一種基于nk3受體的合成肽nk3r-a1及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤血管生成作用的基于NK3受體的合成肽NK3R?A1。該合成肽該合成肽分子量為1330.46，具體序列為：NGRGGDFF(MeF)GLM?NH2；該合成肽采用Fmoc固相多肽合成法制備而成；可用于制備抗腫瘤制劑。通過體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它的抗血管生成作用，同時(shí)通過對(duì)其進(jìn)一步的雞胚尿囊膜載體實(shí)驗(yàn)以及具有豐富血管的小鼠S180移植瘤模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤的抑制效果明顯，具有抗腫瘤血管生成作用，且無明顯的毒副作用，具有較好的醫(yī)療應(yīng)用前景，同時(shí)也為腫瘤治療提供了十分具有潛力的靶向序列。
【專利說明】
一種基于NK3受體的合成肽NK3R-A1及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤血管生成作用的基于NK3受體的合成肽NK3R-A1。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，隨著全球經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，臨床診斷、手術(shù)治療、化療和放療等水平也不斷提高，但是傳統(tǒng)的腫瘤治療手段依舊不能緩解隨著環(huán)境日益嚴(yán)重而給人類帶來的健康威脅，尤其是近幾十年來癌癥患者的數(shù)目直線增長(zhǎng)，人們急需新的、有效的腫瘤治療策略和手段。自70年代，F(xiàn)olkman發(fā)現(xiàn)腫瘤血管形成因子(TAF)以來，人們對(duì)于血管生成有了新的認(rèn)識(shí)，尤其是近10年來，人們就血管生成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤是血管依賴型的惡性細(xì)胞，其生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)防均與腫瘤血管生成密切相關(guān)，而抗腫瘤血管生成策略也成為了腫瘤治療中的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的治療方法相比，抗腫瘤血管生成的治療方法更注重全方面的治療腫瘤，它通過改變腫瘤微環(huán)境，來防止腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。既降低了放/化療藥物的大規(guī)模細(xì)胞毒性作用，減少損傷正常細(xì)胞，又提高了藥物的靶向治療效果，目前普遍認(rèn)為，抗腫瘤血管生成治療具有高效、迅速、副作用少、一般不會(huì)產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]血管生成過程依賴于各個(gè)生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路的分泌與調(diào)控，因此，針對(duì)促血管生成因子的拮抗物質(zhì)，無論是從多肽藥物還是單抗藥物都成為了抗腫瘤血管生成的重要研究方向，例如針對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的單克隆抗體，其抗腫瘤活性作用已經(jīng)得到了美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的認(rèn)證。而近幾年來的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)激肽B(NKB)能夠可逆的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞血管網(wǎng)絡(luò)的形成，它通過與其速激肽家族主要結(jié)合受體NK3的結(jié)合可以介導(dǎo)消除Ca2+振蕩，并且增加3’-5’環(huán)化腺苷酸(cAMP)的含量從而來減少細(xì)胞的增殖、迀移以及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)，并誘導(dǎo)抗血管生成蛋白鈣網(wǎng)蛋白的產(chǎn)生。
[0004]目前對(duì)于NKB及其受體NK3的生物調(diào)節(jié)機(jī)理盡管已有了較多的基礎(chǔ)研究，但是仍然處于初步探索階段，而對(duì)于其在抗腫瘤血管生成方面的應(yīng)用研究尚需進(jìn)一步地進(jìn)行深入的探討研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明基于NK3受體及現(xiàn)有NKB結(jié)構(gòu)研究基礎(chǔ)上，提出設(shè)計(jì)了一種新的合成肽物質(zhì)NK3R-A1，該合成肽由甘氨酸柔性連接子將改造后與NK3受體有更高親和性且具有抗血管生成作用的多肽片段和具有靶向腫瘤血管的氨基肽酶N配體連接起來構(gòu)成。
[0006]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下所述。
[0007]一種基于NK3受體的合成肽NK3R-A1，該合成肽由兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域通過甘氨酸柔性連接子連接構(gòu)建而成，具體為由甘氨酸柔性連接子將與NK3受體結(jié)合的多肽片段和具有靶向腫瘤血管的氨基肽酶N配體連接起來構(gòu)成；
該合成肽分子量為1330.46 Da，序列如SEQ ID N0.1所示，具體序列為:Asn-Gly-Arg-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-NH2;即NGRGGDFF(MeF)GLM-NH2或者NGR-GG-DFF(MeF)GLM-NH2o
