PCR代表治療干預(yù)的最重要的靶標(biāo),30 %的臨床處方藥拮抗或者激動GPCR(Milligan,G. 和Rees,S.,TIPS,20:118-124, 1999)。因為此類受體具有作為治療靶標(biāo)的確立的被證明的 歷史,所以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生具有希望的糖基化模式的GPCR也是尤其重要的。例如,根據(jù)本 發(fā)明表達(dá)的具有希望的糖基化模式的GPCR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以通過滴定或者螯合配體而 作為重要的治療劑,其中所述配體對內(nèi)源GPCR的結(jié)合是有害的。
[0101] GPCR,以及G蛋白和效應(yīng)子(受G蛋白調(diào)節(jié)的細(xì)胞內(nèi)酶和通道)是調(diào)節(jié)信號系統(tǒng) 的組分,所述系統(tǒng)連接細(xì)胞內(nèi)第二信使的狀態(tài)與細(xì)胞外輸入。此類基因和基因產(chǎn)物是疾病 的潛在病因。
[0102] GPCR蛋白質(zhì)超家族現(xiàn)在含有250種以上類型的種內(nèi)同源物,其代表基因復(fù)制(或 其他加工)產(chǎn)生的變體,與直向同源物相反,其中直向同源物是來自不同物種的相同受體。 該超家族可以分成5個家族:家族I:以視紫紅質(zhì)和β2-腎上腺素能受體為代表的受體并 且當(dāng)前通過200種以上的獨特成員代表;家族II:最近表征的甲狀旁腺激素/降鈣素/分 泌素受體家族;家族III :哺乳動物中的代謝型谷氨酸受體家族;家族IV :cAMP受體家族, 在盤基網(wǎng)柄菌(D.discoideum)的趨化性和發(fā)育中是重要的;和家族V:真菌交配信息素受 體如STE2。
[0103] GPCR包括生物胺類、炎癥的脂類介體、肽激素和感覺信號介體的受體。GPCR當(dāng)結(jié) 合到它的細(xì)胞外配體時被活化。配體一受體相互作用導(dǎo)致的GPCR的構(gòu)象改變影響G蛋白 與GPCR細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力。這使得GTP能夠以增強(qiáng)的親和力結(jié)合G蛋白。
[0104] GTP對G蛋白的活化導(dǎo)致G蛋白α亞基與腺苷酸環(huán)化酶或者其他第二信使分子產(chǎn) 生者的相互作用。該相互作用調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性從而調(diào)節(jié)第二信使分子cAMP的產(chǎn) 生。cAMP調(diào)節(jié)其他細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化和活化。備選地,GPCR的活性可以上調(diào)或者下調(diào) 其他第二信使分子如cGMP或eicosinoids的細(xì)胞水平。G蛋白α亞基通過GTP酶對GTP 的水解失活,并且α、Βε τ α和γ亞基再結(jié)合。異三聚體G蛋白然后與腺苷酸環(huán)化酶或 其他第二信使分子產(chǎn)生者解離。GPCR的活性也可以通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或環(huán)的磷酸 化調(diào)節(jié)。
[0105] 谷氨酸受體形成在神經(jīng)傳遞中重要的一組GPCR。谷氨酸是CNS中的主要神經(jīng)遞 質(zhì)并且被認(rèn)為在神經(jīng)元可塑性、認(rèn)知、記憶、學(xué)習(xí)和一些神經(jīng)性障礙如癲癇、中風(fēng)和神經(jīng)變 性中起重要作用(Watson, S.和 S.Arkinstall,1994)The G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, ρρ· 130-132)。谷氨酸的這些效應(yīng)通過稱作離 子型和代謝型受體的兩個不同類別的受體介導(dǎo)。離子型受體含有內(nèi)在的陽離子通道并且 介導(dǎo)谷氨酸的快速興奮作用。代謝型受體是調(diào)節(jié)性的,通過抑制依賴鈣的鉀電導(dǎo)和抑制和 加強(qiáng)離子型受體的興奮傳導(dǎo)而增加神經(jīng)元的膜興奮性。代謝型受體基于激動劑藥理學(xué)和 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被分成5個亞類并且在腦組織中廣泛分布。