心沉 降3次，得到乳膠狀的粗肽樣品。
[0052] 將粗品凍干后稱重，得到粉末狀樣品36. 14mg，根據(jù)粗品的量和合成測(cè)定實(shí)際取代 度（SD = 0. 31mmol/g)計(jì)算的理論量，計(jì)算粗品收率達(dá)到92. 7%，比現(xiàn)有技術(shù)僅60%的收 率有大幅度成倍的提高。
[0053] 3、辛卡利特純品III的制備
[0054] 用15 %乙腈和水的混合溶液溶解辛卡利特粗品II，經(jīng)反相高效液相色譜法純化得 到辛卡利特多肽，制備條件為：C18制備柱，流動(dòng)相為A (0. 1 %乙酸/水）/B (0. 1 %乙酸/乙 腈），流速9ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，制備梯度程序
[0055]
[0056] 收集樣品峰溶液，凍干后稱重得樣品為13. 33mg，計(jì)算辛卡利特純品III收率達(dá)到 36. 8%〇
[0057] 4、醋酸辛卡利特IV的制備
[0058] 將純化、凍干后的辛卡利特多肽用1 %醋酸溶解，采用強(qiáng)陰離子交換樹脂室溫?cái)?拌吸附lh，之后將吸附液補(bǔ)加醋酸含量到5%，經(jīng)凍干、稱量得到醋酸辛卡利特IV產(chǎn)品共 10. 63mg，純度達(dá)到99. 631%，純品收率為30. 8%。分別稱取轉(zhuǎn)鹽前后的辛卡利特多肽各 lmg，按藥典方法測(cè)定醋酸含量，轉(zhuǎn)鹽前醋酸含量為1. 73 %，轉(zhuǎn)鹽后醋酸含量為6. 7%，大大 提高了純品中醋酸的含量，轉(zhuǎn)換并降低了產(chǎn)品中三氟醋酸的含量。
[0059] 實(shí)施例2
[0060] 氨基樹脂的溶脹：稱量取代度為0. 45mmol/g的Rink-MBHA-Resin 2g，從開(kāi)口端加 入至多肽合成反應(yīng)器中，取DCM試劑加入至反應(yīng)器中，使樹脂完全浸沒(méi)在DCM溶劑中，浸泡 過(guò)夜。
[0061] UFmoc-辛卡利特樹脂的合成
[0062] 辛卡利特前體肽I -氨基樹脂為：
[0063] Fmoc-Asp-Tyr (SO3H) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-氨基樹脂
[0064] 保護(hù)氨基酸的活化方法
[0065] 以Fmoc-Phe-氨基樹脂的縮合為例，按照計(jì)算的理論投料量稱取510mg Fmoc-Phe-OH和255mg HOBt于離心管中，加12ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加200ul DIC，混合均勻得到活化的保護(hù)氨基酸溶液。
[0066] 樹脂的脫保護(hù)以及洗滌方法
[0067] 將氨基樹脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20 %哌啶與DMF混合溶液， 置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將脫保護(hù)溶液抽干；再加入 1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖90s，用真空泵將溶液抽干，再次加入 DMF溶液洗滌樹脂，重復(fù)操作3次。
[0068] 茚三酮顯色檢測(cè)合格后，將上述的保護(hù)氨基酸溶液加到抽干的反應(yīng)器中，再將反 應(yīng)器置于30°C的恒溫震蕩器中反應(yīng)40-90min。采用上述同樣方法，依次接入表1中第2-8 個(gè)氨基酸對(duì)應(yīng)的Fmoc-保護(hù)氨基酸，即得到辛卡利特前體肽I -氨基樹脂。
[0069] 2、辛卡利特粗肽II的合成
[0070] 將辛卡利特前體肽I -氨基樹脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20%哌 啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將溶液抽干； 再加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖90s，用真空泵將溶液抽干，再 次加入DMF溶液洗滌辛卡利特前體肽I -氨基樹脂，重復(fù)操作3次。
[0071] 將反應(yīng)器中的樹脂用真空泵抽干至顆粒狀，配置100mL切割試劑：94ml TFA+2.5ml TIS+2. 5ml H2CHlml EDT，加入到反應(yīng)器中，反應(yīng)器置于20r/min的脫色搖床上，于-20°C條 件下切割反應(yīng)30min。多肽的沉降選用-20°C低溫預(yù)冷的無(wú)水乙醚，離心沉降3次，得到乳 膠狀的粗肽樣品。
[0072] 將粗品凍干后稱重，得到粉末狀樣品762mg，根據(jù)粗品的量和合成測(cè)定實(shí)際取代度 (SD = 0. 36mmol/g)計(jì)算的理論量，計(jì)算粗品收率達(dá)到91. 9%。
[0073] 3、辛卡利特純品III的制備
[0074] 用15 %乙腈和水的混合溶液溶解辛卡利特粗品II，經(jīng)反相高效液相色譜法純化得 到辛卡利特多肽，制備條件為：C18制備柱，流動(dòng)相為A (0. 1 %乙酸/水）/B (0. 1 %乙酸/乙 腈），流速13ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，制備梯度程序
[0075]
[0076]
[0077] 收集樣品峰溶液，凍干后稱重得樣品為255mg，計(jì)算辛卡利特純品III收率達(dá)到 34. 8% 〇
[0078] 4、醋酸辛卡利特IV的制備
[0079] 將純化、凍干后的辛卡利特多肽用1 %醋酸溶解，采用強(qiáng)陰離子交換樹脂室溫?cái)嚢?吸附90min，之后將吸附液補(bǔ)加醋酸含量到5%，經(jīng)凍干、稱量得到醋酸辛卡利特IV產(chǎn)品共 194mg，純度達(dá)到99. 173%，純品收率為30. 5%。
