一種榛仁ace抑制肽及其制備方法
【專利摘要】一種榛仁ACE抑制肽及其制備方法，屬于ACE抑制肽技術(shù)領(lǐng)域。榛仁ACE抑制肽為T(mén)LVGR(Thr?Leu?Val?Gly?Arg)和AVKVL(Ala?Val?Lys?Val?Leu)。是以長(zhǎng)白山榛仁為原料，采用酶控制水解技術(shù)制備ACE抑制肽并通過(guò)離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和反相高效液相層析等技術(shù)分離純化，經(jīng)此方法得到的多肽活性及純度較高，雜質(zhì)較少。在最優(yōu)的酶解及分離純化條件下，得到的兩種ACE抑制肽TLVGR的IC50值為0.2493mg/mL，AVKVL的IC50值為0.07306mg/mL。
【專利說(shuō)明】
一種榛仁ACE抑制肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于ACE抑制肽技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種榛仁ACE抑制肽及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]目前，高血壓患者的主要治療藥為能夠抑制ACE活性的賴諾普利和卡托普利等化學(xué)合成類(lèi)藥物，雖然能夠暫時(shí)緩解高血壓癥狀，但卻有許多毒副作用，如皮疹、高血鉀、腎臟硬化、白細(xì)胞減少等，因此開(kāi)發(fā)和使用天然來(lái)源降血壓藥物則顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)天然植物蛋白質(zhì)經(jīng)體外酶解后，能夠產(chǎn)生具有特殊生理功能的活性肽，如促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、 抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等作用，食用安全性極高，是極具發(fā)展前景的功能因子。除此之外，現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn):人類(lèi)攝食的蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶作用后，大多是以低肽形式消化吸收的，多肽比游離氨基酸的生物效價(jià)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高。其中ACE抑制肽在體外對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-1(ACE)有抑制作用，體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)血壓正常者無(wú)降壓作用，只對(duì)高血壓患者起到降壓作用，是一種無(wú)任何毒副作用并極具市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力的降血壓藥物。
[0003]長(zhǎng)白山榛子中蛋白質(zhì)含量大概占15-30%，各類(lèi)氨基酸含量比較均衡，且包含多種人體必需氨基酸，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，但目前對(duì)榛子的研究和利用主要集中在油脂的提取和加工方面，對(duì)蛋白資源利用極少，尤其是油脂加工副產(chǎn)物脫脂柏中蛋白含量高達(dá)40%以上，以其為原料進(jìn)行各種活性肽的開(kāi)發(fā)，將對(duì)長(zhǎng)白山榛子資源的綜合利用具有極大的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供一種榛仁ACE抑制肽的制備方法，以長(zhǎng)白山榛仁為原料， 采用酶控制水解技術(shù)制備ACE抑制肽并通過(guò)離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和反相高效液相層析等技術(shù)分離純化，經(jīng)此方法得到的多肽活性及純度較高，雜質(zhì)較少。
[0005]本發(fā)明的目的之二是對(duì)榛仁ACE抑制肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，采用高效液相色譜-電噴霧飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ES1-TOF MS/MS)技術(shù)并經(jīng)從頭測(cè)序(de novo)方法進(jìn)行質(zhì)譜解析，鑒定出 2 種新的榛仁 ACE 抑制肽 TLVGR(Thr-Leu-Val-Gly-Arg)和 AVKVL(Ala-Val-Lys-Val-Leu)，旨在為降血壓藥物的合成和榛仁ACE抑制肽構(gòu)效關(guān)系研究提供理論基礎(chǔ)。