[0008]所述基于NK3受體合成肽NK3R-A1，采用Fmoc固相多肽合成法制備而成；具體過程如下:
(1)選用Rink樹脂與待合成肽C端的第一個(gè)Fmoc-氨基酸羧基以共價(jià)鍵形式連接，再以該氨基酸的N端作為該條多肽合成的起點(diǎn)，并讓其與下一個(gè)氨基酸的羧基端發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，形成肽鍵；
(2)然后，將N端的Fmoc-氨基酸的保護(hù)基進(jìn)行脫保護(hù)，再讓第二個(gè)氨基酸的N端與后面的氨基酸的羧基反應(yīng)，如此不斷重復(fù)這一過程直至多肽合成完畢；
(3)最后再將合成的多肽從樹脂上切割下來，經(jīng)過乙醚沉淀與洗滌，得到粗肽；
(4)經(jīng)過脫鹽處理，RP-HPLC分析純化，得到本發(fā)明所述的基于NK3受體的具有抗血管生成作用的合成肽NK3R-A1，所得合成肽NK3R-A1亦可進(jìn)一步置于-20 V凍存?zhèn)溆谩?br>[0009]所述基于NK3受體的合成肽NK3R-A1，用于抗腫瘤血管生成。
[0010]本發(fā)明基于現(xiàn)有NK3受體即NKB研究基礎(chǔ)上，對(duì)現(xiàn)有的NKB多肽序列(Asp-Phe-Phe-Val-Gly-Leu-Met-NH2)重新進(jìn)行了設(shè)計(jì)，通過將其纈氨酸(Val)替換為甲基苯丙氨酸(MePhe)，設(shè)計(jì)了一種新的改造肽，提高了其與NK3受體的親和性。為進(jìn)一步加強(qiáng)NKB的抗血管生成作用，降低其細(xì)胞毒性作用，發(fā)明人又整合進(jìn)氨基肽酶N配體的可耦聯(lián)藥物并起定位腫瘤血管作用的一段多肽序列(Asn-Gly-Arg)，通過甘氨酸柔性連接子將兩段序列連接后，可較好的保證新的合成肽序列具有一定的自由度，防止發(fā)生潛在的空間位阻問題而影響其與相應(yīng)受體結(jié)合而發(fā)揮作用。通過對(duì)合成肽NK3R-A1進(jìn)行體外細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它的抗血管生成作用，同時(shí)通過對(duì)其進(jìn)一步的雞胚尿囊膜載體實(shí)驗(yàn)以及具有豐富血管的小鼠S180移植瘤模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤的抑制效果明顯，具有抗腫瘤血管生成作用，且無明顯的毒副作用，具有較好的醫(yī)療應(yīng)用前景，同時(shí)也為腫瘤治療提供了十分具有潛力的靶向序列。本發(fā)明所提供的、新的合成肽序列NK3R-A1，具有較好的抗腫瘤血管生成作用，表現(xiàn)出了較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0011]圖1為所制備的NK3R-A1的ES1-MS質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果；
圖2為NK3R-A1在25μΜ時(shí)，對(duì)于HUVECs增殖的影響；
圖3為NK3R-A1在25μΜ時(shí)，在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中對(duì)于HUVECs迀移的影響；
圖4為ΝΚ3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中拮抗NK3R-A1抑制作用的情況；
圖5為NK3R-A1在細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)中對(duì)于HUVECs迀移的影響；
圖6為NK3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]在細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)中拮抗NK3R-A1抑制作用的情況；
圖7為NK3R-A1在雞胚尿囊膜實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)結(jié)果，其中(a)相對(duì)血管密度情況，(b)為相對(duì)血管面積情況；
圖8為雞胚尿囊膜(CAM)載體實(shí)驗(yàn)情況，其中(a)為受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]拮抗NK3R-A1時(shí)血管密度對(duì)比情況，(b)為受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]拮抗NK3R-Al時(shí)血管面積對(duì)比情況；
圖9為NK3R-AI對(duì)荷S180的BABL/c小鼠體重變化的影響結(jié)果圖；
圖10為NK3R-A1對(duì)荷S180的BABL/c小鼠移植瘤體積變化的影響結(jié)果圖；
圖11為NK3R-AI對(duì)荷S180的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)介紹，但在介紹具體實(shí)施例前，首先對(duì)本發(fā)明中所用到部分實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備等情況簡(jiǎn)要介紹如下。
[0013]生物材料:
S180細(xì)胞(鼠肉瘤細(xì)胞)、HUVECs(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，購(gòu)買于ATCC(American TypeCulture Collect1n)；
白蘭雞雞胚，從鄭州市某市場(chǎng)購(gòu)得；