已經(jīng)表明N-連接的糖基化在人 1型α代謝型谷氨酸(mGlula)受體的功能中是重要的(Mody等人,Neuropharmacology 38 (10) : 1485-92, 1999)。mGlul α通常至少部分作為由約145和160KDa的單體組成的二聚 體表達(dá)。通過用N-連接的糖基化的有效抑制劑衣霉素處理mGlula,Mody等人闡明盡管細(xì) 胞表面表達(dá)不受影響,但是僅僅表達(dá)一種肽,其通過其一級氨基酸序列預(yù)測具有約130kDa 的質(zhì)量。在功能上,用衣霉素處理與未處理的細(xì)胞群體相比,激動劑刺激的磷酸次黃苷酸水 解降低了約50%。從而,根據(jù)本發(fā)明調(diào)節(jié)所表達(dá)的GPCR的糖基化模式可用于調(diào)節(jié)所表達(dá)的 GPCR的信號功能并且潛在控制或影響所表達(dá)的GPCR的藥學(xué)或其他性質(zhì)。
[0106] 血管活性腸肽(VIP)家族是一組相關(guān)的多肽,其作用也通過GPCR介導(dǎo)。該家族的 關(guān)鍵成員是VIP自身、促胰液素和生長激素釋放因子(GRF) JIP具有寬的生理作用譜,包括 平滑肌的松弛、多種組織中分泌的刺激或抑制、多種免疫細(xì)胞活性的調(diào)節(jié),和CNS中多種興 奮性和抑制性活性。促胰液素刺激胰腺和腸中酶和離子的分泌并且也以少量存在于腦中。 已經(jīng)表明VIP受體的糖基化對其同族VIP的結(jié)合具有重要影響(Chochola等人,J. Biol. Chem. 268:2312-2318, 1993)。通過用麥胚凝集素處理VIP受體立體地阻斷寡糖鏈以依賴劑 量的方式顯著抑制VIP結(jié)合并且減小了 VIP刺激的cAMP應(yīng)答。此外,VIP受體中特定N-連 接的糖基化位點的突變導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中受體的滯留,表明正確的糖基化對于向細(xì)胞表面的遞 送是關(guān)鍵的(Couvineau等人,Biochemistry 35 (6) : 1745-52, 1996)。從而,調(diào)節(jié)根據(jù)本發(fā) 明表達(dá)的GPCR的糖基化模式可以用于調(diào)節(jié)(例如,增加或減少)所表達(dá)的GPCR與其同族 配體的結(jié)合和潛在控制或影響所表達(dá)的GPCR的藥學(xué)性質(zhì)或其他性質(zhì)。
[0107] 通常,本發(fā)明的實踐者將選擇目的糖蛋白,并且將知道它的精確氨基酸序列。本發(fā) 明的技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于0-連接的(實施例1和2)和N-連接的(實施例3和4)糖蛋白, 表明本發(fā)明將可應(yīng)用于一般的糖蛋白表達(dá)。將根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的任何給定的糖蛋白可以具 有其自身的具體特征并且可以影響所培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞密度和生存力,可以比在相同培養(yǎng)條 件下生長的另一糖蛋白以更低水平表達(dá),并且可以取決于確切的培養(yǎng)條件和進(jìn)行的步驟在 一個或多個位點被不同地糖基化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠適當(dāng)修飾用于根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)產(chǎn) 生具體糖蛋白的步驟和組合物以便優(yōu)化細(xì)胞生長和任何給定表達(dá)的糖蛋白產(chǎn)生和/或糖 基化模式。
[0108] 在一些實施方案中,根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)和方法表達(dá)腫瘤壞死因子α和β受體形 式的腫瘤壞死因子抑制劑(TNFR-1 ;1991年3月20日公布的ΕΡ417, 563 ;和TNFR-2, 1991年 3月20日公布的EP 417,014,各自完整引入本文作為參考)(回顧見Naismith和Sprang, J Inf lamm. 47 (1-2): 1-7, 1995-96,完整引入本文作為參考)。根據(jù)一些實施方案,腫瘤壞死 因子抑制劑包含可溶性TNF受體。在一些實施方案中,腫瘤壞死因子抑制劑包含可溶性 TNFR-Ig。在一些實施方案中,本發(fā)明的TNF抑制劑是可溶形式的TNFRI和TNFRII。在一 些實施方案中,本發(fā)明的TNF抑制劑是可溶性TNF結(jié)合蛋白。在一些實施方案中,本發(fā)明的 TNF抑制劑是TNFR-Ig融合蛋白,例如,TNFR-Fc或etanercept。如本文所用,〃etanercept〃 指TNFR-Fc,其是p75TNF-a受體的細(xì)胞外部分的兩個分子的二聚體,每個分子由人IgGl的 235個氨基酸的Fe部分組成。