[0006]—種榛仁ACE抑制肽的制備方法，所述ACE抑制肽包括兩條肽，分別為五肽TLVGR和 AVKVL，其步驟如下:
[0007](l)ACE抑制肽的制備[〇〇〇8] 取2?5g榛仁分離蛋白(堿溶酸沉法制備，參考《Funct1nal Properties of the Protein Isolate and Major Fract1ns of Pine Nut Proteins Prepared from the Changbai Mountain in China》，Dan Wu，Wei_hong Min)，加lOOmL蒸饋水?dāng)埶ぃ?0?10CTC 水浴10?20min使蛋白變性，冷卻至室溫，用0.6mol/L NaOH調(diào)pH值7?10,然后加入 Alcalase 2.4L(堿性蛋白酶一種)，加酶量4000?8000U/g分離蛋白，在40?70°C下水解2? 5h，保持pH值不變，反應(yīng)結(jié)束后迅速于90°C下加熱10?20min滅酶，然后冷卻至室溫，用HC1調(diào)節(jié)pH值至中性后5000?8000r/min離心10?20min，上清液冷凍干燥，即得粗榛仁ACE抑制肽，4°C保存；
[0009] (2)ACE抑制肽的分離純化
[0010]將冷凍干燥后的粗榛仁ACE抑制肽，加入蒸餾水配成溶液，過(guò)0.22WI1濾膜后，進(jìn)行離子交換層析，緩沖溶液A為15?25mmol/L Tris-HCl，緩沖溶液B為0.5?2mol/L NaCl，使用紫外檢測(cè)儀在280nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，收集4種組分，真空冷凍干燥，測(cè)定ACE抑制率;然后將離子交換層析得到的抑制率最高組分進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，多肽中的組分按分子量大小依次分離，收集2種組分，真空冷凍干燥，測(cè)定ACE抑制率;將抑制率最高組分富集進(jìn)行反相高效液相層析，收集6種組分，真空冷凍干燥，測(cè)定ACE抑制率，ACE抑制率最高的多肽組分即本發(fā)明所述的榛仁 ACE 抑制肽，同時(shí)包括 TLVGR(Thr-Leu-Val-Gly-Arg)和 AVKVL(Ala-Val-Lys-Val-Leu)〇
[0011] (3)ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)鑒定[0〇12]采用ES1-TOF MS/MS鑒定ACE抑制肽的氨基酸序列，運(yùn)用de novo方法進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析。[0〇13]步驟⑵中所述的離子交換層析采用陰離子交換柱，上樣濃度1?l〇mg/mL(粗榛仁 ACE抑制肽加蒸餾水配制成的溶液濃度)，上樣體積5?20mL，平衡流速1?5mL/min，0 %? 100 % B線性洗脫，洗脫流速0.1?5mL/min。
[0014]步驟(2)中所述的凝膠過(guò)濾層析采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱，洗脫液為純水，上樣濃度10?50mg/mL，上樣量1?10mL，洗脫流速0.1?5mL/min。
[0015]步驟(2)中所述的反相高效液相層析采用C18色譜柱，流動(dòng)相A為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%1?4的乙腈，8為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%1?4的水，上樣濃度10?5011^/1^，進(jìn)樣體積10?80 yL，100 ?60%B 線性洗脫 30 ?60min;流速0.1 ?lmL/min。
[0016]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為:
