號(hào)WO 00/18434中描述的那些（其中氨基酸位置29的谷氨酸被另一氨基酸（不同于天冬氨酸）代 替，優(yōu)選被組氨酸代替）。類似的CT或突變體描述于公開的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 02/098368 中（其中氨基酸位置16的異亮氨酸被另一氨基酸單獨(dú)代替或者與氨基酸位置68的絲氨酸 被另一氨基酸代替相組合；和/或其中氨基酸位置72位的纈氨酸被另一氨基酸代替）。其 他CT毒素描述于公開的國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O 02/098369 (其中氨基酸位置25的精氨酸被另 一氨基酸代替；和/或在氨基酸位置49插入氨基酸；和/或兩個(gè)氨基酸插入氨基酸位置35 和36)。將這些參考文獻(xiàn)各自完整引入本文作為參考。
[0151] 在一些實(shí)施方案中，通過多種途徑對(duì)人或?qū)Ψ侨思棺祫?dòng)物施用本發(fā)明的免疫原性 組合物，所述途徑包括，但不限于，鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、腸胃外、皮內(nèi)、經(jīng)皮（見例如，國(guó) 際專利公布號(hào)WO 98/20734,將其完整引入本文作為參考），肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)和 動(dòng)脈內(nèi)途徑?？梢愿鶕?jù)使用的免疫原性組合物的性質(zhì)、患者的年齡、體重、性別和一般健康 的評(píng)估和免疫原性組合物中存在的抗原，和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他因素選擇合適 的途徑。
[0152] 在一些實(shí)施方案中，多次施用免疫原性組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的相關(guān)因素選擇免疫原性組合物施用的順序和各施用之間的時(shí)間期限，所述因素 包括但不限于，宿主的身體特征和對(duì)方法應(yīng)用的準(zhǔn)確應(yīng)答。
[0153] 藥物制劑
[0154] 在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生的糖蛋白將具有藥理學(xué)活性并且將可用于制備藥物。上 述發(fā)明組合物可以施用于受試者或者可以首先通過任何可利用的途徑配制用于遞送，所述 途徑包括但不限于腸胃外（例如，靜脈內(nèi)）、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口、經(jīng)鼻、支氣管、眼、經(jīng)皮（局 部）、經(jīng)粘膜、直腸和陰道途徑。本發(fā)明的藥物組合物通常包括從哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)的 純化的糖蛋白、遞送試劑（例如，如上述的陽離子聚合物、肽分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、表面活性劑等 等）與可藥用載體的組合。如本文所用，術(shù)語"可藥用載體"包括與藥物施用相容的溶劑、 分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑，等等。補(bǔ)充性活性化合物也可以 摻入組合物中。例如，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的糖蛋白可以額外綴合到用于全身藥物療法的其他 藥物，如毒素、低分子量細(xì)胞毒性藥物、生物學(xué)應(yīng)答修飾劑，和放射性核素（見例如，Kunz等 人，Calicheamicin derivative-carrier coniugates, US20040082764 Al) 〇
[0155] 備選或額外地，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽可以與一種或多種額外的藥學(xué) 活性劑（同時(shí)或者順序）組合施用。這些藥學(xué)活性劑的示例性列表可以見醫(yī)師案頭參考 (Physicians'Desk Reference)第 55片反（Medical Economics Co. , Inc. , Montvale, NJ, 2001 出版，引入本文作為參考）。對(duì)于許多這些列出的活性劑，藥物有效劑量和方案是本領(lǐng)域已 知的；許多在醫(yī)師案頭參考中給出。
[0156] 可以有利地配制藥物組合物與其預(yù)期的施用途徑相容。用于腸胃外、皮內(nèi)或皮下 應(yīng)用的溶液劑或混懸劑可以包括下面的組分：無菌稀釋劑，如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā) 油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其他合成的溶劑；抗細(xì)菌劑，如苯甲醇或者對(duì)羥基苯甲酸甲 酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或者亞硫酸氫鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸；緩沖劑，如乙酸鹽、 檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或葡萄糖?？梢杂盟峄驂A，如鹽酸或者 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH?？梢詫⒛c胃外制劑封裝在安瓿、一次性注射器或者由玻璃或者塑料制造 的多劑量瓶中。
