高、靈敏度強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0054] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎
[0055] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性、全身性、自身免疫性疾 病，其特征是外周關(guān)節(jié)的非特異性、對稱性慢性炎癥，關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生，形成血管 翳，侵犯關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，造成關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊破壞，最終導(dǎo)致關(guān) 節(jié)畸形和功能喪失，部分患者伴不同程度的全身表現(xiàn)。RA在中國是一個(gè)常見的多發(fā)性自身 免疫疾病。
[0056] 目前，RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，且也未出現(xiàn)有效地根治RA、防治患者受累關(guān) 節(jié)畸形和功能喪失的治療方法。
[0057] RA相關(guān)抗體
[0058] 在RA患者血清中可檢測多種抗體，包括類風(fēng)濕因子、RA33抗體、抗II性膠原抗 體、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（CCP抗體）等等。其中CCP抗體是目前公認(rèn)的輔助診斷RA的特異 性最高的指標(biāo)。但是目前市售的不同品牌CCP抗體試劑檢測均存在著檢測結(jié)果對RA診斷 敏感度不高的缺憾，特別是對早期RA診斷敏感度低于50 %，導(dǎo)致部分早期RA得不到及時(shí)診 斷和治療。
[0059] 瓜氨酸
[0060] 瓜氨酸不是人體內(nèi)的天然氨基酸、也不是代謝必須氨基酸，而由是精氨酸在體內(nèi) 去氨基后的衍生物。如圖1所示，肽鏈中的精氨酸在肽精氨酸脫亞胺酶（PAD = P印tidgl arginine deiminase)、水分子和鈣離子的作用下進(jìn)行脫氨并釋放出氫離子而形成瓜氨酸 (Citrulline or Cit) 〇
[0061] 精氨酸（Arginine, Arg or R)與賴氨酸（Lysine, Lys or K)和組氨酸 (Histidine, His or H) -樣是一種堿性氨基酸，是人體20種天然氨基酸之一，也是人體正 常蛋白質(zhì)合成、分解代謝中（如三羧酸循環(huán)）不可缺少的原料之一。
[0062] 瓜氨酸也是在三羥酸循環(huán)和尿素代謝中的中間體。如圖2所示，在三羧酸循環(huán)和 尿素代謝中，主要以鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和氨基甲酰合成酶的作用下，氨基甲酰磷酸與 瓜氨酸（Cit)之間可作轉(zhuǎn)化代謝，從而在多肽蛋白合成代謝中產(chǎn)生精氨酸（R)的非正常衍 生物瓜氨酸（Cit)多肽。
[0063] 如果在人體蛋白質(zhì)多肽鏈中，過多地出現(xiàn)瓜氨酸，一方面該受累蛋白的許多生物 學(xué)特性、甚至功能將發(fā)生改變，另一方面此多肽蛋白就可能被人體的免疫機(jī)制看作是一個(gè) 外來抗原而產(chǎn)生自身抗體。自身抗體與抗原的結(jié)合物會沉積在人體一些關(guān)節(jié)中，激活補(bǔ)體 而造成局部組織損傷，是潛在的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)病的發(fā)病基礎(chǔ)。
[0064] 活性多肽
[0065] 在本發(fā)明中，術(shù)語"本發(fā)明多肽"、"CCP5G多肽"、"本發(fā)明變性變構(gòu)型瓜氨酸多肽"、 "本發(fā)明環(huán)瓜氨酸多肽"可互換使用，都指具有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身抗體結(jié)合活性的肽CCP5G 氨基酸序列的蛋白或多肽。此外，所述術(shù)語還包括具有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身抗體結(jié)合活性的、 SEQ ID NO :1序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：在C末端和/或N末端 添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)（通常為5個(gè)以內(nèi)，較佳地為3個(gè)以內(nèi)，更佳地為1-2個(gè)以內(nèi)）氨基 酸。例如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)和功能。此外，所述術(shù)語還包括單體和多聚體形式本發(fā)明多肽。
