LISA反應(yīng) 板等；所述的測試條由濾樣紙、層析材料、硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接組成，搭接部位 可以采用常規(guī)的方法，如膠帶等固定連接；其中：層析材料預(yù)包被膠體金標(biāo)記或有色標(biāo)記 的本發(fā)明多肽或其偶聯(lián)蛋白。
[0085] 檢測方法與結(jié)果判定：
[0086] 平放檢測板，將樣本（如血清）滴加在濾樣紙上，L 5_5min內(nèi)觀察層析結(jié)果。根據(jù) 出現(xiàn)的條紋位置來判斷結(jié)果。
[0087] 陰性：質(zhì)控區(qū)、檢測區(qū)均出現(xiàn)明顯的色帶，示為陰性；陽性：只在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)明顯 色帶，而在檢測區(qū)無色帶，示為陽性；無效：質(zhì)控區(qū)、檢測區(qū)無任何色帶或在質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn) 色帶而在檢測區(qū)出現(xiàn)色帶，表明檢測方法錯誤或檢測板變質(zhì)或失效，應(yīng)重新?lián)Q取檢測板檢 測。
[0088] 試劑盒
[0089] 本發(fā)明還提供了一種檢測RA相關(guān)抗體的試劑盒。一般地，本發(fā)明的試劑盒可以含 有上述的檢測板，或所述的試劑盒可以包括以下組分：容器或載體；以及位于所述容器內(nèi) 或載體上的本發(fā)明多肽或其偶聯(lián)蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括酶結(jié)合液、反應(yīng) 底物和任選的說明書。較佳地，所述的試劑盒還可包括選自下組的組分：反應(yīng)終止液、樣本 稀釋液、和洗滌液。一種優(yōu)選的可用于檢測RA相關(guān)抗體的試劑盒包括：容器以及位于容器 內(nèi)的包被液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人IgG (H+L)抗體、底物液TMB、稀濃硫酸反應(yīng)終止 液和樣本稀釋液。更佳地，還含有空白對照、陽性和陰性對照和作以監(jiān)控檢測過程是否符合 標(biāo)準(zhǔn)。
[0090] 本發(fā)明的有益效果：
[0091] 利用本發(fā)明CCP5G多肽作為檢測RA相關(guān)抗體的抗原，敏感性高，特異性也較高， 能夠有效地診斷RA，尤其是早期RA的患者，比目前已臨床上開展的CCP、CRP、IgG-RF和 IgM-RF，特別是比CCP檢出方法要優(yōu)越得許多。此外，制備獲得的本發(fā)明多肽的多克隆抗 體，可用于RA的特異性治療。
[0092] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量 份數(shù)。
[0093] 實施例1 CCP5F-H多肽及其BSA偶聯(lián)蛋白的制備、鑒定與保存
[0094] 按常規(guī)多肽合成方法制備獲得本發(fā)明CCP5F、CCP5G和CCP5H多肽，經(jīng)鑒定它們的 理化特性分別為：
[0095] 本發(fā)明CCP5F多肽為18個氨基酸長的環(huán)狀多肽（圖4)，分子量為2100. 85道爾 頓（Dal)，在與BSA偶聯(lián)之前，氨基（-NH2)末端的修飾為氫鏈（H)，羥基（COOH)末端的修飾 為羥基（OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波長的遷移紫外吸收峰為在 0-2分鐘達(dá)到95% A峰（主峰），在2~10分鐘后為5%的B峰。此多肽經(jīng)BSA偶聯(lián)后，濃 度仍然按照CCP5F多肽的濃度計算（BSA為載體，濃度在反應(yīng)中忽略不計），經(jīng)冷凍干燥后， 配成1.0 mg/ml在PBS緩沖液中（可溶性佳）的多肽蛋白溶液并經(jīng)0. 22um過濾，無菌保存 在4 °C冰箱中。