[0017]本發(fā)明首次公開(kāi)了一種榛仁ACE抑制肽的制備方法，采用Alcalase酶解榛仁分離蛋白進(jìn)行制備并純化鑒定出兩條ACE抑制肽，Alcalase是一種絲氨酸蛋白酶，屬非特異性內(nèi)切酶，主要作用于含有酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸的肽鍵，酶切位點(diǎn)主要位于多肽鏈的內(nèi)部與末端肽鍵。故采用Alcalase水解度高，能夠得到肽鏈較短的小肽，研究發(fā)現(xiàn)小肽ACE抑制作用更強(qiáng)，且更有利人體小腸的吸收，無(wú)毒副作用、性質(zhì)溫和、具有較好的降血壓功能。本發(fā)明公布的分離純化方法可以將不同帶電性、不同分子量、不同極性的多肽分開(kāi)，凝膠層析分離可以將離子交換層析中引入的鹽除去，分離路線設(shè)計(jì)合理。在質(zhì)譜解析中，針對(duì)NCBI中已鑒定的植物蛋白數(shù)量較少的情況，采用常規(guī)的Uniprot全序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與分析并不適用，因此采用de novo法確定組分的序列結(jié)構(gòu)可以防止活性組分的遺漏。在最優(yōu)的酶解及分離純化條件下，得到的兩種ACE抑制肽TLVGR的IC5Q值為0.2493mg/mL，AVKVL的IC5Q值為 0.07306mg/mL。這個(gè)指標(biāo)體現(xiàn)的是制備的肽在體外抑制ACE活性的強(qiáng)弱(能夠使ACE活性降低一半時(shí)所需的肽含量)，此數(shù)值越低，表明ACE抑制活性越高?！靖綀D說(shuō)明】[〇〇18]圖1為離子交換層析分離圖；
[0019]圖2為凝膠過(guò)濾層析分離圖；
[0020]圖3為反相高效液相層析分離圖；
[0021]圖4為ACE抑制肽TLVGR的質(zhì)譜圖；[〇〇22]圖5為ACE抑制肽AVKVL的質(zhì)譜圖；[〇〇23]圖6為ACE抑制肽的穩(wěn)定性(A:溫度;B:pH; C:金屬離子;D:鹽濃度;E:腸道消化酶)。 【具體實(shí)施方式】
[0024]以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明作任何限定。
[0025](l)ACE抑制肽的制備
[0026]取3g榛子分離蛋白(堿溶酸沉法制備，參考《Funct1nal Properties of the Protein Isolate and Major Fract1ns of Pine Nut Proteins Prepared from the Changbai Mountain in China》，Dan Wu，Wei_hong Min)，加lOOmL蒸饋水?dāng)埶ぃ?CTC水浴 15min使蛋白變性，冷卻至室溫，用0.6mol/L NaOH調(diào)pH值至8.3，加入Alcalase2.4L(加酶量 5517.34U/g底物)，55 °C水解4.3h，保持pH值不變，反應(yīng)結(jié)束后迅速90 °C加熱15min滅酶，然后冷卻至室溫，用HC1調(diào)節(jié)pH值至中性后5000r/min離心10min，上清液冷凍干燥，即得粗榛仁ACE抑制肽，4°C保存；[〇〇27](2)ACE抑制肽的離子交換層析[〇〇28]將冷凍干燥后的粗榛仁ACE抑制肽，加入蒸餾水配成lmg/mL溶液，過(guò)0.22wii濾膜后，用AKTA蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行分離(離子交換層析)，采用HiTrap Q HP(1.6CmX2.5Cm)預(yù)裝柱，上樣量l〇mL，緩沖溶液A為20mmol/L Tris-HCl，緩沖溶液B為lmol/L NaCl，平衡流速 5mL/min，0 % -50 % B線性洗脫，洗脫流速0.5mL/min，紫外檢測(cè)儀在280nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，圖1為按此條件分離得到的離子交換層析分離圖譜，收集4種組分，冷凍干燥，測(cè)定ACE抑制率(四種組分抑制率分別是53.7%，28.3%，51.0%，24.9% )，將活性最高組分富集以備下一步分離。
[0029](3)ACE抑制肽的Sephadex G-15凝膠層析
[0030]將離子交換層析得到的活性最高組分進(jìn)行凝膠過(guò)濾分離，采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱(1.〇cm X 50cm)，洗脫液為純水，上樣濃度30mg/mL，上樣量3mL，洗脫流速0.5mL/ min，于280nm波長(zhǎng)下紫外檢測(cè)光吸收值。圖2為按此條件得到的凝膠過(guò)濾層析分離圖譜，將分離得到的2種組分收集，真空冷凍干燥，測(cè)定ACE抑制率(抑制率分別是76.3 %及65.7 % )， 將活性最高組分富集以備下一步分離。[〇〇31](4)ACE抑制肽的反相高效液相層析