SPF級(jí)5?8周齡BALB/c雌鼠(50只)，購(gòu)買于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；
實(shí)驗(yàn)試劑:
Fmoc多肽固相合成的Rink樹脂、Fmoc保護(hù)的L型氨基酸，為吉爾生化(上海)有限公司產(chǎn)品;
Fmoc多肽固相合成中的洗滌試劑、1-羥基苯并三唑(HOBt)、N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM)、茚三酮、六氫吡啶、呢啶、醋酸酐、三氟乙酸(TFA)、乙腈等，自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；
RPM1-1640培養(yǎng)基，為北京Solarb1公司產(chǎn)品；
磷酸鹽緩沖液(PBS)配置相關(guān)試劑，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；
FBS(胎牛血清)，購(gòu)自杭州四季青生物有限公司；
MTT(噻唑藍(lán))，為美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；
實(shí)驗(yàn)設(shè)備:
多肽合成儀，江蘇通州市南興申海玻儀廠；
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52，上海亞榮生化儀器廠；
RP-HPLC分析儀，日本島津公司；
酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，MD公司；
倒置顯微鏡AE2000，Olympus公司；
NIS ELEMENT 2.20生物圖像處理系統(tǒng)，Nikon。
[0014]實(shí)施例1
本發(fā)明所提供的合成肽NK3R-A1，分子量為1330.46，具體序列為:Asn-Gly-Arg-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met_NH2;通過Fmoc固相多肽合成法制備而成。以某次合成0.1592克的合成肽NK3R-A1為例，具體制備步驟詳細(xì)介紹如下。
[0015](I)稱取0.3gRink樹脂放入DMF(N，N-二甲基甲酰胺)潤(rùn)洗過的多肽合成儀中，然后加入4 mLDMF，靜置30min，使樹脂充分溶脹，然后用真空栗抽去DMF;脫保護(hù)兩次:
所述脫保護(hù)是指在合成儀中加入4 mL脫保護(hù)液(哌啶與DMF的體積比為1: 3)，25°028°C下攪拌反應(yīng)20min，真空栗抽干。
[0016](2)將步驟(I)中脫保護(hù)后的樹脂按以下順序及次數(shù)進(jìn)行洗滌，DMF兩次—MeOH三次—DCM三次—DMF兩次，搖床中震蕩洗滌，每次洗滌兩分鐘，洗滌結(jié)束時(shí)用真空栗將液體抽干。
[0017](3)第一個(gè)氨基酸的添加:按公式I稱取甲硫氨酸、HoBt及DIC對(duì)應(yīng)的量，分別為278.625mg、101.3475mg、94.65yL，先用4 mL DMF溶解甲硫氨酸和HoBt加入合成儀中，然后直接在合成儀中加入DIC，250C-280C下攪拌反應(yīng)2.5h;
所述公式I為:氨基酸的質(zhì)量=該氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量X 2.5(當(dāng)量)X樹脂的質(zhì)量；
然后洗滌，洗滌方法同步驟(2)中的洗滌要求，洗滌結(jié)束時(shí)用真空栗將液體抽干；
用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)為290nm處樹脂和第一個(gè)氨基酸的吸光度0D，根據(jù)公式計(jì)算取代值，加封頭液封頭兩次，每次20min，在搖床中震蕩，然后洗滌，洗滌方法同步驟(2)中的洗滌要求；
取代值計(jì)算公示為:取代值=OD八1.65 Χ_§)，_§為樹脂的質(zhì)量。
[0018](4)第二個(gè)氨基酸即亮氨酸的添加:合成時(shí)是從C端到N端方向進(jìn)行，對(duì)步驟(3)中第一個(gè)氨基酸添加后樹脂脫保護(hù)兩次，方法及步驟同步驟(I)中的脫保護(hù)；
然后洗滌，洗滌方法及步驟同步驟(2 )中洗滌；
然后挑取樹脂茚檢呈藍(lán)色時(shí)，按公式2稱取第二個(gè)氨基酸亮氨酸、HoBt、DIC的量，分別為172.2825mg、65.875875mg、61.5225yL，先用4 mL DMF溶解亮氨酸和HoBt加入合成儀中，然后直接在合成儀中加入DIC，25°C~28°C下攪拌反應(yīng)2.5h;
反應(yīng)結(jié)束后按步驟(2)的方法洗滌樹脂，洗滌結(jié)束后挑取樹脂茚檢呈無色；
所述公式2為:氨基酸的量=該氨基酸的相對(duì)分子質(zhì)量(此處為亮氨酸)X 2.5 X樹脂的質(zhì)量(此處為0.3) X取代值(此處為步驟(3)中取代值計(jì)算結(jié)果)。
[0019](5)后續(xù)氨基酸的添加:后續(xù)氨基酸的添加方法同第二個(gè)氨基酸的添加過程，直至加完所有氨基酸;其中茚檢樣品時(shí)，顯色要求有所調(diào)整，茚檢時(shí)，若前一個(gè)氨基酸是脯氨酸、絲氨酸和組氨酸時(shí)則茚檢呈紅棕色。
[0020](6)切割多肽:從樹酯上切割多肽，首先按步驟(I)中的脫保護(hù)方法進(jìn)行兩次;洗滌(同步驟(2));然后進(jìn)行切割；
所述切割為，將切割試劑加入合成儀中，攪拌柱攪拌三小時(shí)，然后將合成儀中的液體抽入球形燒瓶中，并用DCM沖洗3遍；
把球形燒瓶裝在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)I小時(shí)；
在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加2mL TFA冰切30min;
