適用于細(xì)胞培養(yǎng)物的聚合物的制作方法【專利說明】適用于細(xì)胞培養(yǎng)物的聚合物[0001]本發(fā)明設(shè)及制備適用于細(xì)胞培養(yǎng)物的聚合物的方法。本發(fā)明還設(shè)及細(xì)胞培養(yǎng)物用于制造前血管（prevas州Iar)系統(tǒng)的用途。[0002]迄今為止，細(xì)胞培養(yǎng)物凝膠材料可從天然來源中分離或者完全合成。凝膠例如膠原固有地產(chǎn)生片層結(jié)構(gòu)，其不能單獨(dú)形成復(fù)雜的3D網(wǎng)絡(luò)。凝膠例如來源于EHS小鼠肉瘤細(xì)胞的那些凝膠比純膠原更類似于在組織中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞外環(huán)境，并且還提供細(xì)胞可在其中生長(zhǎng)和組裝成復(fù)雜體系結(jié)構(gòu)的=維環(huán)境。天然來源的凝膠劑難W充分表征并且需要密集的批次間分析W實(shí)現(xiàn)運(yùn)種表征，生物來源的凝膠遭受固有的變異性、污染和病原體傳遞的風(fēng)險(xiǎn)W及過度的溢價(jià)。對(duì)于許多研究小組，額外的痕量污染例如固有地存在于生物來源材料中的不想要的生長(zhǎng)因子是不能接受的實(shí)驗(yàn)干擾且對(duì)于體內(nèi)使用而言是不能接受的。另一方面，合成來源的凝膠例如衍生自聚(N-異丙基丙締酷胺)共聚物的那些凝膠展示出低的細(xì)胞存活率和細(xì)胞分化能力，運(yùn)需要額外的生物活性物例如糖皮質(zhì)激素和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子e(TGF-e)的混合物。合成凝膠劑的使用在很大程度上除去了在生物凝膠劑中發(fā)現(xiàn)的自然變異，但同時(shí)也消除了天然凝膠的固有生物活性。消除生物變異性同時(shí)保留生物活性的能力是尚未完全實(shí)現(xiàn)的挑戰(zhàn)。[0003]收獲在運(yùn)些凝膠中形成的復(fù)雜生物系統(tǒng)的能力也仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)上，必須通過使用膜蛋白酶從生物表面釋放細(xì)胞或者將凝膠機(jī)械溶解或手動(dòng)從結(jié)構(gòu)表面除去。[0004]上文展示的可凝膠化的（gelatable)結(jié)構(gòu)在自然界中并不普遍且不能在體內(nèi)W微創(chuàng)方式簡(jiǎn)單應(yīng)用。存在能夠通過冷卻導(dǎo)管W微創(chuàng)方式應(yīng)用的熱響應(yīng)性材料的一些實(shí)例，例如US2010/0215731Al中公開的那些。然而，運(yùn)些材料遭受與上文所述相同的缺點(diǎn)，從而導(dǎo)致差的細(xì)胞存活率。[0005]機(jī)械地，所有生物來源凝膠的性質(zhì)由膚亞基的非共價(jià)相互作用決定。結(jié)果是孔徑和機(jī)械強(qiáng)度相對(duì)固定。在合成得到的凝膠的情況下，機(jī)械性質(zhì)和交聯(lián)屬性甚至更加固定。[0006]WO2011/007012公開了一種水凝膠，其包含低聚（亞烷基二醇）官能化的聚異氯膚。聚異氯膚(9〇1如30。7日11〇9691：1(163)是通過利用低聚(亞烷基二醇)側(cè)鏈?zhǔn)巩惵饶w官能化并隨后使低聚-亞烷基二醇-官能化的異氯膚聚合來制備的。WO2011/007012建議使用水凝膠用于組織工程或神經(jīng)元再生。[0007]雖然已知的細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)于一些應(yīng)用是令人滿意的，但本領(lǐng)域中對(duì)可被用于大范圍情景的細(xì)胞培養(yǎng)物的需求仍在增加。[000引本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供細(xì)胞培養(yǎng)物和用于細(xì)胞培養(yǎng)物的聚合物，其中上文提到的和/或本領(lǐng)域中的其它需求被滿足。