。在一些 實施方案中，遺傳控制元件指導(dǎo)糖蛋白的組成型表達。在一些實施方案中，可以使用提供 編碼目的糖蛋白的基因的誘導(dǎo)型表達的遺傳控制元件。誘導(dǎo)型遺傳控制元件（例如，誘導(dǎo) 型啟動子）的使用允許調(diào)節(jié)細胞中糖蛋白的產(chǎn)生。用于真核細胞的潛在有用的誘導(dǎo)型遺 傳控制元件的非限制性實例包括激素調(diào)節(jié)的元件（例如見Mader, S.和White, J. H.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607,1993)，合成的配體調(diào)節(jié)的元件（見例如，Spencer, D. Μ·等人，Science 262:1019-1024,1993)和電離福射調(diào)節(jié)的元件（例如見，Manome, Υ· 等人，Biochemistry 32:10607-10613, 1993 ;Datta，R.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10149-10153, 1992)。根據(jù)本發(fā)明可以使用本領(lǐng)域已知的額外的細胞特異性或其他調(diào)節(jié) 系統(tǒng)。
[0123] 本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)將能夠選擇和任選地，合適地修飾導(dǎo)入基因的 方法，所述基因引起細胞表達目的糖蛋白。
[0124] 細朐
[0125] 根據(jù)本發(fā)明可以利用易于進行細胞培養(yǎng)和表達糖蛋白的任何宿主細胞。在 一些實施方案中，宿主細胞是哺乳動物。可以根據(jù)本發(fā)明使用的哺乳動物細胞的非 限制性實例包括BALB/c小鼠骨髓瘤系（NS0/1，ECACC N〇:85110503);人成視網(wǎng)膜細 胞（PER. C6(CruCell, Leiden,荷蘭））；用 SV40 轉(zhuǎn)化的猴腎 CVl 系（COS-7, ATCC CRL 1651);人胚腎系（經(jīng)亞克隆用于懸浮培養(yǎng)生長的293或293細胞，Graham等人，J. Gen Virol.，36:59, 1977);倉鼠嬰腎細胞（BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞 +/-DHFR(CH0, Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980);小鼠支持 細胞（TM4, Mather, Biol. R印rod. ,23:243-251，1980);猴腎細胞（CV1ATCC CCL 70);非 洲綠猴腎細胞（VER0-76，ATCC CRL-1587);人宮頸癌細胞（HeLa，ATCC CCL 2);犬腎細 胞（MDCK，ATCC CCL 34);水牛鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442);人肺細胞（W138，ATCC CCL 75);人肝細胞 Ofep G2，HB 8065);小鼠乳腺腫瘤（MMT060562，ATCC CCL51) ;TRI 細胞 (Mather 等人，Annals Ν· Υ· Acad. Sci.，383:44-68, 1982) ;MRC 5 細胞；FS4 細胞；和人肝癌 系 Ofep G2)。
[0126] 此外，根據(jù)本發(fā)明可以利用表達糖蛋白的任何數(shù)目的商業(yè)和非商業(yè)途徑可得到的 雜交瘤細胞系。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解雜交瘤細胞系可以具有不同的營養(yǎng)需求和/或可能 需要不同的培養(yǎng)條件以優(yōu)化生長和糖蛋白表達，并且如需要將能夠修改條件。