[0096] 本發(fā)明CCP5G多肽為18個氨基酸長的多肽（圖4)，分子量為1967. 23道爾頓 (Dal)，在與BSA偶聯(lián)之前，氨基（-NH2)末端的修飾為氫鏈（H)，羥基（COOH)末端的修飾為 羥基（OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波長的遷移紫外吸收峰為在0-2 分鐘達(dá)到95% A峰（主峰），在2-10分鐘后為5%的B峰。此多肽經(jīng)BSA偶聯(lián)后，濃度仍 然按照CCP5G多肽的濃度計算（BSA為載體，濃度在反應(yīng)中忽略不計），經(jīng)冷凍干燥后，配成 1.0 mg/ml在PBS緩沖液中（可溶性佳）的多肽蛋白溶液并經(jīng)0· 22um過濾，無菌保存在4°C 冰箱中。
[0097] 本發(fā)明CCP5H多肽為18個氨基酸長的環(huán)狀多肽（圖4)，分子量為2239. 24道爾頓 (Dal)，在與BSA偶聯(lián)之前，氨基（-NH2)末端的修飾為氫鏈（H)，羥基（COOH)末端的修飾為 羥基（OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波長的遷移紫外吸收峰為在0-2 分鐘達(dá)到95% A峰（主峰），在2~10分鐘后為5%的B峰。此多肽經(jīng)BSA偶聯(lián)后，濃度仍 然按照CCP5e多肽的濃度計算（BSA為載體，濃度在反應(yīng)中忽略不計），經(jīng)冷凍干燥后，配成 1.0 mg/ml在PBS緩沖液中（可溶性佳）的多肽蛋白溶液并經(jīng)0· 22um過濾，無菌保存在4°C 冰箱中。
[0098] 實施例2 CCP5F、CCP5G和CCP5H多肽特征和抗原抗體的比較
[0099] CCP5F、CCP5G和CCP5H多肽BSA偶聯(lián)蛋白，分別用加強免疫法免疫美國得克薩斯 州的純種山羊，以產(chǎn)生較高滴度的抗血清。圖5鑒定抗CCP5F-H抗體與抗原的反應(yīng)性（反 應(yīng)滴度），抗CCP5F-H抗血清經(jīng)三倍系列稀釋后與對應(yīng)的抗原CCP5G多肽-BSA抗原蛋白反 應(yīng)，并經(jīng)二抗-HRP信號放大反應(yīng)后，在96孔ELISA板上顯示出不同中的吸光度（OD)和梯 度曲線，以代表羊抗CCP5F、CCP5G和CCP5H抗體的效價。
[0100] 羊抗CCP5F-H抗血清ELISA效價反應(yīng)的鑒定，方法和步驟為：在PBS中CCP5F-H以 〇. 5微克/微升（ug/ml)的濃度100微升/孔（ul/well)包被于96孔ELISA板上（MaxiSorb plate，Nunc, Inc.)室溫過夜。第二天，用I. 5%BSA/PBST(牛血清白蛋白/磷酸鹽/吐溫-20 緩沖液）封閉一小時，然后分別加上已經(jīng)三倍系列稀釋的羊抗CCP5F、CCP5G、CCP5H和相應(yīng) 的羊的血清（在免疫羊之前收集的，作為本底對照），室溫反應(yīng)1小時；用PBST洗滌三次后 加上100ul/well經(jīng)1 : 4000稀釋后的HRP偶聯(lián)的兔抗羊抗體（美國Jackson ImmunoLab 公司），室溫哺育反應(yīng)1小時，再用PBST洗滌四次后，加 HRP的底物TMB和過氧化氫溶液 進(jìn)行顯色；最后在Dynatech MR5000酶標(biāo)閱讀儀上取λ = 450nm波長閱讀OD值和λ = 590nm波長參比OD值（減少本底的讀數(shù)）而取得相對的抗體滴度效價。從圖5的結(jié)果上， CCP5G抗體效價達(dá)1:6000 土，效價最高，CCP5F抗體和CCP5H抗體效價分別為1:2000 土和 1:1500土。
[0101] 從圖5中可以看到，在免疫羊血清本底對照組中，CCP5F-H有一些本底，原因可能 此類動物羊的聚球蛋白與BSA有一些非特異性的吸附，或者在兔抗羊抗體中有非特異性反 應(yīng)，但是這些本底并不是太高，不會影響到測定的OD讀數(shù)。
