)該理解本發(fā)明的涂覆基底可通過(guò)任何方法與生物分子或細(xì)胞接觸，只要可使生物分子或細(xì)胞與固體載體接觸。應(yīng)該理解這里沒(méi)有明確說(shuō)明的其他水性緩沖液體系也可用于本發(fā)明中，只要一旦相互接觸緩沖液體系就能提供使生物分子或細(xì)胞與涂覆基底結(jié)合的充分條件即可。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，水溶液中的生物分子和細(xì)胞的濃度可隨分子或細(xì)胞的類(lèi)型、其尺寸、結(jié)構(gòu)及其他影響溶解度及分子和細(xì)胞結(jié)合的因素而變化。從而，確定功能基的最優(yōu)表面密度是重要的。當(dāng)表面密度過(guò)低，結(jié)合不充分。當(dāng)表面密度過(guò)高，結(jié)合會(huì)因空間阻礙作用受到抑制。例如，當(dāng)結(jié)合的聚合物是多核苷酸時(shí)，優(yōu)選其濃度為5nM～40μM。更優(yōu)選其濃度為5nM～5μM。取決于細(xì)胞尺寸，每個(gè)點(diǎn)可結(jié)合10～1000個(gè)細(xì)胞。相似地，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)很容易確定結(jié)合其他生物分子的最優(yōu)表面密度。
根據(jù)本發(fā)明，在使生物分子或細(xì)胞與涂覆基底結(jié)合之后，優(yōu)選的是封閉未反應(yīng)的側(cè)官能團(tuán)進(jìn)一步發(fā)生不需要的反應(yīng)。本發(fā)明中，固體載體或聚合涂層中的側(cè)官能團(tuán)可通過(guò)可阻止剩余反應(yīng)基團(tuán)活動(dòng)的任何化學(xué)方法來(lái)封閉。例如，未反應(yīng)的氟化?；δ芑膳c氫氧化銨反應(yīng)形成碳酰胺或與乙醇反應(yīng)形成酯。然而，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以理解阻止反應(yīng)是可能的。
如上所述，利用固定的生物分子和細(xì)胞的許多應(yīng)用要求在固體載體表面上的位置特異性位置固定生物分子和細(xì)胞。為制備有序的生物分子和細(xì)胞陣列(包括固體的生物分子或細(xì)胞的柵格和1×n陣列，其中每個(gè)生物分子或細(xì)胞位于位置特異性的位置)，在涂覆基底表面上預(yù)選擇的位置需與所需要的生物分子或細(xì)胞的溶液接觸。根據(jù)本發(fā)明，這一點(diǎn)可通過(guò)將生物分子或細(xì)胞溶液涂覆到涂覆基底上的預(yù)選擇位置來(lái)手動(dòng)實(shí)現(xiàn)?？蛇x擇地，利用商業(yè)可得到的噴墨印刷機(jī)的熱噴墨印刷技術(shù)和美國(guó)專(zhuān)利第4,877,745號(hào)中所述的壓電微噴墨印刷技術(shù)可被用于為選擇的生物分子或細(xì)胞選擇涂覆基底表面位置。
將生物分子和細(xì)胞與本發(fā)明的涂覆基底結(jié)合適用于基因傳感器和其他陣列基系統(tǒng)，如微分基因表達(dá)生物芯片。因此，本發(fā)明的另一方面提供通過(guò)包括如下步驟的方法制得的生物陣列
(a)提供多個(gè)生物分子或細(xì)胞；(b)提供帶有表面的固體載體；(c)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法將聚合涂層沉積在載體的表面上以形成涂覆基底，其中聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合生物分子或細(xì)胞；及(d)使該生物分子或細(xì)胞在允許該生物分子或細(xì)胞與在不連續(xù)位置處的該側(cè)官能團(tuán)結(jié)合的條件下與該涂覆基底上的不連續(xù)位置接觸，從而形成生物陣列。
本發(fā)明結(jié)合有生物分子的固體載體可用作實(shí)施配體結(jié)合分析或?qū)嵤╇s交分析(通過(guò)反向雜交(探針結(jié)合)或核酸雜交技術(shù)(目標(biāo)結(jié)合))的裝置。這種裝置也可用于免疫分析中。在生物醫(yī)學(xué)研究中利用生物陣列的方法對(duì)于本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員也是公知的，因而在此沒(méi)有進(jìn)行討論。
下面的實(shí)例用于闡明也不是限制本發(fā)明的范圍。盡管這些實(shí)施例是典型的，但是本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以選擇性地利用其他公知的過(guò)程。實(shí)際上，本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以根據(jù)本文的教導(dǎo)不經(jīng)額外的實(shí)驗(yàn)而制定出其他實(shí)施方案。
