一種牛蛙緩激肽及其編碼的核酸和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種牛娃（Rana catesbeiana緩激肽及其編碼的核酸和應(yīng)用，屬于生 物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 緩激肽是激肽釋放酶--激肽系統(tǒng)中的一種主要的激肽類物質(zhì)，既可引起病理生 理反應(yīng)，又可發(fā)揮生理保護作用，參與多系統(tǒng)器官的功能調(diào)節(jié)和病理生理過程，如心血管、 腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖、平滑肌收縮、炎癥、疼痛、休克和組織 損傷過程等。近年來很多試驗通過動物模型和人體，以及分子生物學(xué)，對緩激肽研宄日益 深入，尤其在心血管系統(tǒng)中。已證實血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（Angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)和血管緊張素 AT，受體詰抗劑（ARB)在高血壓病、心肌梗死、 心力衰竭中對心臟具有強大的保護作用，其機制一方面通過作用于腎素一血管緊張素系 統(tǒng)（RAS)，另一方面即近來研宄的熱點，還通過作用于激肽-緩激肽系統(tǒng)而發(fā)揮作用，其中 ACEI主要通過減少緩激肽的降解，而ARB則主要通過影響心肌細(xì)胞緩激肽受體數(shù)目的上調(diào) 發(fā)揮作用。
[0003] 目前已經(jīng)從蛙屬（Rana)和鈴蟾屬（Bombina)兩棲類動物皮膚中得到了 10多種緩 激肽（bradykinin)，緩激肽參與許多生理和病理反應(yīng)，比如血管舒張、血管滲透性、血壓控 制、疼痛產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)等，除此之外緩激肽還有對血管或非血管平滑肌的強效收縮或舒 張效應(yīng)。近年來很多試驗通過動物模型和人體，以及分子生物學(xué)方法，對緩激肽生物活性研 宄日益深入，尤其在心血管系統(tǒng)中的生理作用。
[0004] 我國對兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質(zhì)的研宄主要 集中于生物堿等有機小分子，對皮膚活性蛋白肽類物質(zhì)的研宄還較少。牛蛙，原產(chǎn)于北美 洲，1959年從古巴、日本引進(jìn)我國內(nèi)陸。目前我國主要靠養(yǎng)殖生產(chǎn)，全國各地均產(chǎn)，主要集中 于湖北、湖南、江西、新疆、四川等地。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種牛蛙緩激肽及其編碼的核酸和 應(yīng)用，用于開發(fā)心腦血管系統(tǒng)藥物的牛蛙緩激肽基因及其技術(shù)。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種牛蛙緩激肽，所述牛蛙緩 激肽由9個氨基酸組成，分子量為1043. 2道爾頓，等電點為9. 50,其氨基酸序列為SEQ ID NO. 4 ：Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg〇
[0007] 所述牛蛙緩激肽的編碼基因，其序列為SEQ ID NO. I所示序列的第156-183位核 苷酸。
[0008] -種牛蛙緩激肽，所述牛蛙緩激肽由16個氨基酸組成，分子量為1759. 0道爾頓， 等電點為 10. 35,其氨基酸序列為 SEQ ID NO. 6 :Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg He Ala Pro Ala Ser Tyr Leu〇
[0009] 所述牛蛙緩激肽的編碼基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示序列的第156-204位核 苷酸，
[0010] 所述的牛蛙緩激肽，在制備心血管系統(tǒng)藥物和促進(jìn)腸道收縮藥物中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的有益效果：由牛蛙緩激肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的牛蛙緩 激肽RR9和RL16具有很強的促進(jìn)大鼠離體回腸肌收縮的活性，該牛蛙緩激肽具有結(jié)構(gòu)簡 單、人工合成方便的特點。，因此可以作為心腦血管藥物以及促進(jìn)腸道收縮藥物的應(yīng)用。 Kininogen-ICa的發(fā)現(xiàn)不僅為緩激肽家族增加了新成員，也為緩激肽結(jié)構(gòu)與組成的研宄提 供了有益的參考。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明牛娃緩激肽kininogen-ICa RR9和RL16對離體回腸肌收縮能力的 檢測（A. RR9 B. RL16 C. 0. 1%。乙酰膽堿對照組D.生理鹽水對照組）。
【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：
[0014] 本發(fā)明的牛蛙緩激肽，所述牛蛙緩激肽由9個氨基酸組成，分子量為1043. 2道爾 頓，等電點為9. 50,其氨基酸序列為SEQ ID NO. 4 :Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg0
[0015] 所述牛蛙緩激肽的編碼基因，其序列為SEQ ID NO. I所示序列的第156-183位核 苷酸。
[0016] -種牛蛙緩激肽，所述牛蛙緩激肽由16個氨基酸組成，分子量為1759. 0道爾頓， 等電點為 10. 35,其氨基酸序列為 SEQ ID NO. 6 :Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg lie Ala Pro Ala Ser Tyr Leu0
[0017] 所述牛蛙緩激肽的編碼基因，其序列為SEQ ID NO. I所示序列的第156-204位核 苷酸，
[0018] 所述的牛蛙緩激肽，在制備心血管系統(tǒng)藥物和促進(jìn)腸道收縮藥物中的應(yīng)用。