[0080] 本發(fā)明利用Fmoc固相合成原理，開(kāi)發(fā)了固相合成技術(shù)，采用常見(jiàn)易得、低成 本的試劑合成制備，通過(guò)工藝優(yōu)化，辛卡利特粗品收率高達(dá)92 %以上，其純品得率達(dá)到 30-40%，大大提高了辛卡利特的得率；本發(fā)明還采用強(qiáng)陰離子交換樹脂-醋酸轉(zhuǎn)鹽技術(shù)處 理辛卡利特純品，大大降低了純品中三氟醋酸的含量，徹底清除了三氟醋酸對(duì)生物體的毒 性；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)過(guò)程取樣方便，易于中控，并且合成周期短，生產(chǎn)成本低，副產(chǎn)物 少，產(chǎn)品收率高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0081] 以上內(nèi)容僅僅是對(duì)本發(fā)明所作的舉例和說(shuō)明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)所描 述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超 越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，其特征在于，該方法包括以下順序的制備 步驟： (1) 、將溶脹、脫保護(hù)并洗滌后的氨基樹脂與活化的保護(hù)氨基酸溶液于恒溫震蕩器中反 應(yīng)，依次接入從樹脂起算第1-8個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸，得到辛卡利特前體肽I -氨 基樹脂； (2) 、將上述制得的辛卡利特前體肽I -氨基樹脂脫保護(hù)并洗滌后抽干至顆粒狀，加入 切割試劑，進(jìn)行切割反應(yīng)、沉降后，得到辛卡利特粗肽II ; (3) 、將辛卡利特粗肽II溶于溶劑中，經(jīng)反相高效液相色譜法純化得到辛卡利特多肽， 凍干得到辛卡利特純品III ; (4) 、將辛卡利特純品III用1 %醋酸溶解，采用強(qiáng)陰離子交換樹脂室溫?cái)嚢栉?，之后?吸附液補(bǔ)加醋酸，經(jīng)凍干得到醋酸辛卡利特IV。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，其特征在于：步驟 (1)中所述的氨基樹脂為Rink Amide-MBHA Resin，其取代度為0.35~0.5mmol/g;所述的 溶脹是指將氨基樹脂浸沒(méi)在DCM溶劑中2h。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，其特征在于：步驟 (1)中活化的保護(hù)氨基酸溶液制備方法為：將保護(hù)氨基酸和HOBt加入到離心管中，加入DMF 將其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保護(hù)氨基酸溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，其特 征在于：步驟（1)中所述的保護(hù)氨基酸為：Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Asp (otBu)-OH、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO3H)-OH. Na、 Fmoc-Asp(otBu)-OH。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，其特征在于：步驟 (1)和步驟（2)中所述的脫保護(hù)并洗滌是指：將溶液抽干后，加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的 20%哌啶與DMF混合溶液，置于30r/min的脫色搖床上振搖反應(yīng)20min，然后用真空泵將溶 液抽干；再加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于脫色搖床上振搖lmin，用真空泵將溶 液抽干，再次加入DMF溶液洗滌樹脂，重復(fù)操作3次。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，其特征在于，步 驟⑵中所述的切割試劑100mL配置為：94ml TFA+2.5ml TIS+2.5ml H2CHlml EDT ;切割 反應(yīng)條件為：置于20r/min的脫色搖床上，于-20°C條件下切割反應(yīng)20min ;所述的沉降選 用-20°C低溫預(yù)冷的無(wú)水乙醚，離心沉降3次。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，其特征在于，步驟 (3)所述的溶劑為15%乙腈和水的混合溶液。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，其特征在于，步驟 (3) 所述的純化選用C18, 5um制備柱進(jìn)行反相高效液相色譜純化，以B. Cone/% (2 - 80)， 0 - IOOmin的梯度程序，9ml/min的流速進(jìn)行多肽的分離提純。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，其特征在于，步驟 (4) 所述的強(qiáng)陰離子交換樹脂為氯型強(qiáng)陰離子交換樹脂；室溫?cái)嚢栉絣h，之后將吸附液 補(bǔ)加醋酸含量到5%。10. -種權(quán)利要求1-9所述的方法制備的醋酸辛卡利特純品。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種固相合成制備醋酸辛卡利特的方法，該方法包括以下順序的制備步驟：將溶脹、脫保護(hù)并洗滌后的氨基樹脂與活化的保護(hù)氨基酸溶液于恒溫震蕩器中反應(yīng)，依次接入從樹脂起算第1-8個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸；將上述制得的辛卡利特前體肽Ⅰ-氨基樹脂脫保護(hù)并洗滌后抽干至顆粒狀，加入切割試劑，進(jìn)行切割反應(yīng)、沉降；將辛卡利特粗肽Ⅱ溶于溶劑中，經(jīng)反相高效液相色譜法純化得到辛卡利特多肽；將辛卡利特純品Ⅲ用1％醋酸溶解，采用強(qiáng)陰離子交換樹脂室溫?cái)嚢栉?，之后將吸附液補(bǔ)加醋酸，經(jīng)凍干得到醋酸辛卡利特Ⅳ。本發(fā)明大大降低了純品中三氟醋酸的含量；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品收率高。
【IPC分類】C07K7/06, C07K1/08, C07K1/18, C07K1/06, C07K1/04, C07K1/20
【公開(kāi)號(hào)】CN104987362
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510431615
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】合肥國(guó)肽生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月20日