6分鐘。
[0043] 4.循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行純化。
[0044] C.大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備：
[0045] 1.挑取大腸桿菌DH5 a單菌落劃線接種在新鮮LB瓊脂平板上，37 °C過(guò)夜。挑取單 菌落接種到25mL的LB液體培養(yǎng)基中。
[0046] 2.以220-225rpm 37°C振搖過(guò)夜。取IOmL過(guò)夜培養(yǎng)物接種到IL LB中。在37°C 劇烈振搖培養(yǎng)直到0D600達(dá)到0. 5-0. 7,冰浴lh。
[0047] 3.把菌液轉(zhuǎn)移到滅菌的預(yù)冷的離心瓶中。以4000rpm(2800xg)4°C，15min。去上 清液冰浴。輕輕地用IL冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。
[0048] 4.4000印111(280(^8)4°〇，151^11，輕輕地用0.51^冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。
[0049] 5.4000印111(280(^8)4°〇，151^11，輕輕地用2501^冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。
[0050] 6. 4000rpm(2800xg) 4°C，15min。用甘油重懸使最終體積達(dá)3. 5mL。細(xì)菌密度大約 為3χ101(ι細(xì)胞/mL。等體積分裝為100 μ L/份，迅速放于干冰中。在-80°C貯存感受態(tài)細(xì) 胞。
[0051] 7.用超螺旋載體如Pucl9進(jìn)行轉(zhuǎn)化驗(yàn)證感受態(tài)。應(yīng)產(chǎn)生至少0. 5-lxl01(lcfu/yg 的細(xì)胞。
[0052] D.連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：
[0053] L在微量離心管中加入0· 3 μ L TaKaRa pMD18-T載體、2. 2 μ L牛蛙cDNA雙鏈溶 液、2. 5 yL 4d H2O,加入 5 yL Solutionl，全量為 10 yL。
[0054] 2. 16°C 連接過(guò)夜·
[0055] 3.全量（10 μ L)加入至100 μ L DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘。
[0056] 5. 42 °C熱擊90秒鐘后，冰浴2分鐘。
[0057] 6.加入LB培養(yǎng)基800 μ L，37°C緩慢振蕩培養(yǎng)（60-80轉(zhuǎn)/min) 45-60分鐘。
[0058] 7.取200 μ L涂布于含有Amp+的LB培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)16小時(shí)，形成單菌落。
[0059] 8.每個(gè)LB平皿用5mL LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30%甘油凍存。構(gòu)建的cDNA 文庫(kù)大約含IxlO6個(gè)單獨(dú)克隆。
[0060] IV.牛蛙緩激肽基因克隆篩選
[0061 ] 擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸，上游引物：5 ^ -ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3、 下游引物為 SMART? cDNA Library Construction Kit 中的 3 ' PCR Primer 引物： 5 , -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC-3 , 〇
[0062] PCR反應(yīng)條件如下：94°C 30秒，50°C 30秒，72°C 2分鐘，共35循環(huán)，72°C 10分鐘。
[0063] V .牛蛙緩激肽基因序列測(cè)定結(jié)果
[0064] 提取質(zhì)粒并用M13+與M13-測(cè)序，儀器為ABI PRISM 3730全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定 儀，基因測(cè)序結(jié)果自5 ^端至:^端序列為：（SEQ ID NO. 1)
[0065]
[0066] 牛蛙絲氨酸蛋白酶抑制劑基因核苷酸序列為：序列長(zhǎng)度為458個(gè)堿基，
[0067] 序列類型：核酸，鏈數(shù)：?jiǎn)捂湥蛄蟹N類：cDNA，來(lái)源：牛蛙皮膚。
[0068] 編碼牛蛙緩激肽的為第156-183,156-204位核苷酸片段，其氨基酸序列為：Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg和Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg I Ie Ala Pro Ala Ser Tyr Leu。（見 SEQ ID NO. 3-6)
[0069] 實(shí)施例2 :制備牛蛙緩激肽
[0070] I、樣品的制備方法：根據(jù)編碼牛蛙緩激肽的基因推斷牛蛙緩激肽的氨基酸序列， 用自動(dòng)多肽合成儀APEX396合成其全序列。通過(guò)HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。
[0071] II、分子量測(cè)定采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI)，發(fā)射電壓為 4. 5Kv〇
[0072] III、純化的牛蛙緩激肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度（流速1.0 mL/min ; 流動(dòng)相乙腈+水+TFA0. 01% ;梯度洗脫；色譜柱C18,檢測(cè)波長(zhǎng)220nm)，分子量測(cè)定采用快 原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0073] 牛蛙緩激肽是由無(wú)尾兩棲類牛蛙緩激肽基因編碼的一種單鏈多肽，為2個(gè)多肽 片段，分子量分別為1759. 0道爾頓和1043. 2道爾頓，等電點(diǎn)為9. 50和10. 35。多肽氨基 酸全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為：精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-脯氨 酸-苯丙氨酸-精氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-酪氨酸-亮氨 酸（RPPGCNPFRIAPASYL);精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-脯氨 酸-苯丙氨酸-精氨酸（RPPGCNPFR)。
[0074] 實(shí)施例3 :牛蛙緩激肽的活性實(shí)驗(yàn)