在球形燒瓶中加入乙醚再蒸發(fā)5次，最后加入冰乙醚在冰上靜置30min，白色沉淀即為析出的粗肽；
將含粗肽的乙醚溶液2000rpm離心2min，得粗肽沉淀，把粗肽在37 °C烘箱中烘干(烘干約需3h);
需要強(qiáng)調(diào)的是，所述切割試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，其具體組成配比為:三蒸水0.3mL、苯甲硫醚0.3mL、I，2-二硫醇0.15mL、苯酚0.3mL、三氟乙酸TFA4.95 mL。
[0021 ] (7)粗肽純化:利用RP-HPLC純化粗肽，純化體系為:乙腈，l%o，TFA=25%?50%；流速5min/mL，檢測(cè)波長(zhǎng)是228nm ；
純化后所得精肽即為本發(fā)明所述靶向基于NK3受體的合成肽NK3R-A1，純度檢測(cè)表明，純化后后其純度大于95%，可于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022]對(duì)純化后的基于NK3受體的合成肽NK3R-A1進(jìn)行ES1-MS質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如圖1。從圖1中可以看出，所制備的合成肽NK3R-A1的分子量符合預(yù)期。
[0023]實(shí)施例2
對(duì)于實(shí)施例1所制備的合成肽NK3R-A1，發(fā)明人對(duì)其抗腫瘤血管生成作用進(jìn)行了具體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，相關(guān)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)要介紹如下。
[0024]一、體外抗血管生成作用驗(yàn)證
1、細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
運(yùn)用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了NK3R-A1對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs )增殖情況影響的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)過程如下所述。
[0025](I)將HUVECs以2X 14個(gè)/mL的細(xì)胞密度，以200yL/孔的體積接種到96孔板中；
(2)24小時(shí)后，待細(xì)胞貼壁良好，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行饑餓處理，使細(xì)胞周期處于G0/G1期；
(3 )饑餓處理后，合成肽NK3R-A1以100、25、5μΜ的濃度梯度分組，每組5個(gè)復(fù)孔，共6組實(shí)驗(yàn)組；同時(shí)，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組，環(huán)磷酰胺(7.5mg/mL)為陽性對(duì)照組，對(duì)HUVECs藥物處理4小時(shí)；
(4)4小時(shí)后，每孔補(bǔ)加20yL血清，再分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后取樣，用酶標(biāo)儀(酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀)在490nm處測(cè)其OD值。
[0026]實(shí)驗(yàn)期間，HUVECs在37°C、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每次檢測(cè)后，繪制相應(yīng)OD值柱狀圖。
[0027]需要注意的是，NK3R-A1使用時(shí)，先溶于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中制成多肽藥物，過濾除菌后直接使用，或者過濾除菌后-20°C分裝保存，備用;環(huán)磷酰胺用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基溶解到所用劑量后直接使用。
[0028]部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，25μΜ濃度的合成肽NK3R-A1并沒有明顯抑制HUVECs的增殖，而陽性對(duì)照環(huán)磷酰胺組相較于陰性對(duì)照組有極其顯著的差異
0.001)，對(duì)HUVECs的增殖有很強(qiáng)的抑制作用。
[0029]在進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)后，發(fā)明人認(rèn)為NK3R-A1并沒有明顯抑制HUVECs的增殖，所以發(fā)明人為進(jìn)一步檢測(cè)上述多肽的抗血管生成作用，進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)，來檢測(cè)NK3R-A1對(duì)于HUVECs迀移情況的影響。
[0030]2、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)
由于合成肽NK3R-A1并沒有明顯抑制HUVECs的增殖，為此我們進(jìn)一步進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)NK3R-A1對(duì)于HUVECs迀移情況的影響，過程簡(jiǎn)要介紹如下。
[0031](I)將HUVECs以I X 15個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于24孔板中，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到90%以上后，用200yL槍頭輕輕地沿著標(biāo)記進(jìn)行劃痕；