實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)RFPD-CVD法在聚丙烯薄片或載玻片上沉積丙烯酸或乙烯基乙酸的聚合涂層將洗凈的載玻片和/或聚丙烯聚合物薄片放置在等離子體室中。將材料用RFPD(射頻等離子體放電)引發(fā)的氧等離子體(～150至～180毫乇O(jiān)2；～450至～500瓦，RF功率，3分鐘)，然后立即將丙烯酸(或乙烯基乙酸)單體氣溶膠輸送到含有氬氣(～240毫乇Ar；500瓦，RF功率，3分鐘)的氣體室中。等離子體聚合過(guò)程在氬氣中猝滅(～165毫乇Ar；0瓦，RF功率，3分鐘)。從等離子室中取出涂覆的材料，并存放在密封的聚酯袋中。
在不同功率水平下重復(fù)丙烯酸(AA)和乙烯基乙酸(VA)的聚合涂層的沉積，從而確定本發(fā)明新方法的最優(yōu)化條件。對(duì)于AA聚合，設(shè)置功率水平如下方法1(500W)，方法2(250W)和方法3(300W)。對(duì)于VA聚合，設(shè)置功率水平如下方法4(500W)，方法5(250W)和方法6(300W)。
實(shí)施例2利用現(xiàn)有技術(shù)中RFPD/NH3方法制備固定生物分子的基底將聚丙烯聚合物薄片放置在RFPD等離子體室中。排空等離子體室，充入無(wú)水氨氣(～250毫乇，NH3，4分鐘)。在200瓦的RF功率下在氨氣(～300毫乇)中引發(fā)RFPD 2分鐘。停止能量，基底用氨氣(～250毫乇，2分鐘)猝滅，然后用氬氣(～265毫乇)猝滅10分鐘。從等離子體室中取出表面氨化的材料，并存放在密封的聚酯袋中。
實(shí)施例3將本發(fā)明涂覆的基底與現(xiàn)有技術(shù)氨化的基底結(jié)合生物分子的能力進(jìn)行比較使用丙烯酸單體或乙烯基乙酸單體通過(guò)RFPD-CVD方法涂覆聚丙烯載片、顯顯微板和載玻片。核酸和蛋白被成功地固定到這些表面上。
原聚丙烯薄片(20mm)在氨氣中通過(guò)RFPD進(jìn)行表面氨化，用琥珀酸酐引發(fā)形成羧基，并轉(zhuǎn)化成上述的氟化?；问?現(xiàn)有技術(shù)中的方法)?？蛇x擇地，原聚丙烯薄片經(jīng)過(guò)RFPD-CVD方法制得羧酸化聚合物的表面涂層，然后被轉(zhuǎn)化成氟化酰基形式。為實(shí)現(xiàn)表面活性，每一薄片用氨基生物素化合物(BAPA)印刷，從而通過(guò)氟化?；挠H核進(jìn)功形成共價(jià)結(jié)合
在用鏈霉抗生素堿性磷酸酶(AP)(pH 7.2，25℃；0.5hr)孵育后，使用酶標(biāo)記熒光(ELF)信號(hào)顯影劑(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)比較薄片的生物素-鏈霉抗生素結(jié)合。選擇穿過(guò)所有陣列中代表性熒光點(diǎn)的相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。比較每個(gè)陣列中的兩個(gè)區(qū)域[下部2×4亞陣列；右下部1×7亞陣列]，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差。RFPD-CVD涂覆方法與RFPD/NH3表面活化方法相比可明顯提高表面結(jié)合能力。
盡管前面已結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施方案詳細(xì)地進(jìn)行了說(shuō)明，但是這些不意于限制說(shuō)明書(shū)或接下來(lái)的權(quán)利要求書(shū)。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以做出修飾和改變，這些都包括在下面的權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備用于排列生物分子或細(xì)胞的基底的方法，所述方法包括如下步驟(a)提供帶有表面的固體載體；及(b)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法在所述表面上沉積聚合涂層，其中所述聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合所述生物分子或細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述聚合涂層包括羧酸化的聚合物，其中步驟(b)包括(c)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法在所述表面上沉積所述羧酸化的聚合物涂層，其中所述羧酸化的聚合涂層包含至少一個(gè)側(cè)羧基；及(d)通過(guò)將所述羧基轉(zhuǎn)化成能結(jié)合生物分子或細(xì)胞的基團(tuán)來(lái)活化所述羧酸化的聚合涂層。