一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多肽藥物制備方法技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固相合成制備醋酸辛卡利 特的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 中文名：醋酸辛卡利特
[0003] 英文名：Sincalide Acetate
[0004] 結(jié)構(gòu)式：Asp_Tyr (SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
[0005] 分子式：C49H62NltlO16S3
[0006] 分子量：1143. 27
[0007] 醋酸辛卡利特（Sincalide Acetate)，又稱辛卡利特（Sincalide)，是一種人工合 成的膽囊素八肽（Octapeptide)，主要用于促膽囊收縮，膽囊診斷試劑，臨床用于治療慢性 胰腺炎，發(fā)現(xiàn)胰分泌功能明顯改善，癥狀明顯減輕。徐滿英（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)生理教研室， 哈爾濱，150086)通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)得出，辛卡利特的抗電針鎮(zhèn)痛作用在中樞痛反應(yīng)神經(jīng)元電活 動(dòng)和整體行為反射水平上是協(xié)調(diào)一致的，表明辛卡利特能有效提高臨床針刺的鎮(zhèn)痛療效。
[0008] 目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于辛卡利特的合成報(bào)道不多，市場(chǎng)上辛卡利特的制備方法主要是酶 解法和液相液相法。常見(jiàn)工藝中，采用了氨解的方法制備辛卡利特粗品，其中氨水有毒，對(duì) 目艮、鼻、皮膚有刺激性和腐蝕性，能使人窒息，與酸中和反應(yīng)產(chǎn)生熱，有燃燒爆炸危險(xiǎn)。檢測(cè) 反應(yīng)中用到有毒試劑吡啶，吡啶易燃，有強(qiáng)烈刺激性，能麻醉中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)眼及上呼吸 道有刺激作用，長(zhǎng)期吸入會(huì)出現(xiàn)頭暈、頭痛、失眠及消化道功能紊亂。
[0009] 上述辛卡利特制備方法中，都用到了毒性較大的試劑，若用于辛卡利特的大量制 備，定會(huì)長(zhǎng)期接觸此類試劑，對(duì)人身體傷害較大；且工藝操作復(fù)雜，制備周期長(zhǎng)，酸解產(chǎn)生較 多副產(chǎn)物，生產(chǎn)成本昂貴，收率低，不利于工業(yè)生產(chǎn)、應(yīng)用價(jià)值不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種純度高，收率高的固相合成制備 醋酸辛卡利特的方法。
[0011] 本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0012] 一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，該方法包括以下順序的制備步驟：
[0013] (1)、將溶脹、脫保護(hù)并洗滌后的氨基樹(shù)脂與活化的保護(hù)氨基酸溶液于30°C的恒溫 震蕩器中反應(yīng)40-90min，依次接入從樹(shù)脂端起第1-8個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸，得到 辛卡利特前體肽I -氨基樹(shù)脂：
[0014] Fmoc-Asp-Tyr (SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-氨基樹(shù)脂：
[0015] (2)、將上述制得的辛卡利特前體肽I -氨基樹(shù)脂脫保護(hù)并洗滌后抽干至顆粒狀， 加入切割試劑，進(jìn)行切割反應(yīng)、沉降后，得到辛卡利特粗肽II :
[0016] Asp-Tyr (SO3H) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2;
[0017] (3)、將辛卡利特粗肽II溶于溶劑中，經(jīng)反相高效液相色譜法純化得到辛卡利特多 肽，凍干得到辛卡利特純品III;
[0018] (4)、將辛卡利特純品III用1 %醋酸溶解，采用強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂室溫?cái)嚢栉?，?后將吸附液補(bǔ)加醋酸，經(jīng)凍干得到醋酸辛卡利特IV。
[0019] 步驟（1)中所述的氨基樹(shù)脂為Rink Amide-MBHA Resin，其取代度為0· 35~ 0. 5mmol/g ;所述的溶脹是指將氨基樹(shù)脂浸沒(méi)在DCM溶劑中2h。
[0020] 步驟（1)中活化的保護(hù)氨基酸溶液制備方法為：將保護(hù)氨基酸和HOBt加入到離心 管中，加入DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保護(hù) 氨基酸溶液。
[0021] 步驟（1)中所述的保護(hù)氨基酸為：Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Asp (otBu)-OH、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO3H)-OH. Na、 Fmoc-Asp(otBu)-OH。
[0022] 步驟（I)和步驟（2)中所述的脫保護(hù)并洗滌是指：將溶液抽干后，加入1/3-1/2反 應(yīng)器體積的20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空 泵將溶液抽干；再加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖lmin，用真空 泵將溶液抽干，再次加入DMF溶液洗滌樹(shù)脂，重復(fù)操作3次。
[0023] 步驟（2)中所述的切割試劑 100mL 配置為：94ml TFA+2. 5ml TIS+2. 5ml H2CHlml EDT ;切割反應(yīng)條件為：置于20r/min的脫色搖床上，于-20°C條件下切割反應(yīng)20min ;所述 的沉降選用-20°C低溫預(yù)冷的無(wú)水乙醚，離心沉降3次。
[0024] 步驟（3)所述的溶劑為15%乙腈和水的混合溶液。
[0025] 步驟⑶所述的純化選用C18, 5um制備柱進(jìn)行反相高效液相色譜純化，以 B. Cone/% (2 - 80)，0 - IOOmin的梯度程序，9ml/min的流速進(jìn)樣多肽的分離提純。
[0026] 步驟（4)所述的強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂為氯型強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂；室溫?cái)嚢栉絣h， 之后將吸附液補(bǔ)加醋酸含量到5%。