(2)隨后，用PBS將劃去的細(xì)胞清洗干凈，和MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)一樣，將NK3R-A1分別以3個(gè)不同濃度(100、25、5μΜ)加入每個(gè)復(fù)孔中，每個(gè)濃度為一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組；
(3)然后，對(duì)HUVECs進(jìn)行藥物處理24小時(shí)，每隔6小時(shí)在倒置顯微鏡下以40X的放大倍數(shù)進(jìn)行觀察拍照記錄，并按照下述公式計(jì)算各個(gè)時(shí)間段的劃痕愈合程度并繪制柱狀圖； 計(jì)算公式:[1-(6小時(shí)一24小時(shí)的相對(duì)區(qū)域/0小時(shí)的相對(duì)區(qū)域)]X 100%。
[0032]實(shí)驗(yàn)期間，HUVECs在37°C、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0033]部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，NK3R-A1有抑制HUVECs迀移的作用，NK3R-A1的25μΜ組在24小時(shí)的“傷口”愈合程度是陰性對(duì)照組的四分之一，有極其顯著的差異(*#ρ〈0.001)，說明實(shí)驗(yàn)組HUVECs的迀移速度慢于陰性對(duì)照組，即，NK3R-A1對(duì)于HUVECs的迀移有很好的抑制效果。
[0034]在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，發(fā)明人做了進(jìn)一步的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn):以NK3受體的選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10](50yM)來拮抗NK3R-A1，從而進(jìn)一步驗(yàn)證驗(yàn)證合成肽NK3R-A1對(duì)于HUVECs的抑制迀移的作用，過程簡(jiǎn)要介紹如下。
[0035](I)將HUVECs以I X 15個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于24孔板中；
(2)待細(xì)胞鋪板率達(dá)到90%以上后，用200yL槍頭輕輕地沿著標(biāo)記進(jìn)行劃痕，隨后，用PBS將劃去的細(xì)胞清洗干凈；
(3)由于在上述細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，25μΜ實(shí)驗(yàn)組和其他濃度實(shí)驗(yàn)組相比體現(xiàn)出了最好的抑制效果，所以在競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人選擇了藥物的最佳抑制濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且，為了保證ΝΚ3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]的拮抗作用，先用拮抗劑處理細(xì)胞I小時(shí)；
(4)1小時(shí)后，吸出舊培養(yǎng)基，PBS沖洗一遍，再用25μΜ的NK3R-A1處理細(xì)胞24小時(shí)，每隔6小時(shí)在倒置顯微鏡下以40Χ的放大倍數(shù)進(jìn)行觀察拍照記錄，并按照下述公式計(jì)算各個(gè)時(shí)間段的劃痕愈合程度并繪制柱狀圖；
計(jì)算公式:[1-(6小時(shí)一24小時(shí)的相對(duì)區(qū)域/0小時(shí)的相對(duì)區(qū)域)]X 100%。
[0036]實(shí)驗(yàn)期間，HUVECs在37°C、5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0037]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，NK3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3_10]處理后的“傷口”愈合程度在24小時(shí)后，與陰性對(duì)照無差別，表明拮抗劑較好拮抗了NK3受體;而與25口1的爾31?41處理組的“傷口”愈合程度相比，則有著顯著差異(*郵〈0.01)。這一結(jié)果說明NK3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]可以部分拮抗NK3R-A1的抑制HUVECs迀移的作用，或者說初步印證了這條多肽的作用機(jī)理。
[0038]3、細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)
為進(jìn)一步驗(yàn)證NK3R-A1抑制HUVECs迀移的作用，發(fā)明人以8.0μηι的Transwe 11小室進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)(BD公司)，實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)介如下。
[0039](I)HUVECs依次先后經(jīng)過無血清RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓處理12小時(shí)，不同藥物濃度(100、25、5μM)的NK3R-Al處理12小時(shí)，無血清培養(yǎng)基處理后，收集細(xì)胞并用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸；