[0019] 牛蛙緩激肽，是從牛蛙皮膚cDNA文庫中篩選得到的一種由牛蛙緩激肽基因編碼 的生物活性肽。它是由16個氨基酸（RL16)和9個氨基酸（RR9)組成的多肽片段，分子量分 別為1759. 0道爾頓和1043. 2道爾頓，等電點為9. 50和10. 35。多肽氨基酸全序列一級結(jié) 構(gòu)為：精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨 酸-異亮氨酸-丙氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸-酪氨酸-亮氨酸（RPPGCNPFRIAPASYL); 精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-異 亮氨酸（RPPGCNPFR)。
[0020] 本發(fā)明牛蛙緩激肽的制備過程，包括以下步驟：
[0021] 1)牛蛙緩激肽基因的克隆
[0022] 牛蛙皮膚總RNA的提取，mRNA的純化，cDNA第一鏈的合成及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè) 計引物利用PCR方法篩選牛蛙絲氨酸蛋白酶抑制劑基因。擴增引物長度為20個核苷酸， 上游引物為 5 ' -ATGTTCACCWTGAAGAAATC-3 '，下游引物為 CL0NTECH 公司 SMART? cDNA Library Construction Kit 中的 3 ' PCR Primer 引物，其序列為 5 ' -ATTCTAGAGGC CGAGGCGGCC-3 '。所獲陽性克隆進(jìn)行核苷酸序列測定?；驕y序結(jié)果表明編碼牛蛙絲氨酸 蛋白酶抑制劑的基因由458個核苷酸組成（SEQ ID NO. I)，從5 '端至3 '序列為：
[0023]
[0024] 編碼牛蛙緩激肽的為第156-183,156-204位核苷酸片段，其氨基酸序列為Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg和Arg Pro Pro Gly Cys Asn Pro Phe Arg I Ie Ala Pro Ala Ser Tyr Leu。（見 SEQ ID NO. 3-6)
[0025] 2)牛蛙緩激肽的合成
[0026] 根據(jù)編碼牛蛙緩激肽的基因推斷牛蛙緩激肽的氨基酸序列，用自動多肽合成儀 APEX396合成其全序列（見SEQ ID NO. 2)。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。然后用 高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法，等電聚焦電泳測 定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0027] 實施例1 :牛蛙緩激肽基因克隆
[0028] I .牛蛙皮膚總RNA提取
[0029] A.活體牛蛙用雙蒸水清洗干凈，滅菌針從牛蛙的延髓腔毀髓，取50~IOOmg牛蛙 皮膚組織放入干烤過的研缽中，加入ImL TRIZOL Reagent(Invitrogen公司產(chǎn)品）迅速在 冰水浴中研磨。
[0030] B.充分混勻后，移入I. 5mL離心管中（DEPC管）15~30°C放置5min，加入等體積 氯仿旋渦混勻158,4°〇12000\8離心151^11。
[0031] (1取上清加入50(^1^異丙醇，15~30°〇放置51^11，旋渦158混勻，4°〇12000\ 8 離心10min。棄上清，加入ImL 75 %乙醇漂洗沉淀，7500 Xg離心5min，重復(fù)1次。超凈工 作臺中干燥90s，用30 μ L RNase-free water溶解，即得到牛娃皮膚組織總RNA0
[0032] II .牛蛙皮膚mRNA的分離純化，采用操作步驟按照德國QIAGEN公司的 Oligotex ? mRNA Mini Kit試劑盒說明書進(jìn)行。
[0033] III.牛蛙皮膚cDNA文庫的構(gòu)建
[0034] 采用 CLONTECH 公司的 Creator? SMART? cDNA Library Construction Kit 文庫 構(gòu)建試劑盒。
[0035] A. cDNA第一鏈合成（mRNA反轉(zhuǎn)錄）
[0036] 以純化的mRNA為模板，利用cDNA構(gòu)建試劑盒提供的CDS III/3 ^ Primer :5， -ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-lN-3 ; (N = A, C, G or T ；N-1 = A,G or C)和 SMARTTM IV oligonucleotide ：5 ; -AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GT GG CC ATTACG GCCGGG-3^，在PowerScript?逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)體系為IOyL: IyL SMART IV Oligonucleotide，IyL CDS III 引物混勻，72°C2min，冰浴 2min。離心 后分別加入以下試劑：2. OyL 5X First-Stand Buffer、1.0 yL DTT(20mM)、LOyL dNTP Mix (IOmM)、1.0 yL PowerScript 逆轉(zhuǎn)錄酶，反應(yīng)總體積為 10.0 yL。42°C 反應(yīng) 60min，冰浴 放置5min，終止第一鏈合成。-20°C保存。
[0037] B. LD-PCR方法擴增第二鏈
[0038] L 95 °C 預(yù)熱 PCR 儀。
[0039] 2.以第一鏈cDNA為模板，向反應(yīng)管中依次加入以下試劑：2 μ L cDNA第一鏈合成 產(chǎn)物、80yL 去離子水、IOyL 10*Advantage 2PCR 緩沖液、2yL 50*dNTP 混合物、2yL 5' PCR 引物、2yL CDS 111/3 ' PCR 引物以及 2yL 50*Advantage 2Polymerase Mix，反應(yīng)體 系為100 μ L。
[0040] 3.在PCR儀中按以下程序擴增：
[0041] ① 95 XM 分鐘；
[0042] ②24個循環(huán)：95 °C 15秒鐘，68 °C復(fù)性