[0032]將凝膠層析分離得到的活性最高組分溶解于去離子水中，調(diào)節(jié)其濃度為10mg/mL。 應(yīng)用Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。分離條件為:色譜柱Diamonsil C18(250X 4.6mm);流動(dòng)相A為含有0.1 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))TFA的乙腈，B為含有0.1 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))TFA的水;90 ?70%B線性洗脫30min;進(jìn)樣體積80此，流速0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm;圖3為按此條件得到的反相高效液相層析分離圖譜，將收集的6種組分冷凍干燥。配成同濃度溶液，測(cè)定各組分ACE抑制率(抑制率分別是56.3%，86.9%，41.3%，58.0% ,34.6% ,45.8%)，將活性最高組分富集以備結(jié)構(gòu)鑒定。[〇〇33](5)ACE抑制肽結(jié)構(gòu)鑒定[〇〇34]采用Agilent 1200型快速分離液相色譜系統(tǒng)和Agilent 6520 Q-T0F質(zhì)譜儀。液相條件:色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(2.1X 150mm，3.5iim);二元線性梯度洗脫:流動(dòng)相:(A)0.1 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲酸水溶液；(B)乙腈;流動(dòng)相梯度:0?30min，5%?30;柱溫35 。(:，流速0.4mL/min，進(jìn)樣量5此。[〇〇35]質(zhì)譜條件:采用電噴霧正離子掃描模式(ESI + );質(zhì)量掃描范圍m/z 100?2000;干燥氣流速(N2)為9L/min，干燥器溫度300°C，霧化電壓35psig，毛細(xì)管電壓為3.5kV，碎裂電壓175V，錐孔電壓65V，八級(jí)桿射頻電壓250V，二級(jí)質(zhì)譜碰撞電壓12-15eV。
[0036]肽段序列解析運(yùn)用Peaks 7.5軟件(B1informatics Solut1ns Inc)。兩種ACE抑制肽結(jié)構(gòu)分別是TLVGR和AVKVL，分子量分別為544.3333和528.3635,圖4和圖5分別是ACE抑制肽TLVGR和AVKVL的質(zhì)譜圖，其對(duì)應(yīng)的IC5Q值分別是0 ? 2493mg/mL，和0 ? 07306mg/mL。[〇〇37](6)ACE抑制肽的穩(wěn)定性
[0038]取經(jīng)過(guò)反相高效液相分離純化得到的抑制率最高組分0.lg，加入離子水配成濃度 lmg/mL溶液，以0 ? 5mol/L HC1和0 ? 5mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH7 ? 0，分別置于不同溫度下水浴2h，測(cè)定ACE抑制活性。結(jié)果見(jiàn)圖6A，在20-100 °C之間，ACE抑制率保持在80 %以上，說(shuō)明ACE抑制肽具有耐熱性。
[0039]取經(jīng)過(guò)反相高效液相分離純化得到的抑制率最高組分0.lg，加入離子水配成濃度 lmg/mL溶液，用HAc-NaAc緩沖溶液調(diào)節(jié)pH，室溫放置2h，測(cè)定ACE抑制活性。結(jié)果見(jiàn)圖6B，ACE 抑制肽在酸性和堿性條件下活性均很穩(wěn)定。
[0040]取經(jīng)過(guò)反相高效液相分離純化得到的抑制率最高組分0.lg，分別溶于不同濃度 NaCl溶液中，室溫放置2h，測(cè)定ACE抑制活性。結(jié)果見(jiàn)圖6C，100yg/ml Cu2+和Ca2+會(huì)使ACE抑制活性顯著下降。
[0041]取經(jīng)過(guò)反相高效液相分離純化得到的抑制率最高組分0.lg，配制濃度為lmg/mL肽溶液，向溶液中加入不同金屬離子Cu2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、K+，濃度分別達(dá)至lj 100yg/mL，靜置lh， 測(cè)定ACE抑制活性。結(jié)果見(jiàn)圖6D，NaCl濃度超過(guò)0.4mol/L會(huì)造成ACE率顯著下降，在ACE抑制肽貯藏及加工過(guò)程中要防止這些因素對(duì)抑制活性的影響。