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述沉積步驟(c)包括(e)將羧酸化的單體和固體載體引入等離子體室中；及(f)在足以使所述羧酸化的單體自由基聚合形成羧酸化聚合物并在所述固體載體上進(jìn)一步吸附形成的羧酸化聚合物的條件下，通過(guò)在所述等離子體室中提供射頻等離子體放電(RFPD)，從而在固體載體上形成所述羧酸化的聚合涂層。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述羧酸化的單體選自丙烯酸單體、乙烯基乙酸單體、羧基硅烷單體、羧基硅烷醇單體、甲基丙烯酸酯單體、丙烯酸酯單體及其混合物。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述活化步驟包括使羧基轉(zhuǎn)化為氟化?；?。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述活化步驟還包括使羧酸化的聚合涂層與選自(二乙氨基硫)三氟化物(DAST)、氰尿酰氟及四甲基氟甲酸六氟磷酸酯的試劑反應(yīng)。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，還包括如下步驟預(yù)處理所述固體載體的表面以增強(qiáng)單體或聚合涂層的吸附。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述預(yù)處理步驟包括等離子體蝕刻或等離子體引發(fā)的表面氧化。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法通過(guò)等離子體引發(fā)的接枝來(lái)實(shí)現(xiàn)，其包括首先在氬、氦或其他稀有氣體等離子體中處理基底，然后將單體或聚合物引入所述等離子體室中，及使所述單體或聚合物與基底反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法選自化學(xué)氣相沉積(CVD)方法和等離子體引發(fā)的接枝。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括如下步驟選擇一種材料，其可給步驟(b)的聚合涂層提供表面性能，所述性能可增強(qiáng)所述側(cè)基和所述生物分子或所述細(xì)胞的結(jié)合。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述聚合涂層是疏水性的、親水性的、兩性的或其組合。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生物分子或所述細(xì)胞的外表面是疏水性的，所述選擇步驟包括選擇可給步驟(b)的聚合涂層提供疏水性性能的材料。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生物分子或所述細(xì)胞的外表面是親水性的，所述選擇步驟包括選擇可給步驟(b)的聚合涂層提供親水性性能的材料。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述生物分子或所述細(xì)胞的外表面具有陽(yáng)離子和陰離子官能度，所述選擇步驟包括選擇可給步驟(b)的聚合涂層提供能夠與所述生物分子或所述細(xì)胞發(fā)生離子相互作用的兩性性能的材料。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述側(cè)官能團(tuán)選自氟化?；?、酸酐、環(huán)氧化物、醛、酰肼、?；B氮化物、芳基疊氮化物、重氮化合物、苯甲酮、碳二亞胺、亞胺酸酯、異硫代氰酸酯、NHS酯、CNBr、馬來(lái)酰亞胺、甲苯磺酸酯、三氟乙基磺酰氯、馬來(lái)酸酐及羰基二咪唑。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述涂層包括至少兩種類(lèi)型的側(cè)官能團(tuán)，其中第一種類(lèi)型的官能團(tuán)對(duì)第一種生物分子或第一種細(xì)胞具有反應(yīng)性，第二種類(lèi)型的官能團(tuán)對(duì)第二種生物分子或第二種細(xì)胞具有反應(yīng)性。
