力單位。
[0048] 在實(shí)施例中，當(dāng)CPC的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%，即認(rèn)為一批次反應(yīng)結(jié)束。用去離子水清洗 固定化CPC?；?，便可重復(fù)利用于下一批次轉(zhuǎn)化。當(dāng)在相同反應(yīng)條件下批反應(yīng)時(shí)間為第 一批反應(yīng)時(shí)間的2倍時(shí)即認(rèn)為達(dá)到半衰期，停止催化。
[0049] 對(duì)比例1 :整個(gè)催化討稈中恒淵（10°C )催化
[0050] 固宙化CPC?；傅闹苽?在約20g EPC載體中，按400U/g投酶量加入CPC?；?酶和兩倍酶液體積的1. 25M磷酸鈉緩沖液（pH8. 0)，使磷酸鈉緩沖液終濃度為0. 83M。25°C， 160rpm條件下，放置24h。24h后，用去離子水和0. 1M PBS對(duì)載體進(jìn)行清洗，抽濾回收4°C 保存。采用前述的方法測(cè)定酶活。
[0051] 催化反應(yīng)：將步驟⑴中得到的固定化酶采用6U/ml的投酶量，投入25mg/ml的頭 孢菌素 C水溶液中，并用2M氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH8. 5,用循環(huán)水控制反應(yīng)溫度為10°C直到 反應(yīng)結(jié)束。
[0052] 整個(gè)反應(yīng)過程中定時(shí)取樣采用高效液相色譜測(cè)定產(chǎn)物7-ACA和CPC的含量。當(dāng) CPC的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%時(shí)，停止催化，用去離子水清洗固定化酶2-3次，應(yīng)用于下一批的催 化。
[0053] 整個(gè)催化過程用時(shí)62min，而催化批次為29批時(shí)酶活降為初始的一半。
[0054] 對(duì)比例 2-4 :
[0055] 除了分別將催化反應(yīng)過程中的溫度控制在15°C、20°C和30°C直到反應(yīng)結(jié)束，按照 對(duì)比例1所述進(jìn)行對(duì)比例2、3和4。結(jié)果如下表所示：
[0056] 表 1 :
[0057]
[0058] 從表1的對(duì)比例可以看出，固定化CPC?；冈诘蜏叵旅富畹蛽p失少，但是反應(yīng)時(shí) 間長(zhǎng)，從工業(yè)生產(chǎn)上來說，這是不利的，同時(shí)，為了保持全程在低溫下反應(yīng)需要消耗大量的 能量。在較高的溫度下固定化CPC酰化酶的反應(yīng)時(shí)間短，但是，酶活損失很大，由于固定化 ?；傅膬r(jià)格相對(duì)較高，從生產(chǎn)成本上考慮，也是不利的。另外，由于本領(lǐng)域公知在較高的 溫度下酶活損失大，從而也不會(huì)考慮在較高的溫度下進(jìn)行反應(yīng)。在工業(yè)上的一般做法是綜 合考慮二者因素，選取折中的溫度進(jìn)行反應(yīng)。
[0059] 實(shí)施例1 :
[0060] 固宙化CPC?；傅闹苽洌涸诩s20g EPC載體中，按400U/g投酶量加入CPC?；?酶和兩倍酶液體積的1. 25M磷酸鈉緩沖液（pH8. 0)，使磷酸鈉緩沖液終濃度為0. 83M。25°C， 160rpm條件下，放置24h。24h后，用去離子水和0. 1M PBS對(duì)載體進(jìn)行清洗，抽濾回收4°C 保存。并采用前述的方法測(cè)定酶活。
[0061] 催化反應(yīng)：將步驟⑴中得到的固定化酶采用6U/ml的投酶量，投入25mg/ml的頭 孢菌素 C水溶液中，并用2M氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH8. 5,用循環(huán)水控制反應(yīng)溫度為10°C保持 30分鐘，之后將反應(yīng)溫度控制在37°C至反應(yīng)結(jié)束。
[0062] 整個(gè)反應(yīng)過程中定時(shí)取樣采用高效液相色譜測(cè)定產(chǎn)物7-ACA和CPC的含量。當(dāng) CPC的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%時(shí)，停止催化，用去離子水清洗固定化酶2-3次，應(yīng)用于下一批的催 化。
[0063] 整個(gè)催化過程用時(shí)40min，催化批次為29批時(shí)酶活降為初始的一半。與10°C恒溫 催化相比，本實(shí)施例的反應(yīng)時(shí)間縮短了 22min，達(dá)到酶活半衰期的催化批次相同。
[0064] 實(shí)施例 2-6 :
[0065] 除了如下的溫度變化方式，按照實(shí)施例1所述進(jìn)行實(shí)施例2-6。
[0066] 實(shí)施例2 :先將反應(yīng)溫度在10°C保持30分鐘，之后將反應(yīng)溫度控制在30°C至反應(yīng) 結(jié)束。
[0067] 實(shí)施例3 :先將反應(yīng)溫度在15 °C保持20分鐘，之后將反應(yīng)溫度控制在37 °C至反應(yīng) 結(jié)束。