[0042]取經(jīng)過(guò)反相高效液相分離純化得到的抑制率最高組分0.lg，加去離子水配成濃度 lmg/mL溶液，以lmol/L HC1調(diào)節(jié)pH到2 ? 0，按胃蛋白酶:ACE抑制肽為1:100(w/w)的比例加入胃蛋白酶，37°C下酶解4h后，100°C水浴10min滅酶;加入lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,取水解液50mL，5000r/min離心15min，測(cè)定上清液ACE抑制活性。在剩余5 OmL水解液中再按1:1比例加入胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，37 °C水解4h，100 °C水浴10min滅酶，5000r/min離心15min， 測(cè)定上清液ACE抑制活性。結(jié)果見(jiàn)圖6E，經(jīng)過(guò)胃腸道消化酶處理后ACE抑制率僅下降15.2%， 說(shuō)明其對(duì)消化酶的水解具有一定的抗性，可以作為一種口服降血壓肽。[〇〇43]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)先實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，在不脫離本發(fā)明原理的前提下， 2種ACE抑制肽的氨基酸序列其他排列組合方式及對(duì)多肽做出的若干改進(jìn)和修飾，也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種榛仁ACE抑制肽，其特征在于:為五肽TLVGR(Thr-Leu-Val-Gly-Arg)和AVKVL (Ala-Val-Lys-Val-Leu)〇2.權(quán)利要求1所述的榛仁ACE抑制肽的制備方法，其步驟如下:(1)ACE抑制肽的制備取2?5g榛仁分離蛋白，加lOOmL蒸餾水?dāng)嚢瑁?0?100°C水浴10?20min使蛋白變性，冷 卻至室溫后調(diào)pH值7?10,然后加入Alcalase 2.4L堿性蛋白酶，加酶量為4000?8000U/g分 離蛋白，在40?70°C下水解2?5h，保持pH值不變，反應(yīng)結(jié)束后迅速于90°C下加熱10?20min 滅酶，然后冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值至中性后5000?8000r/min離心10?20min，上清液冷凍干 燥，即得粗榛仁ACE抑制肽，4°C保存；(2)ACE抑制肽的分離純化將粗榛仁ACE抑制肽加入蒸餾水配成溶液，過(guò)0.22wii濾膜后，進(jìn)行離子交換層析，然后 將離子交換層析得到的抑制率最高組分進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析，再將抑制率最高組分富集進(jìn)行 反相高效液相層析，所得ACE抑制率最高的多肽組分即榛仁ACE抑制肽。3.如權(quán)利要求2所述的榛仁ACE抑制肽的制備方法，其特征在于:步驟(1)是用0.6mol/L NaOH 調(diào) pH值 7 ?10。4.如權(quán)利要求2所述的榛仁ACE抑制肽的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的離子 交換層析采用陰離子交換柱，緩沖溶液A為15?25mmol/L Tris-HCl，緩沖溶液B為0.5? 2mol/L NaCl，上樣濃度1?10mg/mL，上樣體積5?20mL，平衡流速1?5mL/min，0%?100%B 線性洗脫，洗脫流速〇.1?5mL/min。5.如權(quán)利要求2所述的榛仁ACE抑制肽的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的凝膠 過(guò)濾層析采用Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱，洗脫液為純水，上樣濃度10?50mg/mL，上樣量 1?10mL，洗脫流速0? 1?5mL/min。6.如權(quán)利要求2所述的榛仁ACE抑制肽的制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述的反相 高效液相層析采用C18色譜柱，流動(dòng)相A為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 % TFA的乙腈，流動(dòng)相B為含有質(zhì) 量分?jǐn)?shù)0.1%TFA的水，上樣濃度10?50mg/mL，進(jìn)樣體積10?80yL，100?60%B線性洗脫30 ?60min;流速0? 1 ?lmL/min〇
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK106008669SQ201610517689
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月4日
【發(fā)明人】閔偉紅, 劉春雷, 李鴻梅, 方麗, 王輯
【申請(qǐng)人】吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)