一種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身抗體結(jié)合抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種新的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷、治療用蛋 白。
【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性、全身性、自身免疫性疾 病，其特征是外周關(guān)節(jié)的非特異性、對稱性慢性炎癥，關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生，形成血管 翳，侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊破壞，最終導(dǎo)致關(guān) 節(jié)畸形和功能喪失，部分患者伴不同程度的全身表現(xiàn)。RA在中國是一個常見的多發(fā)性自身 免疫疾病，患病率約為0.3% -0.4%，美國本病患者約占人群的1 %，女性發(fā)病率較男性高 2-3倍。各年齡組人群均可發(fā)病，但25-50歲為本病的好發(fā)年齡。目前尚無有效地根治RA、 防治患者受累關(guān)節(jié)畸形和功能喪失的治療方法，早期診斷、早期治療是唯一有效延緩病變 發(fā)展、減少不可逆關(guān)節(jié)病變的措施。
[0003] 1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會（ACR)制定的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)為病變持續(xù)6周，并有以下七個 方面的表現(xiàn)可確診為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA):①關(guān)節(jié)運動受阻一小時以上或②關(guān)節(jié)炎發(fā)生三 個以上關(guān)節(jié)或③關(guān)節(jié)炎發(fā)生在手關(guān)節(jié)上或④對稱性關(guān)節(jié)炎或⑤風(fēng)濕性小結(jié)在關(guān)節(jié)上出現(xiàn) 或⑥血清RF陽性或⑦X光顯示關(guān)節(jié)出現(xiàn)變形。2009年ACR修訂了 RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，以下指標(biāo) 獲得6分及以上肯定RA診斷：①受累關(guān)節(jié)情況，最高得5分或②血清學(xué)抗體檢測，包括類風(fēng) 濕因子（RF)或抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP)抗體至少一項低滴度陽性的2分，高滴度陽性得3分， 兩者均陰性不得分或③滑膜炎持續(xù)超過6周得1分或④CRP或ESR增高得1分。從兩個標(biāo) 準(zhǔn)可看出，風(fēng)濕病學(xué)專家們已經(jīng)充分認識到血清學(xué)抗體檢測在RA診斷中的重要價值。由于 RF對于RA的特異性差，CCP抗體已經(jīng)成為輔助臨床早期診斷和鑒別診斷RA的最特異性實 驗室指標(biāo)。
[0004] 然而，目前臨床上常用的CCP抗體檢測試劑輔助診斷RA的特異性高達95%，但敏 感性不夠，在50-75%之間（Fan LY，et al.ClinicaChimicaActa2010,411: 2049-2053)。因 此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種特異性高、靈敏度強的RA相關(guān)自身抗原，以滿足臨床輔助診 斷的檢測需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種能夠特異性識別樣本中RA抗體的多肽。
[0006] 本發(fā)明第一方面，提供了一種式I表不的多肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽：
[0007] [XaaO]-CEGRS(Cit)RSTSPEER(Cit)GPG-[Xaal]
[0008] 式⑴；
[0009] 其中，XaaO和Xaal分別為無，或1-5個氨基酸構(gòu)成的肽段。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述式I所式的多肽或其衍生多肽具有RA自身抗體的結(jié)合活 性。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的XaaO和Xaal分別為1-4個，較佳地為2-3個氨基酸構(gòu)成 的肽段。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的多肽包括線性肽或非線性肽。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的多肽由Cit和Arg之間、Cit和Cit之間的氫鍵構(gòu)成環(huán)肽。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的多肽由Cit和Arg之間的氫鍵構(gòu)成環(huán)肽。
[0015] 本發(fā)明第二方面，提供了一種偶聯(lián)蛋白，所述的偶聯(lián)蛋白具有以下結(jié)構(gòu)：
[0016] Y-X
[0017] 其中，
[0018] Y為載體蛋白；
[0019] X為式I所示的多肽；
[0020] 表示連接X和Y的肽鍵或肽接頭。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白包括牛血清白蛋白（BSA)，或血藍蛋白（KLH)。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明還提供了一種分離的核苷酸，其編碼權(quán)利要求1所述的 多肽。
[0023] 本發(fā)明第三方面，提供了一種類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷抗原組合，所述的抗原組合包括 本發(fā)明第一方面所述的多肽或本發(fā)明第二方面所述的偶聯(lián)蛋白，和選自以下一種或兩種的 多肽：
[0024] CGRPGTAS(Cit)PSTSTRYVT 式 II，
[0025] CEESA(Cit)HLL(Cit)EYQDINVK 式 III。
[0026] 本發(fā)明第四方面，提供了本發(fā)明第一方面所述多肽、本發(fā)明第二方面所述偶聯(lián)蛋 白，或本發(fā)明第三方面所述的抗原組合的用途，用于制備檢測樣本中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身抗 體、和/或制備診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑或試劑盒。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣本包括血液樣本、關(guān)節(jié)液樣本。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的血液樣本包括血清、血漿和/或全血。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測為早期檢測。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的早期指的是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病在1年半之內(nèi)。