[0157] 適于注射使用的藥物組合物通常包括無菌水溶液（其中水可溶的）或者分散體和 用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽 水、抑菌水、Cremophor EL?(BASF, Parsippany, NJ)或磷酸緩沖鹽水（PBS)。在所有情況下， 組合物將是無菌的并且應(yīng)該是流動(dòng)的，達(dá)到容易注射的程度。本發(fā)明的某些藥物制劑在生 產(chǎn)和保持條件下是穩(wěn)定的并且必須保存以抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。通常，相關(guān) 載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如，水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇和液體聚乙 二醇等等），和其合適的混合物。例如，通過使用包衣如卵磷脂，對(duì)于分散體的情況通過保持 所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。通過多種抗細(xì)菌和抗真菌 劑可以實(shí)現(xiàn)防止微生物的作用，所述抗細(xì)菌和抗真菌劑為例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、 苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等。在許多情況下，將有利地在組合物中包括等滲劑，如糖、多元 醇，如甘露醇、山梨醇或者氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明 膠可以延長(zhǎng)可注射組合物的吸收。
[0158] 通過在合適的溶劑中以所需量摻入純化的糖蛋白與（如果需要）上面列舉的成分 之一或者組合，接著通過過濾除菌，可以制備無菌注射溶液。通常，通過在含有基本分散介 質(zhì)的無菌載體中摻入從哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)的純化的糖蛋白和來自上面列舉的那些的所 需的其他成分可以制備分散體。對(duì)于用于制備無菌注射溶液的無菌粉劑的情況，制備方法 包括，例如，真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分的粉末加上來自其以前無菌過濾溶液的 任何額外的所希望成分。
[0159] 經(jīng)口組合物一般包括惰性稀釋劑或者可食用的載體。對(duì)于經(jīng)口治療施用的目的， 所純化的糖蛋白可以摻入賦形劑并以片劑、含片、或膠囊劑，如明膠膠囊劑的形式使用。使 用液體載體也可以制備用作漱口水的經(jīng)口組合物?？梢园ㄋ帉W(xué)上相容的黏合劑和/或佐 劑物質(zhì)作為組合物的部分。片劑、丸劑、膠囊劑、含片等等可以含有任一種下面的成分，或者 類似性質(zhì)的化合物：黏合劑，如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖，崩解 劑，如藻酸、Primogel或者玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂或Sterotes ;助流劑，如二氧化娃 膠體；增甜劑，如蔗糖或糖精；或者調(diào)味劑，如薄荷油、水楊酸甲酯或者橙子調(diào)味劑。用于經(jīng) 口遞送的制劑可以有利地?fù)饺朐噭┮蕴岣咴谖改c道內(nèi)的穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)吸收。
[0160] 對(duì)于通過吸入施用，包含從哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)的純化的糖蛋白和遞送劑的本發(fā) 明組合物有利地以氣霧劑噴霧的形式從加壓的容器或分配器或噴霧器遞送，所述容器或分 配器含有合適的推進(jìn)劑，例如，氣體，如二氧化碳。本發(fā)明尤其設(shè)想使用經(jīng)鼻噴霧、吸入器遞 送組合物或者直接遞送到上和/或下呼吸道。已經(jīng)表明抗流感病毒的DNA疫苗的鼻內(nèi)施用 誘導(dǎo)⑶8T細(xì)胞應(yīng)答，表明當(dāng)通過該途徑遞送時(shí)，呼吸道中的至少一些細(xì)胞攝入DNA，并且本 發(fā)明的遞送劑將增強(qiáng)細(xì)胞攝入。根據(jù)一些實(shí)施方案，將包含從哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)的純化 的糖蛋白和遞送劑的組合物配制為用于氣霧劑施用的大孔顆粒。
[0161] 也可以通過經(jīng)粘膜或者經(jīng)皮方式進(jìn)行全身施用。對(duì)于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮施用，適于待 穿透的屏障的穿透劑可以用于制劑中。此類穿透劑是本領(lǐng)域公知的，并且對(duì)于經(jīng)粘膜施用， 包括例如，去污劑、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。通過使用經(jīng)鼻噴霧或者栓劑也可以完成經(jīng)粘 膜施用。對(duì)于經(jīng)皮施用，將純化的糖蛋白和遞送劑配制成如本領(lǐng)域公知的軟膏劑、油膏劑、 凝膠劑或者霜?jiǎng)?br>[0162] 組合物也可以以栓劑（例如使用常規(guī)栓劑基質(zhì)，如可可脂和其他甘油酯）或者保 留灌腸劑的形式制備用于直腸遞送。
[0163] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有任選的賦形劑，如局部麻醉藥、肽、 脂類，包括陽離子脂類、脂質(zhì)體或者脂類顆粒，聚陽離子，如聚賴氨酸、分枝的三維聚陽離 子，如樹狀聚體、糖類、陽離子兩親化合物、去污劑、芐基銨表面活性劑，或者促進(jìn)多核苷酸 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的另一化合物。此類促進(jìn)試劑包括局部麻醉藥布比卡因或丁卡因（見例如，美 國(guó)專利號(hào) 5, 593, 972 ;5, 817, 637 ;5, 380, 876 ;5, 981，505 和 6, 383, 512 和國(guó)際專利公開號(hào) W098/17799,將其各種完整引入本文作為參考）。
[0164] 在一些實(shí)施方案中，用保護(hù)糖蛋白免于從身體快速清除的載體制備組合物，如控 釋制劑，包括植入物和微囊化的遞送系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，如乙 烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯，和聚乳酸。制備此類制劑的方法將是本領(lǐng) 域技術(shù)人員顯而易見的。也可以從Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc.通 過商業(yè)途徑得到材料。脂質(zhì)體懸浮液（包括用抗病毒抗原的單克隆單體靶向受感染細(xì)胞的 脂質(zhì)體）也可以用作可藥用載體。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法（如美國(guó)專利號(hào) 4, 522, 811中所述，完整引入本文作為參考）制備此類懸浮液。