18.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述沉積步驟(c)包括(g)掩蔽所述固體載體以形成暴露和覆蓋區(qū)域；(h)在所述暴露區(qū)域上沉積所述聚合涂層。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，還包括在所述沉積步驟之前用反應(yīng)性等離子體預(yù)處理所述暴露區(qū)域以形成表面官能團(tuán)的步驟。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，還包括用表面基團(tuán)獨(dú)立且位置特定地涂覆所述預(yù)處理的暴露區(qū)域的步驟。
21.一種用于固定生物聚合物或細(xì)胞的基底，其中所述基底按如權(quán)利要求1所述的方法制備。
22.如權(quán)利要求21所述的基底，其中所述固體載體由惰性材料構(gòu)成。
23.如權(quán)利要求21所述的基底，其中所述惰性材料選自聚合材料、陶瓷材料、金、銀、鈦、其它金屬、天然纖維、硅樹(shù)脂、玻璃及其復(fù)合材料。
24.如權(quán)利要求21所述的基底，其中所述固體載體是選自聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚砜、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯及其復(fù)合材料、摻和物、衍生物的聚合材料。
25.如權(quán)利要求21所述的基底，其中所述固體載體由多孔或非多孔材料制成。
26.如權(quán)利要求21所述的基底，其中所述固體載體是滑塊狀、薄片狀、薄膜狀、微皿板狀、珠狀、隔膜狀、泡沫狀、細(xì)絲狀、線狀或凝膠體。
27.如權(quán)利要求21所述的基底，其中所述固體載體包括具有至少一個(gè)適于結(jié)合第一種生物分子或第一種細(xì)胞的第一種側(cè)官能團(tuán)的聚合材料，所述涂層包括至少一個(gè)適于結(jié)合第二種生物分子或第二種細(xì)胞的第二種側(cè)官能團(tuán)。
28.如權(quán)利要求27所述的基底，其中所述第一種和所述第二種官能團(tuán)相同，并選自氟化?；?、酸酐、環(huán)氧化物、醛、酰肼、?；B氮化物、芳基疊氮化物、重氮化合物、苯甲酮、碳二亞胺、亞胺酸酯、異硫代氰酸酯、NHS酯、CNBr、馬來(lái)酰亞胺、甲苯磺酸酯、三氟乙基磺酰氯、馬來(lái)酸酐和羰基二咪唑。
29.如權(quán)利要求27所述的基底，其中所述第一種和所述第二種官能團(tuán)不相同，并選自氟化?；?、酸酐、環(huán)氧化物、醛、酰肼、?；B氮化物、芳基疊氮化物、重氮化合物、苯甲酮、碳二亞胺、亞胺酸酯、異硫代氰酸酯、NHS酯 、CNBr、馬來(lái)酰亞胺、甲苯磺酸酯、三氟乙基磺酰氯、馬來(lái)酸酐和羰基二咪唑。
30.如權(quán)利要求21所述的基底，其中所述聚合涂層是硅烷或硅烷醇化合物的單層。
31.如權(quán)利要求21所述的基底，其中所述聚合涂層是至少兩種硅烷或硅烷醇化合物的混合物在所述固體載體上的單層。
32.如權(quán)利要求31所述的基底，其中至少一種硅烷或硅烷醇化合物是疏水性的，且至少一種硅烷或硅烷醇化合物具有能夠結(jié)合生物分子或細(xì)胞的側(cè)官能團(tuán)。
33.如權(quán)利要求31所述的基底，其中至少一種硅烷或硅烷醇化合物是親水性的，且至少一種硅烷或硅烷醇化合物具有能夠結(jié)合生物分子或細(xì)胞的側(cè)官能團(tuán)。
34.一種用于固定生物聚合物或細(xì)胞的基底，所述基底包括由聚合材料構(gòu)成的固體載體，所述固體載體具有至少一個(gè)適合在其表面結(jié)合第一種生物分子或第一種細(xì)胞的第一種側(cè)官能團(tuán)；及沉積在所述基底表面上的聚合涂層，其中所述聚合涂層增強(qiáng)所述第一種生物分子或所述第一種細(xì)胞與所述第一官能團(tuán)的結(jié)合。
35.如權(quán)利要求34所述的基底，其中所述聚合涂層是疏水性的、親水性的、兩性的或其組合。
36.如權(quán)利要求35所述的基底，其中當(dāng)所述生物分子或所述細(xì)胞外表面是疏水性時(shí)，所述聚合涂層是疏水性的，當(dāng)所述生物分子或所述細(xì)胞外表面是親水性時(shí)，所述聚合涂層是親水性的，及所述生物分子或所述細(xì)胞外表面具有陽(yáng)離子和陰離子官能度時(shí)，所述聚合表面是兩性的。
37.如權(quán)利要求34所述的基底，其中所述涂層包括至少一個(gè)適于結(jié)合第二種生物分子或第二種細(xì)胞的第二側(cè)官能團(tuán)。
38.如權(quán)利要求37所述的基底，其中所述第一種和所述第二種官能團(tuán)相同，其中所述官能團(tuán)選自氟化?；?、酸酐及環(huán)氧化物。
39.如權(quán)利要求37所述的基底，其中所述第一種和所述第二種官能團(tuán)不相同，其中所述官能團(tuán)選自氟化酰基、酸酐及環(huán)氧化物。