[01 09] 向宿干細(xì)胞中導(dǎo)入用于表達(dá)糖蛋白的基因
[0110] 通常,導(dǎo)入細(xì)胞中的核酸分子編碼希望根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的糖蛋白。備選地,核酸分 子可以編碼基因產(chǎn)物,其誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)希望的糖蛋白。例如,導(dǎo)入的遺傳物質(zhì)可以編碼活化 內(nèi)源或異源糖蛋白轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。備選或額外地,導(dǎo)入的核酸分子可以增加細(xì)胞表達(dá)的 糖蛋白的翻譯或穩(wěn)定性。
[0111] 適于向哺乳動物細(xì)胞中導(dǎo)入足夠?qū)崿F(xiàn)目的糖蛋白表達(dá)的核酸的方法是 本領(lǐng)域已知的。見例如,Gething 等人,Nature, 293:620-625, 1981 ;Mantei 等 人,Nature, 281:40-46, 1979 ;Levinson 等人 EP 117,060 ;和 EP 117,058,將它們各 自引入本文作為參考。對于哺乳動物細(xì)胞,將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的常規(guī)方 法包括 Graham 和 van der Erb (Virology, 52:456-457, 1978)的磷酸媽沉淀方法或 lipofectamine?(Gibco BRL)Method of Hawley-Nelson(Focus 15:73,1993)。哺乳動物 宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面已經(jīng)由Axel在1983年8月16日公布的美國專利號4, 399, 216 描述。對于向哺乳動物細(xì)胞導(dǎo)入遺傳物質(zhì)的多種技術(shù),見Keown等人,Methods in Enzymology, 1989, Keown等人,Methods in Enzymology, 185:527-537, 1990,和Mansour等 人,Nature, 336:348-352, 1988 〇
[0112] 在一些實施方案中,待導(dǎo)入的核酸是裸核酸分子的形式。例如,待導(dǎo)入細(xì)胞的 核酸分子可以僅由編碼糖蛋白的核酸和必要的遺傳控制元件組成。備選地,編碼糖蛋白 的核酸(包括必要的調(diào)節(jié)元件)可以包含在質(zhì)粒載體中。用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá) 糖蛋白的合適載體的非限制性代表性實例包括P⑶NAl ;ρ⑶,見Okayama,等人Mol. Cell Biol. 5:1136-1142, 1985 ;pMClneo Poly-A,見 Thomas,等人 Cell 51:503-512, 1987;桿狀 病毒載體,如?40 373 或?40 610;00118,見566(1,8.恥忉代 329:840,1987;和?]\0'2?(:,見 Kaufman,等人EMBO J.6:187-195, 1987,將它們各自完整引入本文作為參考。在一些實施 方案中,待導(dǎo)入細(xì)胞的核酸分子包含在病毒載體中。例如,可以將編碼糖蛋白的核酸插入病 毒基因組(或者部分病毒基因組)。指導(dǎo)糖蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)元件可以與插入病毒基因組的 核酸一起被包括(即,連接到待插入病毒基因組的基因)或者可以由病毒基因組自身提供。
