構(gòu)型為7S，8R。結(jié)合HSQC 譜(見圖5)對所有的碳氨信號進(jìn)行了歸屬（見表1)，綜合ROSEY譜(見圖6)和Hi-Hi COSY(見 圖7)等相關(guān)譜最終確定化合物的結(jié)構(gòu)，命名為5 甲氧基肥牛木素，其主要HMBC相關(guān)和化合 物編號見圖8。
[0023] 表1化合物的核磁數(shù)據(jù)（気代甲醇，Ih-NMR 400 MHz, Uc-NMR IOOMHz)
實施例3，本發(fā)明化合物體外抗服V-1、EV71和RSV檢測 1.材料 1.1毒株單純瘤疹病毒1型化SV-I )、腸道病毒71型(EV71)和呼吸道合胞病毒(RSV)， 中國科學(xué)院武漢病毒所傳代保存； 1.2細(xì)胞模型猴腎細(xì)胞系Vero和化P-2細(xì)胞，均由本實驗室傳代保存。培養(yǎng)條件分別 為：DMEM+10%胎牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清，37°C，5% C〇2。
[0024] 原理和方法 2.1藥物的細(xì)胞毒性檢測 實驗原理:alamarBlue ?是一種氧化還原指示劑，能根據(jù)代謝活性產(chǎn)生吸光度變化和 巧光信號。alamarBlue ?易溶于水，其氧化形式進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)線粒體酶還原產(chǎn)生可測量的 巧光及顏色變化，用于細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖的定量分析W及體外細(xì)胞毒性研究。運(yùn)種測定 是基于具有代謝活性的細(xì)胞將試劑轉(zhuǎn)換成巧光和比色指示劑的能力，受損和無活性細(xì)胞具 有較低的天然代謝活性，對應(yīng)的信號較低。因此巧光信號強(qiáng)弱，可W反映細(xì)胞活性的高低。
[0025] 方法步驟:Vero細(xì)胞和化P-2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后備用。將 藥物從起始濃度80 yM連續(xù)3倍梯度稀釋6個梯度。加藥培養(yǎng)后，光鏡下觀察藥物引起的細(xì)胞 病變效應(yīng)(CPE)，加入alamarBlue ?，37°C解育化，巧光檢測alamarBlue ?的還原情況，激發(fā) 光570nm，發(fā)射光595nm。
[00%]細(xì)胞活性(％)=(樣品孔-空白對照)/ (細(xì)胞對照-空白對照)* 100%。
[0027] 藥物對服V-I、EV71和RSV的抑制試驗 2.2.1藥物對服V-I的抑制試驗 實驗原理:HSV-I感染Vero細(xì)胞后，感染細(xì)胞會發(fā)生固縮、互相融合、形成葡萄串狀或星 狀等病變，通過觀察CPE和檢測細(xì)胞存活率可W判斷藥物對病毒復(fù)制的抑制情況。
[00%]實驗步驟:Vero細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長成單層后加入100 UL含2 倍量藥物的維持培養(yǎng)基和100 Ul DMEM稀釋的病毒液，37°C培養(yǎng)。每天觀察并記錄細(xì)胞出現(xiàn) 特異性CPE情況，培養(yǎng)72h后(病毒對照孔100%病變)檢測細(xì)胞存活率。
[0029] 實驗設(shè)細(xì)胞對照組(無病毒感染），病毒對照組(病毒感染后未加藥物孔），陽性藥 物(更昔洛韋)對照孔。
[0030] 抑制率(％)=(藥物組-病毒對照組)/(細(xì)胞對照組-病毒對照組)*100% 2.2.2藥物對EV71的抑制試驗 含報告基因 GFP的EV71感染Vero細(xì)胞后，感染細(xì)胞會表達(dá)綠色巧光蛋白，通過在巧光顯 微鏡下觀察表達(dá)GFP綠色巧光的細(xì)胞數(shù)目，就可W反映出EV71病毒的增殖情況。
[0031] 方法步驟： Vero細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后備用。藥物從4倍最高測試濃度起連續(xù) 3倍梯度稀釋6個梯度;將稀釋好的藥物加入孔中，4h后加入病毒上清液進(jìn)行感染，置于37 °C 細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2地，在巧光顯微鏡下拍照，對巧光細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。
[0032] 實驗設(shè)無藥物對照孔(病毒感染后未加藥物孔），陽性藥物對照孔(鹽酸脈G地C1)。
[0033] 抑制率(％)=(無藥物對照孔-樣品孔)/無藥物對照孔X 100% 2.2.3藥物對RSV的抑制試驗 Hep-2細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后備用。待細(xì)胞長成單層后加入IOOul 含2x藥物的維持培養(yǎng)基和IOOul RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋的病毒液，37°C培養(yǎng)。每天觀察并記 錄細(xì)胞出現(xiàn)特異性CPE情況，培養(yǎng)5 d后（病毒對照孔75%~100%病變)檢測細(xì)胞活力。
[0034] 實驗設(shè)細(xì)胞對照組(無病毒感染），病毒對照組(病毒感染后未加藥物孔)和陽性藥 物(利己韋林)對照孔。