[0009]根據(jù)一個(gè)方面，本發(fā)明提供了制造低聚（亞烷基二醇）官能化的共聚異氯膚的方法，其中所述方法包括W下步驟：[0010]i)使[0011]-用聯(lián)結(jié)基團(tuán)接枝的低聚(亞烷基二醇)官能化的異氯膚的第一共聚單體和[0012]-未接枝的低聚(亞烷基二醇)官能化的異氯膚的第二共聚單體[0013]共聚，[0014]其中第一共聚單體與第二共聚單體之間的摩爾比為1:500-1:30,和[0015]ii)向通過步驟i)得到的共聚物中加入細(xì)胞粘附因子和間隔單元的反應(yīng)物，其中間隔單元由通式A-L-B代表，其中聯(lián)結(jié)基團(tuán)和基團(tuán)A被選擇W反應(yīng)和形成第一偶聯(lián)，并且細(xì)胞粘附因子和基團(tuán)B被選擇W反應(yīng)和形成第二偶聯(lián)，其中第一偶聯(lián)和第二偶聯(lián)獨(dú)立地選自由烘控-疊氮化物偶聯(lián)、二苯并環(huán)辛烘-疊氮化物偶聯(lián)、氧雜降冰片二締基-疊氮化物偶聯(lián)、乙締基諷-硫醇偶聯(lián)、馬來酷亞胺-硫醇偶聯(lián)、甲基丙締酸甲醋-硫醇偶聯(lián)、酸偶聯(lián)、硫酸偶聯(lián)、生物素-鏈霉親和素（S化epavidin)偶聯(lián)、產(chǎn)生酷胺鍵的胺-簇酸、產(chǎn)生醋鍵的醇-簇酸偶聯(lián)和畑S-S旨(N-徑基班巧酷亞胺醋)-胺偶聯(lián)組成的組，且[0016]其中基團(tuán)L是線性鏈段，其主鏈中具有10-60個(gè)選自C、N、0和S的原子之間的鍵。[0017]聯(lián)結(jié)基團(tuán)和基團(tuán)A被選擇W反應(yīng)和形成第一偶聯(lián)，所述第一偶聯(lián)可W是W上列表中提到的任何偶聯(lián)。例如，為了獲得烘控-疊氮化物偶聯(lián)，聯(lián)結(jié)基團(tuán)可W是烘控且基團(tuán)A可W是疊氮化物，或者聯(lián)結(jié)基團(tuán)可W是疊氮化物且基團(tuán)A可W是烘控。W上列表中提到的偶聯(lián)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的且偶聯(lián)的形成可在教科書中找到。例如，N此-COOH偶聯(lián)可通過抓C介導(dǎo)。[0018]優(yōu)選地，第一偶聯(lián)是烘控-疊氮化物偶聯(lián)。[0019]類似地，細(xì)胞粘附因子和基團(tuán)B被選擇W反應(yīng)和形成第二偶聯(lián)，所述第二偶聯(lián)可W是W上列表中提到的任何偶聯(lián)。優(yōu)選地，第二偶聯(lián)是NHS-醋(N-徑基班巧酷亞胺醋)-胺偶聯(lián)或者馬來酷亞胺-硫醇偶聯(lián)。運(yùn)可W是NHS-醋與細(xì)胞粘附因子(多膚）的N端的偶聯(lián)或者馬來酷亞胺與細(xì)胞粘附因子(多膚)的末端硫醇的偶聯(lián)。[0020]基團(tuán)L是具有連接反應(yīng)基團(tuán)A和B的線性鏈的區(qū)段。該區(qū)段由一系列選自C、N、0和S的原子形成。連接到基團(tuán)A和B的主鏈中原子之間的鍵的數(shù)目為至少10個(gè)且至多60個(gè)。術(shù)語"主鏈"被理解為表示W(wǎng)最短距離連接基團(tuán)A和B的鏈。連接到末端基團(tuán)A和B的主鏈中原子之間的鍵的數(shù)目?jī)?yōu)選地為至少12個(gè)，更優(yōu)選地至少15個(gè)。連接到末端基團(tuán)A和B的主鏈中原子之間的鍵的數(shù)目?jī)?yōu)選地為至少50個(gè)，更優(yōu)選地至少40個(gè)。[0021]已發(fā)現(xiàn):共聚物骨架和細(xì)胞粘附因子之間一定的最小距離是培養(yǎng)附著于細(xì)胞粘附因子的細(xì)胞所必需的。已發(fā)現(xiàn)所給出的至少10個(gè)鍵的距離是必要的，運(yùn)通過存在根據(jù)本發(fā)明的間隔單元來提供。已發(fā)現(xiàn)低于10個(gè)鍵的長(zhǎng)度不允許充分的細(xì)胞生長(zhǎng)。[0022]基團(tuán)L的優(yōu)選實(shí)例如下：[0024]其中P為1-10,優(yōu)選地為2-5，[0026]其中q為1-9,優(yōu)選地為2-5，[0028]其中r為1-10,優(yōu)選地為2-5。