[0068] 實(shí)施例4 :先將反應(yīng)溫度在15 °C保持20分鐘，之后將反應(yīng)溫度控制在30 °C至反應(yīng) 結(jié)束。
[0069] 實(shí)施例5 :先將反應(yīng)溫度在20°C保持10分鐘，之后將反應(yīng)溫度控制在37°C至反應(yīng) 結(jié)束。
[0070] 實(shí)施例6 :先將反應(yīng)溫度在20°C保持10分鐘，之后將反應(yīng)溫度控制在30°C至反應(yīng) 結(jié)束。
[0071] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示：
[0072] 表 2 :
[0073]
[0074] 與對(duì)比例1相比，實(shí)施例1和2采用在反應(yīng)后期增加溫度，可以看到反應(yīng)時(shí)間顯著 縮短（從62分鐘縮短為40或45分鐘），而且，酶活半衰期的催化批次沒有變化。
[0075] 與對(duì)比例2相比，實(shí)施例3和4采用在反應(yīng)后期增加溫度，可以看到反應(yīng)時(shí)間顯著 縮短（從50分鐘縮短為28或32分鐘），而且，酶活半衰期的催化批次沒有明顯變化。
[0076] 與對(duì)比例3相比，實(shí)施例5和6采用在反應(yīng)后期增加溫度，可以看到反應(yīng)時(shí)間顯著 縮短（從33分鐘縮短為15或17分鐘），而且，酶活半衰期的催化批次沒有明顯變化。
[0077] 因此，本發(fā)明的方法在工業(yè)上有顯著的意義，而這是基于對(duì)固定化CPC?；傅?微環(huán)境pH的研究以及出人意料地發(fā)現(xiàn)CPC?；冈谂c產(chǎn)物7-ACA共存的情況下對(duì)熱的耐 受性明顯提高所做出的。
[0078] 實(shí)施例中所用的固宙化CPC酰化酶的熱穩(wěn)宙件和pH耐夸件
[0079] 固定化CPC?；傅闹苽渫瑢?shí)施例1。
[0080] 熱穩(wěn)宙件:
[0081] 分別將lg固定化CPC?；讣尤氲?0mL的磷酸鈉緩沖液中（20mM，ρΗ8· 0)中得 到三個(gè)樣品，將三個(gè)樣品分別在l〇°C，20°C，37°C溫育，定時(shí)取樣測(cè)定酶活。結(jié)果見圖1。
[0082] 從圖1可以看到，溫度越高，CPC?；傅拿富钚該p失越大。所以在現(xiàn)有技術(shù)中盡 量避免在高溫下進(jìn)行反應(yīng)。
[0083] 與7-ACA共存情況下的熱穩(wěn)宙件:
[0084] 分別將lg固定化CPC?；讣尤氲?0mL的磷酸鈉緩沖液中（20mM，pH8. 0)得到 兩個(gè)樣品，在其中一個(gè)樣品中加入7-ACA使得7-ACA的濃度為2mg/m，將這兩個(gè)樣品分別在 37°C下溫育，定時(shí)取樣測(cè)定酶活。結(jié)果見圖2。
[0085] 從圖2可以看出，在有產(chǎn)物7-ACA存在條件下，CPC?；笇?duì)溫度的穩(wěn)定性顯著提 尚。
[0086] dH耐夸件:
[0087] 分別將lg固定化CPC?；钢糜?0mL的pH分別為6. 0, 7. 0, 7. 5, 8. 0, 8. 5, 9. 0, 9. 5 的20mM磷酸鈉緩沖液中，20°C下溫育，定時(shí)取樣測(cè)定酶活。結(jié)果如圖3所示。
[0088] 從圖3可以看到，CPC?；冈趐H8. 5時(shí)穩(wěn)定性最好。
[0089] 催化講稈中固宙化CPC?；割w粒微環(huán)境的dH奪化檢測(cè)：
[0090] (1)通過5-氨基熒光素（5-AF)作為pH熒光指示劑可反映催化過程微環(huán)境中pH 的變化情況，需要將CPC酰化酶與5-AF共同固定到EPC上。在約2g EPC載體中加入約 0. 01g5-AF (5-AF :EPC載體質(zhì)量比為0. 0050:1)，按400U/g投酶量加入CPC?；负蛢杀睹?液體積的1. 25M磷酸鈉緩沖液（pH8. 0)，使磷酸鈉緩沖液終濃度為0. 83M。25°C，160rpm條 件下，放置24h。24h后，用去離子水和0. 1M PBS對(duì)載體進(jìn)行清洗，抽濾回收4°C保存。并采 用前述的方法測(cè)定酶活。
[0091] (2)將步驟（1)中得到的固定化酶采用6U/ml的投酶量，投入25mg/ml的頭孢菌素 C水溶液中，并用2M氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH8. 5,用循環(huán)水浴控制整個(gè)反應(yīng)的溫度。采用磁力 攪拌使溶液中固定化酶顆粒均勾分散，用焚光原位pH計(jì)（pH-lmini v2,PreSens Precision Sensing GmbH)檢測(cè)其焚光振幅。
[0092] (3)整個(gè)反應(yīng)過程中采用熒光原位pH計(jì)通過熒光振幅的檢測(cè)來測(cè)定反應(yīng)固定化 酶顆粒表面微環(huán)境pH的變化。主體相pH是通過自動(dòng)電位滴定儀控制在8. 5。