(2)以1.5\105個(gè)/1^的細(xì)胞密度接種于1'瓜118￥611上室中，每孔20(^1^，下室加入75(^1^含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入37°C、5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)；
(3)培養(yǎng)結(jié)束后，將舊的培養(yǎng)基吸出，用I3BS清洗2遍；
(4)用3.8%的多聚甲醛固定細(xì)胞20min;到時(shí)間后，用I3BS清洗2遍；
(5 )用0.2%的結(jié)晶紫染色15min;到時(shí)間后，用I3BS清洗5遍；
(6)清洗干凈后，向每孔加入適量的超純水，放到倒置顯微鏡下以40 X的放大倍數(shù)進(jìn)行觀察拍照計(jì)數(shù)并繪制柱狀圖。
[0040]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。從圖5中可以看出，NK3R-A1有抑制HUVECs迀移的作用，陰性對(duì)照組迀移的細(xì)胞數(shù)是5μΜ NK3R-A1時(shí)迀移的HUVECs的細(xì)胞數(shù)的4.3倍，有極其顯著的差異(*林p〈0.0Ol )，再一次說明了它有抑制HUVECs迀移的能力。
[0041]和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)一樣，發(fā)明人也做了細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，依舊運(yùn)用NK3受體拮抗劑[GI y6 ] NKB [ 3-10 ] (I ΟμΜ )拮抗NK3R-AI的抑制作用，證明它的作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)要說明如下。
[0042](I)HUVECs依次先后經(jīng)過無血清RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓處理12小時(shí)，為保證ΝΚ3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]的拮抗作用，先用拮抗劑處理細(xì)胞I個(gè)小時(shí)；
(2)1小時(shí)后，用上述細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)中的最佳抑制濃度5μΜ的NK3R-A1再處理細(xì)胞12小時(shí)，無血清培養(yǎng)基處理后，收集細(xì)胞并用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸；
(3 )以1.5 X 15個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于Transwel I上室中，每孔200yL，下室加入750yL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入37°C、5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)；
(4)培養(yǎng)結(jié)束后，將舊的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗2遍；
(5)用3.8%的多聚甲醛固定細(xì)胞20min;到時(shí)間后，用I3BS清洗2遍；
(6 )用0.2%的結(jié)晶紫染色15min;到時(shí)間后，用I3BS清洗5遍；
(7)清洗干凈后，向每孔加入適量的超純水，放到倒置顯微鏡下以40 X的放大倍數(shù)進(jìn)行觀察拍照計(jì)數(shù)并繪制柱狀圖。
[0043]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。從圖6中可以看出，在用NK3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3_10]處理細(xì)胞I小時(shí)后，和用5μΜ的NK3R-A1的處理組相比，有極其顯著的差異(*林p〈0.001)，其發(fā)生迀移的細(xì)胞數(shù)量有大幅度的增加，說明NK3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]可以拮抗NK3R-A1的抑制HUVECs迀移的作用。
[0044]綜合上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出，NK3R-A1作為一種基于NK3受體的合成肽，可以通過與NK3受體的高親和作用結(jié)合，從而發(fā)揮抗血管生成作用;MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)于HUVECs的增殖并沒有明顯的抑制作用，而細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，合成肽NK3R-A1對(duì)于HUVECs的迀移有著明顯的抑制作用。HUVECs是體外血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭型ǔ＿x用的經(jīng)典細(xì)胞系，基于NK3受體的合成肽NK3R-A1對(duì)其的迀移抑制作用，可以初步證明NK3R-A1的抗血管生成作用。
[0045]二、載體實(shí)驗(yàn)對(duì)合成肽NK3R-A1抗血管生成作用的驗(yàn)證
發(fā)明人采用雞胚尿囊膜(CAM)載體實(shí)驗(yàn)對(duì)合成肽NK3R-A1的抗血管生成作用進(jìn)行了更加直觀的驗(yàn)證，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)要介紹如下。