[0029]當(dāng)間隔單元包含運(yùn)些類型的基團(tuán)L時(shí)，能夠保證特別穩(wěn)定的細(xì)胞生長(zhǎng)而不依賴于聯(lián)結(jié)基團(tuán)、細(xì)胞粘附因子、和基團(tuán)A和B的類型和大小。[0030]根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供通過根據(jù)本發(fā)明的方法能夠得到的低聚(亞烷基二醇）官能化的共聚異氯膚。[0031]根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供包含水凝膠的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述水凝膠包含濃度為1.2-3.Omg/mL的低聚(亞烷基二醇館能化的共聚異氯膚，其中通過W下步驟來制造所述共聚異氯膚：[0032]i)使[0033]-用聯(lián)結(jié)基團(tuán)接枝的低聚(亞烷基二醇)官能化的異氯膚的第一共聚單體和[0034]-未接枝的低聚(亞烷基二醇)官能化的異氯膚的第二共聚單體[00對(duì)共聚，[0036]其中第一共聚單體與第二共聚單體之間的摩爾比為1:500-1:30,和[0037]ii)向通過步驟i)得到的共聚物中加入細(xì)胞粘附因子和間隔單元的反應(yīng)物，其中間隔單元由通式A-L-B代表，其中聯(lián)結(jié)基團(tuán)和基團(tuán)A被選擇W反應(yīng)和形成第一偶聯(lián)，且細(xì)胞粘附因子和基團(tuán)B被選擇W反應(yīng)和形成第二偶聯(lián)，其中第一偶聯(lián)和第二偶聯(lián)獨(dú)立地選自由烘控-疊氮化物偶聯(lián)、二苯并環(huán)辛烘-疊氮化物偶聯(lián)、氧雜降冰片二締基-疊氮化物偶聯(lián)、乙締基諷-硫醇偶聯(lián)、馬來酷亞胺-硫醇偶聯(lián)、甲基丙締酸甲醋-硫醇偶聯(lián)、酸偶聯(lián)、硫酸偶聯(lián)、生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)、產(chǎn)生酷胺鍵的胺-簇酸、產(chǎn)生醋鍵的醇-簇酸偶聯(lián)和NHS-醋(N-徑基班巧酷亞胺醋)-胺偶聯(lián)組成的組，且[003引其中基團(tuán)L是線性鏈段，其主鏈中具有10-60個(gè)選自C、N、0和S的原子之間的鍵。[0039]發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn):僅在特定濃度的細(xì)胞粘附因子下能實(shí)現(xiàn)最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)，其中所述細(xì)胞粘附因子被置于距離構(gòu)建水凝膠的=維結(jié)構(gòu)的聚合物骨架有一定距離。[0040]如果細(xì)胞粘附因子的濃度過低，則細(xì)胞不會(huì)充分粘附于水凝膠，運(yùn)反過來不允許細(xì)胞被培養(yǎng)。如果細(xì)胞粘附因子的濃度過高，則細(xì)胞在凝膠中不生長(zhǎng)。[0041]第一共聚單體是用聯(lián)結(jié)基團(tuán)接枝的低聚(亞烷基二醇)官能化的異氯膚。聯(lián)結(jié)基團(tuán)的優(yōu)選實(shí)例包括疊氮化物（例如，氧雜降冰片二締基-疊氮化物）、烘控(例如，二苯并環(huán)辛烘）、硫醇、乙締基諷、馬來酷亞胺、甲基丙締酸甲醋、酸、生物素、鏈霉親和素、NH2、C00H、0H、N服-醋。特別優(yōu)選的是疊氮化物。[0042]式(I)中顯示了第一共聚單體的一個(gè)實(shí)例，其中聯(lián)結(jié)基團(tuán)是疊氮化物。[0044]第二共聚單體是未用聯(lián)結(jié)基團(tuán)或其它基團(tuán)接枝的低聚（亞烷基二醇）官能化的異氯膚，即異氯膚的側(cè)鏈由低聚(亞烷基二醇)組成。式（II)中顯示了第二共聚單體的一個(gè)實(shí)例。[0046]第一共聚單體和第二共聚單體在步驟（i)中共聚。獲得了低聚（亞烷基二醇）官能化的共聚異氯膚，其包含W第一共聚單體和第二共聚單體的比例包含該聚合物的聯(lián)結(jié)基團(tuán)。[0047]細(xì)胞粘附因子通過間隔單元粘附于共聚物。首先制造細(xì)胞粘附因子和間隔單元的反應(yīng)物。式(III)中顯示了間隔單元的一個(gè)實(shí)例[0049]其中P為1-10。