[0075] 1.牛蛙緩激肽作用于大鼠離體回腸肌
[0076] Vistar大鼠斷頸處死，取其離體回腸肌標(biāo)本測(cè)定生物活性，大鼠離體回腸肌標(biāo)本 (2cm長(zhǎng)）于37°C臺(tái)氏液中保溫，通以空氣，待肌肉收縮舒張穩(wěn)定后，加入不同濃度的樣品號(hào) 的收集與處理采用成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)的BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。
[0077] 2.大鼠回腸肌收縮活性檢測(cè)
[0078] 氨基酸合成牛娃緩激肽Kininogen-ICa(RR9和RL16)，分別測(cè)定了合成的樣品對(duì) 大鼠離體回腸肌收縮能力的影響。以生理鹽水和〇. 1%。乙酰膽堿作為對(duì)照，當(dāng)RR9濃度為 0. 06nM時(shí)就可以引起離體回腸肌顯著的收縮，但當(dāng)濃度大于0. 479nM時(shí)，大鼠離體回腸肌 的收縮頻率增加，但收縮能力開始受到抑制。當(dāng)RL16濃度為0. 07nM時(shí)就可以引起大鼠離 體回腸肌的顯著收縮，且濃度為I. 137nM時(shí)收縮的頻率降低，但是收縮能力增強(qiáng)（如圖1)。 所以，本發(fā)明牛蛙緩激肽Kininogen-ICa具有很強(qiáng)的促進(jìn)大鼠離體回腸肌收縮的活性。
[0079] 3.牛蛙緩激肽作用于高脂模型SD大鼠
[0080] 選用清潔級(jí)健康成年SD雄性大鼠（體重200~220g)，每組10只，按照體重隨機(jī) 分成5組，空白對(duì)照組給予維持飼料，實(shí)驗(yàn)組給予模型飼料（高脂飼料：在維持飼料中添加 20%蔗糖、1. 2%膽固醇、0. 2%膽酸鈉、15%豬油）。三個(gè)劑量組每天經(jīng)口給予牛蛙緩激肽 RR9 (200mg/kg、400mg/kg、600mg/kg)，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組同時(shí)給予同體積的去離子 水，大鼠自由進(jìn)食、飲水，連續(xù)觀察30天，每周記錄體重。第31天不禁食采血，采血后分離 血清，測(cè)定血清TC、TG、HDL-C水平采用GLAM0UR3000全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。
[0081] 表1.各組大鼠體重變化情況（X土s)
[0082]

[0083] 4.牛蛙緩激肽對(duì)高脂模型SD大鼠降血脂作用
[0084] 數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差進(jìn)行總體比較， P〈〇. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果各劑量組大鼠體重與對(duì)照組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0. 05)。飼喂30天后，低、中、高劑量組大樹血清TG水平顯著低于高脂對(duì)照組（P〈0. 01)。 低劑量組大鼠血清TC水平低于高脂對(duì)照組（P〈0. 05)。低、中、高劑量組大鼠血清HDL-C水 平顯著高于對(duì)照組（P〈0. 01)。
[0085] 表2各組大鼠血清TG、TC、HDL-C含量測(cè)定（X土 s，n = 10)
[0086]
[0087] 注：與高脂對(duì)照組比較，*P〈0.05, **P〈0.01。
[0088] 以上所述的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi) 的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，不能僅以本實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的專利范 圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種牛蛙緩激肽，其特征在于，所述牛蛙緩激肽由9個(gè)氨基酸組成，分子量為1043. 2 道爾頓，等電點(diǎn)為9. 50,其氨基酸序列為SEQ ID NO. 4 :Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg02. -種編碼如權(quán)利要求1所述牛蛙緩激肽的編碼基因，其特征在于，其序列為SEQ ID NO. 1所示序列的第156-183位核苷酸。3. -種牛蛙緩激肽，其特征在于，所述牛蛙緩激肽由16個(gè)氨基酸組成，分子量為 1759.0道爾頓，等電點(diǎn)為10. 35,其氨基酸序列為SEQ ID NO. 6 :Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg He Ala Pro Ala Ser Tyr Leu〇4. 一種編碼如權(quán)利要求2所述牛蛙緩激肽的編碼基因，其特征在于，其序列為SEQ ID NO. 1所示序列的第156-204位核苷酸。5. 如權(quán)利要求1或2所述的牛蛙緩激肽，在制備心血管系統(tǒng)藥物和促進(jìn)腸道收縮藥物 中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛蛙緩激肽及其編碼的核酸和應(yīng)用，所述牛蛙緩激肽由9個(gè)氨基酸組成，分子量為1043.2道爾頓，等電點(diǎn)為9.50，其氨基酸序列為SEQ ID NO.4：Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg。所述牛蛙緩激肽的編碼基因，其序列為SEQ ID NO.1所示序列的第156-183位核苷酸。所述牛蛙緩激肽由16個(gè)氨基酸組成，分子量為1759.0道爾頓，等電點(diǎn)為10.35，其氨基酸序列為SEQ ID NO.6：Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg Ile Ala Pro Ala Ser Tyr Leu。本發(fā)明由牛蛙緩激肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的牛蛙緩激肽RR9和RL16具有很強(qiáng)的促進(jìn)大鼠離體回腸肌收縮的活性，該牛蛙緩激肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便的特點(diǎn)，因此可以作為心腦血管藥物以及促進(jìn)腸道收縮藥物的應(yīng)用。
【IPC分類】A61K38/08, C07K7/18, A61P9/00, A61P1/00, C12N15/16, A61K38/10
【公開號(hào)】CN104987365
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510498038
【發(fā)明人】趙瑞利, 韓文瑜, 韓俊友, 馬吉飛, 馮新, 朱琳
【申請(qǐng)人】天津農(nóng)學(xué)院
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年8月13日