[0031] 本發(fā)明第五方面，提供了一種檢測板，所述的檢測板包括基片（支撐板）、測試條， 所述的測試條固定有本發(fā)明第一方面所述的多肽或其衍生多肽、本發(fā)明第二方面所述的偶 聯(lián)蛋白，或本發(fā)明第三方面所述的抗原組合。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的測試條由濾樣紙、層析材料、硝酸纖維素膜和吸水紙依次 搭接組成。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述層析材料預(yù)包被有經(jīng)膠體金標(biāo)記或有色標(biāo)記的權(quán)利要求1 所述的多肽或其衍生多肽、權(quán)利要求3所述的偶聯(lián)蛋白，或權(quán)利要求5所述的抗原組合。 [0034] 本發(fā)明第六方面，提供了一種試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，和位于容器內(nèi)的 (i)本發(fā)明第五方面所述的檢測板；或（ii)本發(fā)明第一方面所述的多肽或其衍生多肽、本 發(fā)明第二方面所述的偶聯(lián)蛋白，或本發(fā)明第三方面所述的抗原組合；和（iii)使用說明書。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的說明書記載了檢測樣本中是否存在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身抗 體的方法，包括步驟：
[0036] (a)將樣本與本發(fā)明第一方面所述多肽、或本發(fā)明第二方面所述偶聯(lián)蛋白，或本發(fā) 明第三方面所述的抗原組合接觸；
[0037] (b)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中，形成復(fù)合物就說明樣本中存在類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎自身抗體。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有抗本發(fā)明第一方面所述的多肽或其衍生多 肽、本發(fā)明第二方面所述的偶聯(lián)蛋白，或本發(fā)明第三方面所述的抗原組合的抗體，用于陽性 對照。
[0039] 本發(fā)明第七方面，提供了一種體外非診斷性的檢測樣本中是否存在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 自身抗體的方法，包括步驟：
[0040] (a)將樣本與本發(fā)明第一方面所述多肽、或本發(fā)明第二方面所述偶聯(lián)蛋白，或本發(fā) 明第三方面所述的抗原組合接觸；
[0041] (b)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中，形成復(fù)合物就說明樣本中存在類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎自身抗體。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的診斷為早期診斷，和/或所述對象為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疑似 患者。
[0043] 本發(fā)明第八方面，提供了一種診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，包括步驟：
[0044] (a)將檢測對象的樣本與本發(fā)明第一方面所述多肽或其衍生多肽、或本發(fā)明第二 方面所述偶聯(lián)蛋白，或本發(fā)明第三方面所述的抗原組合接觸；
[0045] (b)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中，形成復(fù)合物就說明所述對象患有類風(fēng) 濕關(guān)節(jié)炎。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣本包括血、關(guān)節(jié)液。
[0047] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0048] 圖1顯示了精氨酸在肽精氨酸脫亞胺基酶、水分子和鈣離子的作用下進行脫氨并 釋放出氫離子而形成瓜氨酸的反應(yīng)過程。
[0049] 圖2顯示了在三羧酸循環(huán)和尿素代謝中，主要以鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和氨基甲 酰合成酶的作用下，氨基甲酰磷酸與瓜氨酸（Cit)之間可作轉(zhuǎn)化代謝，從而在多肽蛋白合 成代謝中產(chǎn)生精氨酸（R)的非正常衍生物瓜氨酸（Cit)多肽的反應(yīng)過程。
[0050] 圖3顯示了當(dāng)精氨酸的衍生物瓜氨酸在蛋白多肽代謝中形成后，其多肽中的精氨 酸和瓜氨酸在結(jié)構(gòu)上，精氨酸與瓜氨酸或瓜氨酸與瓜氨酸可能會形成環(huán)化結(jié)構(gòu)的二種模 式。
[0051] 圖4顯示了 CCP5F、CCP5G、CCP5H多肽-BSA偶聯(lián)蛋白質(zhì)的氨基酸順序，其中BSA為 牛血清蛋白，瓜氨酸（Cit)是從精氨酸（R)代謝中的衍生物。瓜氨酸（Cit)和瓜氨酸（Cit) 之間和或瓜氨酸（Cit)和精氨酸（R)之間的邊線為其多肽結(jié)構(gòu)中可能存在的環(huán)化。例如， 在CCP5G的二個環(huán)化連線中，鏈線（1)和鏈線（2)是兩種環(huán)化可選擇的可能性（也是造成 抗原多樣性一方面）或除了瓜氨酸（Cit)三字母代碼外，其它英文字母為氨基酸單字母代 碼。
[0052] 圖5顯示了制備的抗CCP5F、CCP5G和CCP5H抗血清經(jīng)三倍系列稀釋后分別與對應(yīng) 多肽-BSA抗原蛋白反應(yīng)，并經(jīng)二抗-HRP信號放大反應(yīng)后，在96孔ELISA板上顯示出不同 中的吸光度（OD)和梯度曲線，以代表羊抗CCP5F-H抗體與CCP5F-H抗原的效價。
【具體實施方式】
[0053] 本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過對多種商品化類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身抗原 (CCP)進行了研究，對這些抗原結(jié)構(gòu)進行了變構(gòu)、變性改造，并對合成的多肽進行了大量篩 選，從而獲得了數(shù)十種具有新構(gòu)型的環(huán)化瓜氨酸多肽并制備了含有這些多肽的偶聯(lián)蛋白， 然后，通過對含有這些多肽的偶聯(lián)蛋白與RA血清內(nèi)自身抗體的結(jié)合反應(yīng)性研究，進一步篩 選到數(shù)條具有與RA血清自身抗體結(jié)合活性的多肽，其中，以本發(fā)明多肽（CCP5G)的反應(yīng)性 最佳，而將這些多肽進行組合后，也能夠有良好的反應(yīng)性效果。此外，本發(fā)明人采用本發(fā)明 多肽對大量臨床病例進行了驗證，實驗證明，在RA患者，尤其是早期RA患者中，本發(fā)明多肽 的陽性檢出率顯著高于現(xiàn)有的CCP檢測，因此本發(fā)明多肽可用于對RA患者尤其是早期患者 的診斷和檢測，其特異性