[0050]在運(yùn)個(gè)實(shí)例中，基團(tuán)A是[0化2]基團(tuán)B是[0054]基團(tuán)L是[0056]式（IV)中顯示了細(xì)胞粘附因子的一個(gè)實(shí)例，其是由甘氨酸、1^-精氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸和絲氨酸組成的五膚(GRGDS)。[0058]式(V)中顯示了式(III)的間隔單元和式(IV)的細(xì)胞粘附因子的反應(yīng)物。[0060]在本發(fā)明的步驟ii)中，使間隔單元和細(xì)胞粘附因子的反應(yīng)物(例如，式(V))與通過步驟i)獲得的共聚物反應(yīng)。聯(lián)結(jié)基團(tuán)與對(duì)應(yīng)于間隔單元的那部分反應(yīng)物反應(yīng)。因此，最終的共聚異氯膚包含W第一共聚單體和第二共聚單體的比例沿著該聚合物的細(xì)胞粘附單元。最終的共聚異氯膚的一個(gè)實(shí)例由式(VI)代表：[0062]其中m:n是第一共聚單體和第二共聚單體的配比。[0063]通過使用間隔單元，細(xì)胞粘附單元被置于距離異氯膚聚合物骨架一定距離。[0064]水凝膠由通過利用合適的細(xì)胞培養(yǎng)基膠凝得到的共聚物制成。水凝膠是=維水凝膠。水凝膠中的聚合物濃度為1.2-3.Omg/mL。如果水凝膠中的聚合物濃度過低，則細(xì)胞不會(huì)粘附于水凝膠。如果水凝膠中的聚合物濃度過高，則水凝膠變得太過堅(jiān)硬從而使細(xì)胞不能在凝膠中移動(dòng)和生長(zhǎng)。[0065]優(yōu)選地，水凝膠在35°C下通過板-板流變學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)量的彈性模量為10-5000Pa、優(yōu)選地100-1000化。運(yùn)允許細(xì)胞移動(dòng)和生長(zhǎng)W形成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和3D結(jié)構(gòu)，如例如前血管系統(tǒng)。[0066]本發(fā)明提供了水凝膠細(xì)胞培養(yǎng)物，所述水凝膠具有選擇性的剛度和溫度響應(yīng)性W及可控的空間分布和細(xì)胞粘附點(diǎn)的密度。共聚導(dǎo)致細(xì)胞粘附基團(tuán)W第一共聚單體和第二共聚單體的比例沿著聚合物統(tǒng)計(jì)分布。第一共聚單體和第二共聚單體的配比可被調(diào)節(jié)W控制沿著聚異氯膚的聚合物骨架的細(xì)胞粘附因子之間的距離。沿著聚合物骨架的細(xì)胞粘附因子之間的平均距離可W例如為1.1-60皿。細(xì)胞粘附因子之間的運(yùn)種距離范圍適合將待被培養(yǎng)的細(xì)胞錯(cuò)固到細(xì)胞培養(yǎng)物上。更優(yōu)選地，細(xì)胞粘附因子之間的平均距離為8-30nm。[0067]水凝膠可包含各種細(xì)胞培養(yǎng)基，且細(xì)胞培養(yǎng)物已顯示出介導(dǎo)復(fù)雜生物支架的形成。[0068]根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物極其有益，因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞易于收集。細(xì)胞培養(yǎng)物中所使用的水凝膠具有熱響應(yīng)特征，即，它通過被冷卻至低于膠凝溫度的溫度而變成液體。因此，通過僅冷卻細(xì)胞培養(yǎng)物即可收集培養(yǎng)的細(xì)胞。水凝膠變成液體之后，可從液體中收集細(xì)胞而不損害培養(yǎng)的細(xì)胞。[0069]人們認(rèn)為細(xì)胞粘附因子不能直接粘附于低聚-亞烷基二醇官能化的異氯膚W保持充分的結(jié)合。運(yùn)通過使用根據(jù)本發(fā)明的間隔物而被解決。根據(jù)本發(fā)明所使用的間隔單元將細(xì)胞粘附因子與異氯膚的聚合物骨架分開W消除空間粘連(blocking)。間隔物使細(xì)胞粘附因子的移動(dòng)與聚合物骨架解偶聯(lián)，使移動(dòng)解偶聯(lián)允許細(xì)胞粘附因子有效進(jìn)入整合素結(jié)合囊(pocket)。間隔物應(yīng)該有極性、水溶性、生物相容性且當(dāng)前第1頁1 2 3 4 5 6