[0093] 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在低溫10°C催化時(shí)固定化酶微環(huán)境pH變化幅度較小，約為0. 6個(gè)單位 左右；15°C催化時(shí)固定化酶微環(huán)境pH變化幅度約為0. 8個(gè)單位左右；高溫30°C催化時(shí)固定 化酶微環(huán)境pH變化幅度較大，約為1. 5個(gè)單位左右；高溫37°C催化時(shí)固定化酶微環(huán)境pH 變化幅度較大，約為1. 8個(gè)單位左右。通過變溫兩階段催化（如實(shí)施例2的前期10°C后期 30°C，實(shí)施例3的前期15°C后期37°C )使催化過程中的微環(huán)境pH變化平緩，固定化酶的微 環(huán)境pH偏離主體相pH的值均在1個(gè)單位內(nèi)，與單一較低溫度（如10°C或15°C )催化微環(huán) 境pH偏離主體相的值基本一致，而與單一較高溫度（如30°C或37°C)催化微環(huán)境pH偏離 主體相的值（接近2個(gè)單位）有很大的縮小，在很大程度上提高了固定化酶的穩(wěn)定性。 [0094] 最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參 照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對(duì)本 發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換；而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng) 涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 利用固定化頭孢菌素 C?；复呋^孢菌素 C以一步酶法制備7-氨基頭孢烷酸的 方法，該方法包括：將固定化頭孢菌素 C?；概c頭孢菌素 C在液體中混合，在反應(yīng)周期內(nèi) 將反應(yīng)體系的溫度從初始反應(yīng)溫度連續(xù)地或不連續(xù)地升溫至16-37Γ，優(yōu)選20-35Γ，再優(yōu) 選 25-35 °C。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述初始反應(yīng)溫度為0-15 °C，優(yōu)選3-15 °C，更優(yōu)選 5-10Γ〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述液體是水或磷酸鈉緩沖液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述連續(xù)地升溫以恒定的升溫速度0. 01°C / 分鐘-3. 0°C /分鐘，優(yōu)選0. 05°C /分鐘-2. 0°C /分鐘，更優(yōu)選0. 1°C /分鐘-1. 0°C /分鐘 進(jìn)行。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述連續(xù)地升溫以不恒定的升溫速度進(jìn)行， 尤其是先慢后快的升溫速度，其中升溫的平均速度落入〇. 〇l°C /分鐘-3. 0°C /分鐘，優(yōu)選 0. 05°C /分鐘-2. 0°C /分鐘，更優(yōu)選0. 1°C /分鐘-1. 0°C /分鐘的范圍內(nèi)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述不連續(xù)地升溫以階梯式進(jìn)行。7. 根據(jù)權(quán)利要求6任一項(xiàng)的方法，其中所述階梯式包括在5-15°C保持總反應(yīng)時(shí)間的 1/2-3/4然后在20-37°C保持總反應(yīng)時(shí)間的1/4-1/2的兩階段升溫，或者在5-15°C保持總反 應(yīng)時(shí)間的1/4-1/2然后在20-25°C保持總反應(yīng)時(shí)間的1/4-2/3然后在28-37°C保持總反應(yīng) 時(shí)間的1/4-1/3的三階段升溫。 8. 7-氨基頭孢烷酸用于保護(hù)頭孢菌素 C酰化酶的熱穩(wěn)定性的用途。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，所述頭孢菌素 C?；甘枪潭ɑ^孢菌素 C酰化酶。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種7-氨基頭孢烷酸的制備方法，特別是利用固定化頭孢菌素C?；复呋^孢菌素C以一步酶法制備7-氨基頭孢烷酸的方法。所述方法包括：將固定化頭孢菌素C?；概c頭孢菌素C在液體中混合，在反應(yīng)周期內(nèi)將反應(yīng)體系的溫度從初始反應(yīng)溫度連續(xù)地或不連續(xù)地升溫至16-37℃。該方法具有穩(wěn)定的催化速率、較短的反應(yīng)時(shí)間和固定化CPC?；改軌蚨嗯问褂玫葍?yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C12P35/02
【公開號(hào)】CN105624257
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410612262
【發(fā)明人】羅暉, 劉秀紅, 常雁紅, 彭欽成, 李璽, 何華, 于慧敏, 沈忠耀
【申請(qǐng)人】北京科技大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2014年11月4日