[0027] 本發(fā)明還提供一種按照上述方法制備的醋酸辛卡利特純品。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用Fmoc固相合成原理，開(kāi)發(fā)了固相合成技術(shù)，采用 常見(jiàn)易得、低成本的試劑合成制備，通過(guò)工藝優(yōu)化，辛卡利特粗品收率高達(dá)92%以上，其純 品得率達(dá)到30-40%，大大提高了辛卡利特的得率；本發(fā)明還采用強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂-醋酸 轉(zhuǎn)鹽技術(shù)處理辛卡利特純品，大大降低了純品中三氟醋酸的含量，徹底清除了三氟醋酸對(duì) 生物體的毒性；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)過(guò)程取樣方便，易于中控，并且合成周期短，生產(chǎn)成本 低，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 為了便于本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0030] 本發(fā)明固相合成制備醋酸辛卡利特，以氨基樹(shù)脂為起始樹(shù)脂載體，氨基樹(shù)脂為 Rink Amide-MBHA Resin，其取代度為0. 35~0. 5mmol/g ;通過(guò)固相合成法依次縮合辛卡利 特氨基酸序列中相對(duì)應(yīng)的Fmoc-保護(hù)氨基酸，經(jīng)活化劑和縮合劑縮合反應(yīng)及脫保護(hù)劑的脫 保護(hù)反應(yīng)，得到辛卡利特前體肽I -氨基樹(shù)脂，之后脫掉天冬氨酸的Fmoc保護(hù)基，洗滌樹(shù)脂 并進(jìn)行切割、沉降后，得到辛卡利特粗肽II，粗肽經(jīng)過(guò)純化及凍干后得到辛卡利特純品III。
[0031] 固相合成法依次縮合的Fmoc-保護(hù)氨基酸為：Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Asp (otBu) -OH、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO3H)-OH. Na、 Fmoc-Asp (otBu) -OH，縮合反應(yīng)中氨基酸投料量為所投氨基樹(shù)脂摩爾數(shù)的2-4倍，縮合反應(yīng) 溫度為20-40°C?？s合反應(yīng)所使用的活化劑和縮合劑分別為DIC、HOBt，縮合反應(yīng)時(shí)間為 2〇-5〇11^11;脫保護(hù)劑為20%哌啶/1)1^的混合溶液，洗脫時(shí)間為15-3〇1^11。
[0032] 轉(zhuǎn)鹽工藝中所選用的轉(zhuǎn)鹽樹(shù)脂為氯型強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂，將辛卡利特純品III用醋 酸溶解后加入到活化后的樹(shù)脂中，攪拌吸附反應(yīng)，替換出辛卡利特中的三氟醋酸鹽，將反應(yīng) 液凍干得到醋酸辛卡利特IV純品。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 氨基樹(shù)脂的溶脹：稱量取代度為0. 38mmol/g的Rink-MBHA-Resin 0. lg，從開(kāi)口端 加入至多肽合成反應(yīng)器中，取DCM試劑加入至反應(yīng)器中，使樹(shù)脂完全浸沒(méi)在DCM溶劑中，與 溶劑充分接觸，溶脹2h。
[0035] UFmoc-辛卡利特樹(shù)脂的合成 [0036] 辛卡利特前體肽I -氨基樹(shù)脂為：
[0037] Fmoc-Asp-Tyr (SO3H) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-氨基樹(shù)脂
[0038] 本實(shí)施例使用的保護(hù)氨基酸從樹(shù)脂起算第1-8個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸及 分子量如下表1所不：
[0039] 表 1
[0040]
[0041] 本發(fā)明中一些常用的縮寫(xiě)具有以下含義：
[0042]
[0044] 保護(hù)氨基酸的活化方法
[0045] 以Fmoc-Phe-氨基樹(shù)脂的縮合為例，按照計(jì)算的理論投料量稱取24. 02mg Fmoc-Phe-OH和12. 57mg HOBt于離心管中，加2ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加 IOul DIC，混合均勻得到活化的保護(hù)氨基酸溶液。
[0046] 樹(shù)脂的脫保護(hù)以及洗滌方法
[0047] 將氨基樹(shù)脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20 %哌啶與DMF混合溶液， 置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將脫保護(hù)溶液抽干；再加入 1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖lmin，用真空泵將溶液抽干，再次加 入DMF溶液洗滌樹(shù)脂，重復(fù)操作3次。
[0048] 茚三酮顯色檢測(cè)合格后，將上述的保護(hù)氨基酸溶液加到抽干的反應(yīng)器中，再將反 應(yīng)器置于30°C的恒溫震蕩器中反應(yīng)20-50min。采用上述同樣方法，依次接入第2-8個(gè)氨基 酸對(duì)應(yīng)的Fmoc-保護(hù)氨基酸，即得到辛卡利特前體肽I -氨基樹(shù)脂。
[0049] 2、辛卡利特粗肽II的合成
[0050] 將辛卡利特前體肽I -氨基樹(shù)脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20%哌 啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將溶液抽干； 再加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖lmin，用真空泵將溶液抽干， 再次加入DMF溶液洗滌辛卡利特前體肽I -氨基樹(shù)脂，重復(fù)操作3次。
[0051] 將反應(yīng)器中的樹(shù)脂用真空泵抽干至顆粒狀，配置IOml切割試劑：9.4ml TFA+O. 25ml TIS+O. 25ml H20+0.1 ml EDT，加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)器置于20r/min的脫色搖 床上，于-20°C條件下切割反應(yīng)20min。多肽的沉降選用-20°C低溫預(yù)冷的無(wú)水乙醚，離