[0046](I)雞胚使用速黃雞胚，保持37 0C的孵化溫度和55%的相對(duì)濕度，每小時(shí)翻轉(zhuǎn)雞蛋一次，到孵化的第7天在雞胚的頭部附近小心的開一I?2cm的小窗，然后用消過毒的玻璃片封閉窗口；
(2)在第8天，把一個(gè)直徑為6mm，厚度為Imm的無菌娃膠環(huán)放置在雞頭下方無血管區(qū)域；
(3)合成肽NK3R-A1分別以1001^、101^、1碰的濃度梯度分組，將3(^1^目應(yīng)濃度藥物加入到步驟2中先前放入的硅膠環(huán)中心，并在第10天對(duì)其拍照；以PBS處理作為陰性對(duì)照組。
[0047]解剖并拍照記錄，并使用生物圖像處理軟件進(jìn)行圖像處理(NIS-Elements BasicResearch，尼康，日本)，并按下述公式統(tǒng)計(jì)雞胚尿囊膜加藥區(qū)域的微血管數(shù)和微血管面積(只計(jì)算ΙΟΟμπι以下的血管)，公式如下:
[加藥雞胚血管數(shù)/空白對(duì)照雞胚血管數(shù)]X100%=%相對(duì)血管密度； [加藥雞胚血管面積/空白雞胚血管面積]X 100%=%相對(duì)血管面積。
[0048]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，從圖中可以看出，合成肽NK3R-A1具有明顯的抗血管生成作用。具體而言，與陰性對(duì)照組相比，10nM的NK3R-A1實(shí)驗(yàn)組具有差異和顯著差異(*p〈0.05 ;**p〈0.01)，而合成肽NK3R-A1最高能減少微血管密度到70.5%，血管面積到75.2%。這些結(jié)果均說明了合成肽NK3R-A1具有很好的抗血管生成效果。
[0049]進(jìn)一步地，以NK3受體拮抗劑[Gly6]NKB[3-10](lyM)為例，進(jìn)行了載體實(shí)驗(yàn)的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)，以對(duì)合成肽NK3R-A1的抗血管生成作用的作用機(jī)理有初步的探討。實(shí)驗(yàn)過程簡(jiǎn)述如下。
[0050](I)雞胚使用速黃雞胚，保持37 0C的孵化溫度和55%的相對(duì)濕度，每小時(shí)翻轉(zhuǎn)雞蛋一次，到孵化的第7天在雞胚的頭部附近小心的開一I?2cm的小窗，然后用消過毒的玻璃片封閉窗口；
(2)在第8天，把一個(gè)直徑為6mm，厚度為Imm的無菌娃膠環(huán)放置在雞頭下方無血管區(qū)域；
(3)為保證NK3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]的拮抗作用，先用30yL的ΙμΜ的拮抗劑處理細(xì)胞I個(gè)小時(shí)，隨后，將30yL、100nM的NK3R-A1加入到步驟2中先前放入的硅膠環(huán)中心，并在第10天對(duì)其拍照；以PBS處理作為陰性對(duì)照組。
[0051]解剖并拍照記錄，參考上述計(jì)算方式統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)雞胚尿囊膜加藥區(qū)域的微血管數(shù)和微血管面積。
[0052]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，從圖中可以看出，NK3R_A1的抗血管生成作用能夠部分被NK3受體選擇性拮抗劑[Gly6]NKB[3-10]所抑制。具體而言，10nM的合成肽NK3R-A1實(shí)驗(yàn)組和拮抗組相比具有差異(*P〈0.05);而和陰性對(duì)照組相比，聯(lián)合使用拮抗劑和NK3R-A1實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)血管密度和血管面積分別增加到了 79.1%和84.5%;這一載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了合成肽NK3R-A1的作用機(jī)理。
[0053]CAM是研究抗血管生成中較為廣泛使用的一種載體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，它的二維空間血管結(jié)構(gòu)使其無需特別的準(zhǔn)備便能觀察微血管結(jié)構(gòu)變化，因而成為一個(gè)測(cè)試促血管或抗血管生成藥物常用的試驗(yàn)器官。從上述CAM載體實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，NK3R-A1作為一種基于NK3受體的合成肽，可以通過和NK3受體的相互作用而發(fā)揮抗血管生成作用。
[0054]三、合成肽NK3R-A1抗腫瘤活性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
為進(jìn)一步檢驗(yàn)合成肽NK3R-A1的抗腫瘤活性，以實(shí)施例1所制備的合成肽NK3R-A1進(jìn)一步進(jìn)行了抗腫瘤相關(guān)實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)情況如下所述。
[0055]抑瘤率實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過程如下:
(I)于每只小鼠的右前肢腋下荷I X 17個(gè)瘤細(xì)胞，待小鼠的瘤體積達(dá)到50?10mm3時(shí)按瘤體積隨機(jī)分組，分為4組，分別為NK3R-A1高劑量組、NK3R-A1低劑量組、環(huán)磷酰胺組(陽性對(duì)照組)和生理鹽水組(陰性對(duì)照組)，每組5只；
所述高劑量是指將合成肽NK3R-A1直接溶于生理鹽水配成0.1mg/mL的溶液，按lmL/Kg注射用量注射；
所述低劑量是指將NK3R-A1直接溶于生理鹽水配成0.02mg/mL的溶液，按lmL/Kg(SPlOOOyg/Kg)注射用量注射；