[0066] 本發(fā)明多肽還包括線性以及非線性的多肽（如環(huán)肽）。優(yōu)選地，本發(fā)明多肽為環(huán)肽 形式，例如，本發(fā)明多肽的Cit和Arg之間、Cit和Cit之間可形成氫鍵，從而構(gòu)成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 的環(huán)肽。更優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽結(jié)構(gòu)如下所示：
[0067] CEGRS(Cit)RSTSPEER(Cit)GPG 式（I)
[0068] 本發(fā)明還包括CCP5G多肽的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"片 段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎自身抗體結(jié)合活性的多肽。本發(fā) 明的多肽片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個(gè)或幾個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基（優(yōu) 選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，或（ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的 多肽，或（iii)CCP5G多肽與另一個(gè)化合物（比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇、 載體蛋白（優(yōu)選為BSA和KLH))融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合于此多 肽序列而形成的多肽（與前導(dǎo)序列、分泌序列或6His等標(biāo)簽序列融合而形成的然后蛋白）。 根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
[0069] 發(fā)明還提供CCP5G多肽的類似物。這些類似物與天然CCP5G多肽的差別可以是氨 基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類似物還包 括具有不同于天然L-氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類似物，以及具有非天然存在的或 合成的氨基酸（如β、Y-氨基酸）的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的 代表性的多肽。
[0070] 修飾（通常不改變一級結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 ?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn) 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶（如哺乳動 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu) 化了溶解性能的多肽。
[0071] 本發(fā)明多肽還可以以由藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。這 些鹽包括（但不限于）與如下酸形成的鹽：氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳 酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羥乙 磺酸。其他鹽包括：與堿金屬或堿土金屬（如鈉、鉀、鈣或鎂）形成的鹽，以及以酯、氨基甲 酸酯或其他常規(guī)的"前體藥物"的形式。
[0072] 此外，本發(fā)明還提供了一種抗原組合，即將本發(fā)明多肽與其他相同用途的多肽進(jìn) 行組合。通常，這些組合中的多肽數(shù)量可以為一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選地，所述其他相同用途的多 肽也能夠與血清中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體結(jié)合，例如如式II或式III所示的多肽：
[0073] CGRPGTAS(Cit)PSTSTRYVT 式 II (SEQ ID NO. :2)，
[0074] CEESA(Cit)HLL(Cit)EYQDINVK 式 III(SEQ ID NO. :3)。
[0075] 將式I-III的抗原聯(lián)合應(yīng)用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎抗體，能夠提高單一抗原的抗原-抗 體識別反應(yīng)率，從而進(jìn)一步提1?抗體的檢出率。