[0113] 提供形成含有DNA和磷酸鈣的沉淀可以將裸DNA導(dǎo)入細(xì)胞中。備選地,也可以通過 形成DNA與DEAE-葡聚糖的混合物并將該混合物與細(xì)胞溫育或者通過將細(xì)胞與DNA -起在 合適的緩沖液中溫育并將細(xì)胞進(jìn)行高電壓電脈沖(例如,通過電穿孔)將裸DNA導(dǎo)入細(xì)胞 中。向細(xì)胞導(dǎo)入裸DNA的另一方法是通過將DNA與含有陽離子脂類的脂質(zhì)體懸浮液混合。 然后將DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物與細(xì)胞溫育。也可以通過例如顯微注射將裸DNA直接注射到細(xì) 胞中。
[0114] 備選地,通過將裸DNA與偶聯(lián)到細(xì)胞表面受體配體的陽離子如聚賴氨酸絡(luò)合將 裸 DNA 導(dǎo)入細(xì)胞(見例如,Wu, G.和 Wu, C.H.J· Biol. Chem. 263:14621, 1988 ;Wilson 等人 J. Biol. Chem. 267:963-967, 1992 ;和美國專利號5, 166,320,各自完整引入本文作為參 考)。DNA-配體復(fù)合體與受體的結(jié)合通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用促進(jìn)了對DNA的攝入。
[0115] 使用含有具體核酸序列,如編碼糖蛋白的cDNA的病毒載體是將核酸序列導(dǎo)入細(xì) 胞的常用方法。用病毒載體感染細(xì)胞具有大比例的細(xì)胞接受該核酸的優(yōu)點,其可以避免對 已經(jīng)接受該核酸的細(xì)胞進(jìn)行選擇的需要。此外,病毒載體內(nèi)編碼的分子(如通過病毒載體 所含的cDNA編碼的分子)通常在已經(jīng)攝入病毒載體核酸的細(xì)胞中有效表達(dá)。
[0116] 缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)被良好表征用于基因治療目的的基因轉(zhuǎn)移(回顧見 Miller, A.D. Blood 76:271,1990)??梢詷?gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒,其具有插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒基 因組中的編碼目的糖蛋白的核酸。此外,可以除去逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的部分以使得逆轉(zhuǎn)錄 病毒復(fù)制缺陷。這種復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒然后包裝成病毒體,其可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過輔 助病毒用于感染靶細(xì)胞。
[0117] 可以操作腺病毒的基因組使得它編碼并表達(dá)目的糖蛋白但是在正常的裂解病 毒生命周期中復(fù)制的能力被失活。見例如,Berkner等人BioTechniques 6:616,1988; Rosenfeld 等人 Science 252:431-434, 1991 ;和 Rosenfeld 等人 Cell 68:143-155, 1992。 衍生自腺病毒毒株Ad型5dl324或腺病毒的其他毒株(例如,Ad2,Ad3,Ad7等等)的 合適的腺病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。重組腺病毒是有利的,因為它們不需 要分裂細(xì)胞為有效的基因遞送載體并且可以用于感染多種細(xì)胞類型,包括呼吸道上 皮(Rosenfeld等人,1992,如上引用),內(nèi)皮細(xì)胞(Lemarchand等人,?1"〇(:.似1:1· Acad. Sci. USA 89:6482-6486,1992),肝細(xì)胞(Herz *Gerard,Proc.Natl.Acad. Sci. USA 90:2812-2816,1993)和肌細(xì)胞(Quantin 等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584, 1992)。此外,所導(dǎo)入的腺病毒DNA (和其中含有的外源DNA)不整合到宿主細(xì) 胞的基因組中而是保持附加型,從而避免了由于導(dǎo)入的DNA變得整合到宿主基因組中(例 如,逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA)的情況下發(fā)生插入誘變而引起的潛在問題。此外,腺病毒基因組對于 外源DNA的攜帶能力相對于其他基因遞送載體是強(qiáng)的(高達(dá)8千堿基)(Berkner等人,上 文引用;Haj-Ahmand和Graham,J. Virol. 57:267, 1986)。當(dāng)前使用的多數(shù)復(fù)制缺陷腺病毒 載體對于病毒El和E3基因的所有或者部分是缺失的但是保留高達(dá)80 %的腺病毒遺傳物 質(zhì)。