[0165] 可以有利地以單位劑型配制經(jīng)口或腸胃外組合物以容易施用和劑型的均一性。如 本文所用的單位劑型指適合作為待治療受試者的單一劑量的物理上分散的單位，每一單位 含有預(yù)定量的活性糖蛋白，所述量經(jīng)計(jì)算與所需的藥物載體結(jié)合產(chǎn)生希望的治療效果。
[0166] 根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的糖蛋白可以以所需的不同間隔和在不同時(shí)間期限內(nèi)施用，如每 周一次持續(xù)約1到10周、2到8周、約3到7周、約4、5或6周等等。技術(shù)人員將理解某些 因素可以影響有效治療受試者所需的劑量和時(shí)限，包括但不限于受試者的疾病或病癥的嚴(yán) 重性、以前的治療、一般健康和/或年齡，和存在的其他疾病。通常，用如本文所述的糖蛋白 對(duì)受試者的治療可以包括單一治療，或者在許多情況下，可以包括一系列治療。將理解合適 的劑量可以取決于糖蛋白的效力并且可以任選為具體接受者定制，例如，通過施用增加的 劑量直到實(shí)現(xiàn)預(yù)先選擇的所希望的應(yīng)答。還將理解任一具體動(dòng)物受試者的特定劑量水平可 以取決于多種因素，包括使用的具體糖蛋白的活性、受試者的年齡、體重、一般健康、性別和 飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄速率、任何藥物組合，和/或被調(diào)節(jié)的表達(dá)或活性的程度。
[0167] 本發(fā)明包括使用本發(fā)明組合物治療非人動(dòng)物。因此，可以根據(jù)獸醫(yī)藥理學(xué)和 醫(yī)學(xué)的已知的原理選擇施用劑量和方法。教導(dǎo)可以見例如Adams, R. (ed.)，Veter inary Pharmacology and Therapeutics,第 八片反，Iowa State University Press ； ISBN:0813817439 ；2001〇
[0168] 本發(fā)明藥物組合物可以與施用說明書一起包括在容器、包裝或者分配器中。
[0169] 將理解前面的描述僅僅是代表性的并且不意在進(jìn)行限制。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明和額 外的應(yīng)用的備選方法和材料是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，并且意在包括在所附權(quán)利要求 中。 實(shí)施例
[0170] 實(shí)施例1:培養(yǎng)基制劑
[0171] 本發(fā)明包括如下發(fā)現(xiàn)：通過在含有一種或多種本發(fā)明濃度的錳的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì) 胞產(chǎn)生的糖蛋白比所述細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)產(chǎn)生的糖蛋白具有更廣泛的糖基化模式。 可以將錳加入能夠支持細(xì)胞生長(zhǎng)的任何培養(yǎng)基中?？梢约尤肴我槐景l(fā)明濃度內(nèi)的錳的示例 性培養(yǎng)基在表1中列出，然而本發(fā)明不限于利用這些培養(yǎng)基。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的， 其他培養(yǎng)基可以用于生長(zhǎng)細(xì)胞和/或可以對(duì)表1中所列的示例性培養(yǎng)基的組成做出一些改 變。
[0172] 表1.示例性培養(yǎng)基
[0173]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生糖蛋白的方法，其包括： 將含有編碼目的糖蛋白的基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在包含約IOnM到600nM錳的細(xì)胞培養(yǎng) 基中培養(yǎng)，培養(yǎng)的條件和時(shí)間足夠允許表達(dá)所述糖蛋白，其中所表達(dá)的糖蛋白的糖基化模 式比在缺少錳的其他方面相同的培養(yǎng)基中在其他方面相同條件下觀察到的糖基化模式更 廣泛。
2. 權(quán)利要求1的方法，其包括步驟： 在包含約IOnM到600nM錳的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼目的糖蛋白的基因的哺乳動(dòng) 物細(xì)胞； 在第一個(gè)溫度范圍保持培養(yǎng)物第一個(gè)時(shí)間期限，所述第一個(gè)時(shí)間期限足夠允許細(xì)胞再 生至如果培養(yǎng)物保持在第一個(gè)溫度范圍時(shí)最大可能的活細(xì)胞密度的約20% -80%范圍內(nèi) 的活細(xì)胞密度； 將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)換到第二個(gè)溫度范圍，其中第二個(gè)溫度范圍的至少一個(gè)溫度低于第一個(gè)溫 度范圍的最低溫度； 在足夠允許所述糖蛋白表達(dá)的條件和時(shí)間內(nèi)保持培養(yǎng)物第二個(gè)時(shí)間期限，其中所表達(dá) 的糖蛋白的糖基化模式比在缺少錳的其他方面相同的培養(yǎng)基中在其他方面相同條件下觀 察到的糖基化模式更廣泛。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中第一個(gè)溫度范圍包含約30到42°C的溫度范圍。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中第一個(gè)溫度范圍包含約37°C的溫度。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2到4任一項(xiàng)的方法，其中所述第二個(gè)溫度范圍包含約25到41°C的 溫度范圍。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述第二個(gè)溫度范圍包含約31°C的溫度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2到6任一項(xiàng)的方法，其還包含第一個(gè)轉(zhuǎn)換步驟后的第二個(gè)轉(zhuǎn)換步驟， 該第二個(gè)轉(zhuǎn)換步驟包括將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)換到第三個(gè)溫度或溫度范圍，其中第三個(gè)溫度范圍的至 少一個(gè)溫度低于第二個(gè)溫度范圍的最低溫度。