[0035] 抑制率(％)=(藥物組-病毒對照組)/(細(xì)胞對照組-病毒對照組)* 100% 3.結(jié)果 3.1藥物樣品對Vero細(xì)胞的毒性檢測及對HSV-I抑制活性檢測 藥物樣品稀釋所用溶劑，最高溶解濃度，最高測試濃度，CCso ,ECso W及SI (選擇指數(shù))如 表2所示。
[0036] 表2實驗結(jié)果
3.2藥物樣品對Vero細(xì)胞的毒性檢測及對EV71抑制活性檢測 藥物樣品稀釋所用溶劑，最高溶解濃度，最高測試濃度，CCso ,ECso W及SI (選擇指數(shù))如 表3所示。
[0037] 表3實驗結(jié)果
3.3藥物樣品對化P-2細(xì)胞的毒性檢測及對RSV抑制活性檢測 藥物樣品稀釋所用溶劑，最高溶解濃度，最高測試濃度，CCso, ECsoW及SI(選擇指數(shù))如 表4所不。
[0038] 表4實驗結(jié)果
4.結(jié)論 本發(fā)明化合物無細(xì)胞毒性，其抗HSV-I病毒、腸道病毒71型(EV71)和呼吸道合胞病毒 (RSV)的SI值分別為大于7.8、10.3和17.5，顯示其對單純瘤疹病毒1型(HSV-I)、腸道病毒 71型(EV71)和呼吸道合胞病毒(RSV)具有一定的抑制作用。
[0039] 實施例4, 一種用于治療病毒感染的藥物組合物 采用實施例2所制得的結(jié)構(gòu)式（I)所示的木脂素類化合物，加上藥學(xué)上可接受的載體， 制成藥物組合物。所述的載體選自稀釋劑、賦形劑、水、填充劑粘合劑、潤濕劑、崩解劑、吸收 促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、香味劑或者甜味劑等中的至少一種。
[0040] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和潤飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種木脂素類化合物，其結(jié)構(gòu)如式I所示：(1)02. -種如權(quán)利要求1所述的木脂素類化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 取熱毒寧注射液成品，經(jīng)HP-20大孔吸附樹脂柱色譜分離，依次以水、25~35%乙醇、 90~100%乙醇梯度洗脫，分別收集各洗脫液，減壓濃縮至無醇味，得到水洗脫部位、25~ 35%乙醇洗脫部位、90~100%乙醇洗脫部位； (2) 取步驟（1)的90~100%乙醇洗脫部位，經(jīng)硅膠柱色譜分離，用氯仿-甲醇梯度洗脫， 收集氯仿-甲醇比例為9:1的餾分C，餾分C經(jīng)0DS柱色譜分離，用甲醇-水梯度洗脫，收集甲 醇-水比例為4:6的餾分D，餾分D經(jīng)半制備液相HPLC分離，得到結(jié)構(gòu)如式(I)所示的目標(biāo)產(chǎn)物 木脂素類化合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)所述半制備液相色譜，以比例 為45:55的甲醇-水為流動相，檢測波長為254 nm，流速4 mL/min，在半制備液相上的保留時 間為14.4 min。4. 權(quán)利要求1所述化合物在制備抗病毒感染藥物中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述抗病毒藥物為用于抗單純皰疹病毒1 型、腸道病毒71型或者呼吸道合胞病毒感染的藥物。6. -種用于治療病毒感染的藥物，其特征在于：該藥物包含權(quán)利要求1所述的、或者權(quán) 利要求2或3所述制備方法制得的結(jié)構(gòu)如式(I)所示的木脂素類化合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于治療病毒感染的藥物，其特征在于:所述的病毒感染為單 純皰疹病毒1型、腸道病毒71型或者呼吸道合胞病毒感染。8. -種用于治療病毒感染的藥物組合物，其特征在于：該藥物包含權(quán)利要求1所述的、 或者權(quán)利要求2或3所述制備方法制得的結(jié)構(gòu)如式（I)所示的木脂素類化合物，以及藥學(xué)上 可接受的載體。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于治療病毒感染的藥物組合物，其特征在于:所述的病毒感 染為單純皰疹病毒1型、腸道病毒71型或者呼吸道合胞病毒感染。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種木脂素類化合物及其制備方法和應(yīng)用。木脂素類化合物的制法如下：（1）取熱毒寧注射液成品，經(jīng)HP-20大孔吸附樹脂柱色譜分離，依次以水、25~35％乙醇、90～100％乙醇梯度洗脫，分別收集各洗脫液，濃縮，得到90～100％乙醇洗脫部位；（2）90～100%乙醇洗脫部位，依次經(jīng)硅膠柱色譜，ODS柱色譜分離，半制備液相HPLC分離，得到本發(fā)明化合物。本發(fā)明所述化合物可用于抗單純皰疹病毒1型、腸道病毒71型和呼吸道合胞病毒感染。本發(fā)明從熱毒寧注射液成品中提取得到一種新的木脂素類化合物，該化合物具有較為顯著的抗病毒作用；同時，本發(fā)明公開的木脂素類化合物的制備方法操作簡單，可控性強(qiáng)，穩(wěn)定性好。
【IPC分類】A61P31/22, C07D307/80, A61K31/343, A61P31/12
【公開號】CN105669617
【申請?zhí)枴緾N201610123629
【發(fā)明人】蕭偉, 李海波, 姚新生, 房卉, 李夢璇, 孟兆青, 黃文哲, 丁崗, 王振中
【申請人】江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年3月4日...