[0102] 實施例3 CCP5F-H多肽的BSA偶聯(lián)蛋白與臨床上應(yīng)用CCP多肽蛋白的診斷價值和 意義比較
[0103] 選擇臨床常用的CCP方法作為參考方法（試劑盒購自德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份 公司）對21例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA)患者血清測定，將其低、中和高三種結(jié)果各7例RA血清 選出，同時隨機(jī)選取20例正常人血清進(jìn)行混合。將混合正常人血清分別稀釋此21例高、中 和低CCP值的RA患者血清（稀釋至理論正常參考范圍）。然后用參考方法和CCP5F~H的 ELISA分別進(jìn)行檢測，所得結(jié)果如表1所示。
[0104] 表1在檢測臨界值區(qū)域CCP抗體與CCP5F~H比較
[0105]
[0106] 表1可見，當(dāng)將CCP5F、CCP5G和CCP5E蛋白多肽和CCP多肽互相比較，CCP5G為抗 原的ELISA檢測CCP抗體的值相對最高、CCP5F次之，CCP5H相對較低。
[0107] 實施例4 CCP5G多肽的KLH偶聯(lián)蛋白的制備、鑒定與保存
[0108] 采用鎖孔血藍(lán)蛋白（KLH，約56kDa分子量大?。┲苽淞?CCP5G多肽的KLH偶聯(lián)蛋 白。
[0109] 將實施例1中的BSA偶聯(lián)蛋白和本實施例的KLH偶聯(lián)蛋白分別以0.5ug/mL， lOOul/well包被于96孔ELISA反應(yīng)板上并室溫過夜，反應(yīng)板封閉后，將已經(jīng)1:100稀釋的 混合正常人血清（用德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司的抗CCP抗體ELISA檢測試劑盒而檢 測到CCP約為1個單位）和1:100稀釋的已用歐蒙試劑盒檢測過的RA患者血清（CCP中度 陽性）lOOul/well加在已包被和封閉好的ELISA反應(yīng)板上，室溫1小時后洗滌三次，再加 100111/冊11以1:30,000稀釋!11^偶聯(lián)的羊抗人186，室溫1小時后再洗滌四次，加!11^底 物溶液（TMB和過氧化氫）并顯色10分鐘，讀取OD 450/590nm值，表2顯示了 BSA和KLH 分別偶聯(lián)的CCP5G與正常人和RA患者血清反應(yīng)的比較。
[0110]
[0111] 注：RA患者血清的陽性對照是以已臨床測定的RF、IgM-RFXRP和CCP等的中間值 域（0D值）的患者血清（各3例）混合而成。CCP5G RU/ml是由取各3份混合陽性血清OD 值及各3份混合正常人血清OD值除得平均值為相應(yīng)的抗CCP5單位（RU/ml)(重復(fù)三次）。
[0112] 從表3的結(jié)果分析看，KLH偶聯(lián)的CCP5G也能夠用于RA的檢測，但BSA偶聯(lián)的 CCP5G更優(yōu)。
[0113] 實施例5間接ELISA法測定樣本內(nèi)抗CCP5G抗體以及與現(xiàn)有方法的比較
[0114] 5. 1抗CCP5G單位的定義
[0115] 本實施例采用間接ELISA法，臨床上的血清標(biāo)本用生理鹽水作1 : 100稀釋后為 樣本進(jìn)行檢測。酶標(biāo)的封閉液采用1. 5 % BSA/1. 0 %牛血清/PBST緩沖液（pH7. 4的磷酸鹽、 Tween-20和牛血清白蛋白緩沖液）。
[0116] CCP5G蛋白多肽診斷單位的定值，采用10份CCP5G陽性血清和10份混合正常人血 清（其CCP值在1.0 RU/ml，即歐蒙公司相對單位）進(jìn)行間接ELISA檢測并重復(fù)3次，然后分 別計算其混合陽性血清和混合正常人陰性血清的平均吸光度值。其中，定義該混合正常人 陰性血清的抗CCP5G自身抗體水平吸光度值（Atl)的為一個抗CCP5G單位。再將混合陽性血