[0118] 腺伴隨病毒(AAV)是天然存在的缺陷病毒,其需要另一病毒,如腺病毒或皰瘆 病毒,作為有效復(fù)制和生產(chǎn)性生命周期的輔助病毒(回顧見Muzyczka等人Curr. Topics in Micro, and Immunol. ,158:97-129, 1992)。它也是可以將其DNA整合到非分裂的細(xì)胞 并顯示出高頻率的穩(wěn)定整合的少數(shù)幾種病毒之一(見例如,F(xiàn)lotte等人,Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356,1992 ;Samulski 等人,J. Virol. 63:3822-3828,1989;和 McLaughlin 等人,J. Virol. 62:1963-1973, 1989)。含有 AAV 的少至 300 堿基對的載體 可以包裝并整合。外源DNA的空間局限于約4. 5kb。諸如Tratschin等人(Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260, 1985)中描述的AAV載體可以用于向細(xì)胞導(dǎo)入DNA。使用AAV載體已經(jīng) 向不同的細(xì)胞類型中導(dǎo)入了多種核酸(見例如,Hermonat等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470, 1984 Jratschin 等人,Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081,1985 ;Wondisford 等人,Mol. Endocrinol. 2:32-39, 1988 Jratschin 等人,J. Virol. 51:611-619, 1984 ;和 Flotte 等人,J. Biol. Chem. 268:3781-3790, 1993)。
[0119] 當(dāng)用于向細(xì)胞群體導(dǎo)入核酸分子的方法導(dǎo)致大比例的細(xì)胞修飾和細(xì)胞有效表達(dá) 糖蛋白時,可以使用修飾的細(xì)胞群體而不用進(jìn)一步分離或亞克隆該群體內(nèi)的個體細(xì)胞。即, 通過細(xì)胞群體可以產(chǎn)生足夠的糖蛋白使得不需要進(jìn)一步分離細(xì)胞并且該群體可以立即用 于接種細(xì)胞培養(yǎng)物用于產(chǎn)生糖蛋白。備選地,可以希望從有效產(chǎn)生所述糖蛋白的一些細(xì)胞 或單個細(xì)胞分離和擴(kuò)增同質(zhì)細(xì)胞群體。
[0120] 作為向細(xì)胞導(dǎo)入編碼目的糖蛋白的核酸分子的替代,所導(dǎo)入的核酸可以編碼另一 多肽或蛋白,其誘導(dǎo)或提高細(xì)胞內(nèi)源產(chǎn)生的糖蛋白的表達(dá)水平。例如,細(xì)胞可以能夠表達(dá)特 定糖蛋白但是不進(jìn)行細(xì)胞的額外處理時不能表達(dá)該糖蛋白。類似地,為了所希望的目的,細(xì) 胞可以表達(dá)不足量的目的糖蛋白。從而,刺激目的糖蛋白表達(dá)的試劑可以用于誘導(dǎo)或增加 細(xì)胞對該糖蛋白的表達(dá)。例如,所導(dǎo)入的核酸分子可以編碼轉(zhuǎn)錄因子,該轉(zhuǎn)錄因子活化或上 調(diào)目的糖蛋白的轉(zhuǎn)錄。此類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)又導(dǎo)致目的糖蛋白的表達(dá)或者更穩(wěn)健的表達(dá)。
[0121] 在一些實施方案中,指導(dǎo)糖蛋白表達(dá)的核酸穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞。在一些實施方 案中,指導(dǎo)糖蛋白表達(dá)的核酸被暫時導(dǎo)入宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠基于他或她的 實驗需要選擇向細(xì)胞中穩(wěn)定還是暫時導(dǎo)入核酸。
[0122] 編碼目的糖蛋白的基因可以任選連接到一個或多個調(diào)節(jié)性遺傳控制元件