[0076] 多肽的制備方法
[0077] 本發(fā)明多肽可以是重組多肽或合成多肽。本發(fā)明的多肽可以是化學(xué)合成的，或重 組的。相應(yīng)地，本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產(chǎn)。
[0078] -種優(yōu)選的方法是使用液相合成技術(shù)或固相合成技術(shù)，如Boc固相法、Fmoc固相 法或是兩種方法聯(lián)合使用。固相合成可快速獲得樣品，可根據(jù)目的肽的序列特征選用適當(dāng) 的樹脂載體及合成系統(tǒng)。例如，F(xiàn)moc系統(tǒng)中優(yōu)選的固相載體如連接有肽中C端氨基酸的 Wang樹脂，Wang樹脂結(jié)構(gòu)為聚苯乙烯，與氨基酸間的手臂是4-烷氧基芐醇；用25%六氫吡 啶/二甲基甲酰胺室溫處理20分鐘，以除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，并按照給定的氨基酸序列由C 端逐個(gè)向N端延伸。合成完成后，用含4%對甲基苯酚的三氟乙酸將合成的胰島素原相關(guān) 肽從樹脂上切割下來并除去保護(hù)基，可過濾除樹脂后乙醚沉淀分離得到粗肽。將所得產(chǎn)物 的溶液凍干后，用凝膠過濾和反相高壓液相層析法純化所需的肽。當(dāng)使用Boc系統(tǒng)進(jìn)行固 相合成時(shí)，優(yōu)選樹脂為連接有肽中C端氨基酸的PAM樹脂，PAM樹脂結(jié)構(gòu)為聚苯乙烯，與氨 基酸間的手臂是4-羥甲基苯乙酰胺；在Boc合成系統(tǒng)中，在去保護(hù)、中和、偶聯(lián)的循環(huán)中，用 TFA/二氯甲烷（DCM)除去保護(hù)基團(tuán)Boc并用二異丙基乙胺（DIEA/二氯甲烷中和。肽鏈縮 合完成后，用含對甲苯酚（5-10% )的氟化氫（HF)，在0°C下處理1小時(shí)，將肽鏈從樹脂上 切下，同時(shí)除去保護(hù)基團(tuán)。以50-80%乙酸（含少量巰基乙醇）抽提肽，溶液凍干后進(jìn)一步 用分子篩Sephadex GlO或Tsk_40f分離純化，然后再經(jīng)高壓液相純化得到所需的肽。可以 使用肽化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)已知的各種偶聯(lián)劑和偶聯(lián)方法偶聯(lián)各氨基酸殘基，例如可使用二環(huán)己 基碳二亞胺（DCC)，羥基苯駢三氮唑（HOBt)或1，1，3, 3-四脲六氟磷酸酯（HBTU)進(jìn)行直接 偶聯(lián)。對于合成得到的短肽，其純度與結(jié)構(gòu)可用反相高效液相和質(zhì)譜分析進(jìn)行確證。
[0079] 在一優(yōu)選例中，本發(fā)明多肽CCP5F、CCP5G和CCP5H，按其序列，采用固相合成的方 法制備，行高效液相色譜純化，獲得高純度目的肽凍干粉，-20°C貯存。
[0080] 此外，本發(fā)明多肽和蛋白質(zhì)載體的連接可使用本領(lǐng)域已知的任何連接方式以構(gòu)成 偶聯(lián)蛋白。例如但不限于：碳二亞胺法（EDC)、戊二醛法等。
[0081] 可用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)載體包括（但不限于）：牛血清白蛋白（BSA)、血藍(lán)蛋白 (KLH)。優(yōu)選地，為BSA。
[0082] RA相關(guān)抗體檢測板
[0083] 可采用本領(lǐng)域常規(guī)檢測技術(shù)，利用本發(fā)明多肽或其偶聯(lián)蛋白對樣本內(nèi)的RA相關(guān) 抗體進(jìn)行檢測。較佳地，所述的檢測采用常規(guī)間接ELISA酶標(biāo)法、金標(biāo)法、比濁法、生物芯片 法、膜點(diǎn)雜交法等等血清學(xué)或體液學(xué)的診斷方法。優(yōu)選地，可采用間接ELISA酶標(biāo)法或金標(biāo) 法。例如，可將RA相關(guān)抗體-載體蛋白固定于硝酸纖維膜上的檢測區(qū)（固相抗體），待檢樣 品溶液中的RA相關(guān)抗體（游離抗體）與固相抗體競爭結(jié)合膠體金標(biāo)記的本發(fā)明多肽或其 偶聯(lián)蛋白（標(biāo)記抗原）。待檢樣品中含有的RA相關(guān)抗體，將抑制標(biāo)記抗體與固定抗原的結(jié) 合，抑制在硝酸纖維素膜的檢測區(qū)形成色帶。測定后檢測區(qū)如果形成色帶，則結(jié)果為陰性， 待測樣品不含RA相關(guān)抗體；反之，不形成色帶，則結(jié)果為陽性，檢測樣品含有RA相關(guān)抗體。
[0084] 本發(fā)明的檢測板可采用本領(lǐng)域常用的檢測板材料，采用常規(guī)的檢測板制備方法制 成。本發(fā)明檢測的檢測板包括測試條和支撐測試條的支撐板，如可采用聚乙烯E