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中第三個(gè)溫度范圍包含約25到40°C的溫度范圍。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約20到200nM錳。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約40nM錳。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1到10任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)基包含最初濃度小于或等于約 8mM的谷氨酰胺。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基的最初谷氨酰胺濃度小于或等于約4mM。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1到12任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物的體積為至少約500L。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1到13任一項(xiàng)的方法，其中最初的細(xì)胞培養(yǎng)開始后進(jìn)一步為細(xì)胞培 養(yǎng)物提供補(bǔ)料培養(yǎng)基。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1到14任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)一步為細(xì)胞培養(yǎng)物提供補(bǔ)充組分。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述補(bǔ)充組分選自激素和/或其他生長(zhǎng)因子、無機(jī)離子、 緩沖劑、維生素、核苷或核苷酸、微量元素、氨基酸、脂類、葡萄糖或其他能源，和其組合。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中為所述細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)充約2克/升的葡萄糖。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1到17任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1到18任一項(xiàng)的方法，其中目的糖蛋白包含凝血因子IX。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中凝血因子IX是重組人凝血因子IX。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1到18任一項(xiàng)的方法，其中目的糖蛋白包含抗ABeta抗體。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中抗ABeta抗體是單克隆抗體。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中抗ABeta抗體是人源化的抗ABeta肽IgGl單克隆抗體。
24. 包含約10到600nM錳的細(xì)胞培養(yǎng)基。
25. 權(quán)利要求24的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含約20到200nM錳。
26. 權(quán)利要求25的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含約40nM錳。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24到26任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中細(xì)胞培養(yǎng)基包含最初濃度小于或 等于約SmM的谷氨酰胺。
28. 權(quán)利要求27的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中最初的谷氨酰胺濃度小于或等于約4mM。
29. 根據(jù)權(quán)利要求24到28任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中該培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基。
30. 通過權(quán)利要求1到23任一項(xiàng)的方法得到的糖蛋白。
【專利摘要】提供了用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中大規(guī)模產(chǎn)生糖蛋白的改進(jìn)系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞生長(zhǎng)在含有約10到600nM濃度的錳的培養(yǎng)基中。此類系統(tǒng)的使用允許產(chǎn)生糖蛋白，該糖蛋白具有增加的糖基化模式和/或更準(zhǔn)確反映了天然存在的糖蛋白的糖基化模式。根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的糖蛋白可以有利地用于制備藥物組合物。
【IPC分類】C12P21-08, C12R1-91
【公開號(hào)】CN104878064
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510345792
【發(fā)明人】D·R·拉斯科, S·M·科扎
【申請(qǐng)人】惠氏公司
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2007年7月11日
【公告號(hào)】CA2657248A1, CN101541950A, EP2041270A1, EP2041270B1, EP2495307A1, US8129145, US20080081356, WO2008008360A1