40.一種使生物分子和細(xì)胞與固體載體結(jié)合的方法，所述方法包括(a)提供生物分子或細(xì)胞；(b)提供具有表面的固體載體；(c)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法將聚合涂層沉積在表面上以形成涂覆基底，其中聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合所述生物分子或細(xì)胞；及(d)使所述生物分子或細(xì)胞在使所述生物分子或細(xì)胞與所述側(cè)官能團(tuán)結(jié)合的條件下與所述涂覆基底接觸。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述生物分子選自核酸、多核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)及其類(lèi)似物。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述生物分子是多核苷酸，其選自擴(kuò)增的DNA、cDNA、單鏈DNA、雙鏈DNA、PNA、RNA及mRNA。
43.如權(quán)利要求40所述的方法，其中提供多個(gè)生物分子或細(xì)胞，其中所述接觸步驟包括使所述生物分子或細(xì)胞與側(cè)官能團(tuán)在所述涂覆基底上的不連續(xù)位置處接觸，從而形成生物陣列。
44.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述接觸步驟通過(guò)選自如下的技術(shù)手段來(lái)實(shí)現(xiàn)噴墨打印、實(shí)心或開(kāi)放毛細(xì)裝置接觸印刷、微流體通道印刷、絲網(wǎng)遮蔽法及使用基于電化學(xué)或電磁力的印刷設(shè)備的技術(shù)。
45.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述接觸步驟通過(guò)將所述生物分子或細(xì)胞點(diǎn)到所述固體載體上來(lái)進(jìn)行。
46.一種通過(guò)包括如下步驟的方法制得的生物陣列(a)提供多個(gè)生物分子或細(xì)胞；(b)提供具有表面的固體載體；(c)通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法將聚合涂層沉積在所述表面上以形成涂覆基底，其中聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合所述生物分子或細(xì)胞；及(d)使所述生物分子或細(xì)胞在使所述生物分子或細(xì)胞與所述側(cè)官能團(tuán)結(jié)合的條件下，與所述涂覆基底上的不連續(xù)位置處的側(cè)官能團(tuán)接觸，從而形成生物陣列。
47.如權(quán)利要求46所述的生物陣列，其中所述固體載體由塑料制成為平面型的，其具有由阻止流體流動(dòng)的物理?yè)醢甯糸_(kāi)的不連續(xù)的分離區(qū)域，其中所述區(qū)域是孔狀、槽狀、底座狀、疏水性或親水性片狀或沖切粘合貯液器狀。
48.如權(quán)利要求47所述的生物陣列，其中所述固體載體是微塊板。
49.如權(quán)利要求46所述的生物陣列，其中所述固體載體是滑塊狀、薄片狀、薄膜狀、微皿板狀、珠狀、隔膜狀、泡沫狀、細(xì)絲狀、線狀或凝膠體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了制備用于排列和固定生物分子或細(xì)胞的基底的方法。該方法包括提供固體載體及通過(guò)化學(xué)等離子體介導(dǎo)的聚合方法在該表面上沉積聚合涂層。該聚合涂層包括至少一個(gè)側(cè)官能團(tuán)，其能結(jié)合該生物分子或細(xì)胞。優(yōu)選以這樣的方式選擇聚合涂層材料以使其表面性能可增強(qiáng)側(cè)基和生物分子或細(xì)胞間的結(jié)合。本發(fā)明也提供用于固定生物分子和細(xì)胞的基底。該基底包括由聚合材料組成的固體載體。該固體載體具有至少一個(gè)適合在其表面結(jié)合第一種生物分子或第一種細(xì)胞的第一種側(cè)官能團(tuán)。該基底還包括沉積在該基底表面上的聚合涂層。該聚合涂層增強(qiáng)了該第一種生物分子或該第一種細(xì)胞與該第一官能團(tuán)的結(jié)合。
文檔編號(hào)G01N37/00GK1649887SQ03809321
公開(kāi)日2005年8月3日 申請(qǐng)日期2003年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月23日
發(fā)明者羅伯特·S·馬特森 申請(qǐng)人:貝克曼考爾特公司