環(huán)磷酰胺直接溶于生理鹽水配成2.5mg/mL的溶液，按0.2mL/Kg( S卩SOOlIgzKg)注射用量注射；
需要注意的是，將合成肽NK3R-A1(或環(huán)磷酰胺)溶于生理鹽水后，需過濾除菌，為使用方便期間，可過濾除菌后分裝后_20°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)尾靜脈給藥的方式注射，共給藥14天;各組每天上午給藥;實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食和飲水；
(3)實(shí)驗(yàn)期間每日測(cè)量小鼠體重并記錄，繪制曲線，以評(píng)價(jià)合成肽NK3R-A1的毒副作用；同時(shí)每日測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)(a)短(b)徑，并按公式(計(jì)算公示為:V=l/2 X (a Xb2))計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線;給藥結(jié)束的第二天將小鼠脫頸處死取出腫瘤并稱重。
[0056]小鼠體重變化曲線如圖9所示，小鼠腫瘤體積變化曲線如圖10所示，小鼠瘤重情況如圖11所示。
[0057]從圖9中可以看出，合成肽NK3R-A1給藥組的體重變化在正常范圍內(nèi)，表明該合成肽沒有明顯的毒副作用，對(duì)比陽性對(duì)照環(huán)磷酰胺組，小鼠的體重并沒有隨時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，說明其具有一定的毒副作用。從圖10、圖11我們可知，合成肽NK3R-A1給藥組的瘤體積和瘤重比陰性對(duì)照即生理鹽水組都要小，具有顯著和極其顯著差異(**p〈0.01;
0.001)，且低濃度顯示出更明顯的效果，因此可以認(rèn)為合成肽NK3R-A1具有較好地抗腫瘤效果O
[0058]現(xiàn)有技術(shù)中，環(huán)磷酰胺作為一種廣譜性的細(xì)胞周期非特異性抗癌藥物，可用于多種類型腫瘤的治療，但由于其不具備靶向特定腫瘤細(xì)胞的功能，因而長(zhǎng)期使用時(shí)存在較大毒副作用的潛在危險(xiǎn)。本發(fā)明所提供的合成肽NK3R-A1，由于包含有氨基肽酶N配體序列，而該序列具有特定革G向腫瘤細(xì)胞的功能(Arap W.et.al.,Cancer treatment by targeteddrug delivery to tumor vasculature in a mouse model，Science，1998，279:377-380)，因而使得合成肽NK3R-A1能夠明顯降低非特異性(非靶向性)抗癌藥物所帶來的毒副作用風(fēng)險(xiǎn)，因而使得合成肽NK3R-A1的具有較好地推廣應(yīng)用前景。
[0059]現(xiàn)有研究表明，神經(jīng)激肽B(NKB)可以和其速激肽家族受體結(jié)合發(fā)揮抗血管生成作用，并且這種作用首先是NKB通過與速激肽受體家族成員NK3受體的結(jié)合而發(fā)揮出來的(Pennefather JN,et.al.,Tachykinins and tachykinin receptors:a growing family,Life Sc1.，2004，74(12): 1445-1463)。通過將NKB第7號(hào)氨基酸纈氨酸(Val)替換為甲基苯丙氨酸(MePhe)，得到了與NK3受體高親和的改造肽，研究發(fā)現(xiàn)，其也具有十分良好的抗血管生成作用。但是，由于NKB作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，在生物體內(nèi)廣泛表達(dá)，直接用于腫瘤治療，會(huì)產(chǎn)生比較大的毒副作用。
[0060]在避免可能存在的空間位阻的設(shè)計(jì)原則基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過甘氨酸柔性連接子將基于NKB的改造肽與氨基肽酶N配體序列(Asn-Gly-Arg)連接，構(gòu)建了新的合成肽NK3R-A1，而新的合成肽NK3R-A1可較為充分利用氨基肽酶N配體靶向腫瘤血管的功能，將NKB的改造序列定位在腫瘤血管附近，從而減少NKB潛在的毒副作用并提高其作用效果。而一系列的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)載瘤實(shí)驗(yàn)，均證明了新的合成肽NK3R-A1具有較好的抗腫瘤血管生成作用和抑制腫瘤作用，加上多肽類試劑的無毒副作用及較為成熟的制備方法，使得本發(fā)明在腫瘤預(yù)防與治療應(yīng)用中具有較好的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于NK3受體的合成肽NK3R-A1，其特征在于，該合成肽該合成肽分子量為1330.46 Da，序列如SEQ ID N0.1所示，其中第9位氨基酸為甲基化修飾的苯丙氨酸;該合成肽的具體氨基酸序列為:Asn-Gly-Arg-Gly-Gly-Asp-Phe-Phe-MePhe-Gly-Leu-Met-Mfe ；即NGRG⑶FF(MeF)GLM-NH2。2.權(quán)利要求1所述基于NK3受體合成肽NK3R-A1的制備方法，其特征在于，采用Fmoc固相多肽合成法制備而成。3.權(quán)利要求1所述基于NK3受體的合成肽NK3R-A1在制備抗腫瘤制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106008673SQ201610442180
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月20日
【發(fā)明人】王婷, 陳思偉, 石梁, 陳鯉翔, 王成功, 安秀麗, 祁元明, 高艷鋒, 李國(guó)棟
【申請(qǐng)人】鄭州大學(xué)