[0127] 如上指出，在許多情況下，將選擇或改造細胞以產(chǎn)生高水平糖蛋白。通常，通過人 手操作細胞以產(chǎn)生高水平的糖蛋白，例如，通過導(dǎo)入編碼目的糖蛋白的基因和/或通過導(dǎo) 入調(diào)節(jié)該基因表達的遺傳控制元件（無論內(nèi)源的或?qū)氲模?br>[0128] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在不同細胞類型中產(chǎn)生的糖蛋白可以含有不同的所得的 糖基化模式。例如，Przybylo等人闡明媽黏著蛋白當(dāng)在非惡性上皮輸尿管細胞、v-raf轉(zhuǎn) 染的HCV29細胞和膀胱的移行細胞癌中表達時具有不同的糖基化模式（見Przybylo等 人，Cancer Cell International, 2(1): 6, 2002)。Lifely 等人闡明人源化的 IgG 抗體當(dāng)在 CH0、Y0骨髓瘤和NSO骨髓瘤細胞系中表達時的糖基化模式和生物活性不同（見Lifely等 人，Glycobiology. 5 (8) : 813-22, 1995)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將不用過度實驗就能夠選擇 合適的細胞系用于產(chǎn)生具體的糖蛋白。不管最終選擇的細胞系如何，都可以根據(jù)本發(fā)明表 達糖蛋白，得到更廣泛的糖基化模式。
[0129] 某些糖蛋白對細胞生長、細胞生存力或細胞的一些其他特征具有有害影響，其最 終以某種方式限制了目的糖蛋白的產(chǎn)量。甚至在被改造為表達特定糖蛋白的一種具體類 型的細胞群體中，在該細胞群體中也存在差異使得某些個體細胞將生長的更好，產(chǎn)生更多 目的糖蛋白，產(chǎn)生具有更廣泛的糖基化模式的糖蛋白，或者產(chǎn)生這樣的糖蛋白，其糖基化模 式更準(zhǔn)確地反映了天然存在的糖蛋白的糖基化模式。在一些實施方案中，為培養(yǎng)細胞所選 的具體條件下，由實踐者根據(jù)經(jīng)驗選擇細胞系的穩(wěn)健生長。在一些實施方案中，基于細胞生 長、最終細胞密度、細胞存活百分比、所表達的糖蛋白的效價、寡糖側(cè)鏈的程度和組成或者 實踐者認(rèn)為重要的這些或任何其他條件的任一組合選擇經(jīng)改造以表達具體糖蛋白的個體 細胞用于大規(guī)模生產(chǎn)。
[0130] 培養(yǎng)細朐
[0131] 本發(fā)明可以使用適于表達糖蛋白的任何細胞培養(yǎng)方法。例如，細胞可以分批或補 料分批培養(yǎng)生長，其中在糖蛋白的足夠表達后終止培養(yǎng)，之后收獲所表達的糖蛋白。備選 地，細胞可以灌注培養(yǎng)生長，其中培養(yǎng)不終止并且將新的營養(yǎng)物和其他組分周期性或連續(xù) 加入培養(yǎng)物中，在此期間周期性或連續(xù)地收獲表達的糖蛋白。
[0132] 細胞可以以實踐者所選的任何方便的體積生長。例如，細胞可以在體積為幾毫 升到幾升的小規(guī)模反應(yīng)容器中生長。備選地，細胞可以在約至少1升到10、100、250、500、 1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或以上，或者之間的任何體積的大規(guī)模商業(yè)生物 反應(yīng)器中生長。
[0133] 將主要基于細胞培養(yǎng)物保持存活的溫度范圍、產(chǎn)生高水平糖蛋白的范圍和/或所 表達的糖蛋白含有希望的糖基化模式的范圍選擇細胞培養(yǎng)的溫度。例如，在約37°C下，CHO 細胞生長良好并且可以以商業(yè)上足夠的水平產(chǎn)生具有希望的糖基化模式的糖蛋白。通常， 多數(shù)哺乳動物細胞在約25°C到42°C的范圍內(nèi)生長良好并且可以以商業(yè)上足夠的水平產(chǎn)生 具有希望的糖基化模式的糖蛋白，然而，本公開教導(dǎo)的方法不限于這些溫度。某些哺乳動物 細胞在約35°C到40°C的范圍內(nèi)生長良好并且可以以商業(yè)上足夠的水平產(chǎn)生具有希望的糖 基化模式的糖蛋白。在一些實施方案中，在細胞培養(yǎng)過程中，細胞培養(yǎng)物在20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45。〇的溫度下生 長一次或多次。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇生長細胞的合適溫度，這取決于細胞的具體需 要和實踐者的具體生產(chǎn)要求。
[0134] 此外，培養(yǎng)物可以在培養(yǎng)過程中進行一次或多次溫度轉(zhuǎn)變。當(dāng)轉(zhuǎn)變培養(yǎng)溫度時，溫 度轉(zhuǎn)變可以是相對逐漸的。例如，可以需要幾小時或幾天來完成溫度改變。備選地，溫度轉(zhuǎn) 變可以是相對突然的。溫度可以在培養(yǎng)過程中穩(wěn)定升高或降低。備選地，溫度可以在培養(yǎng) 過程中以離散量多次升高或降低。隨后的溫度或溫度范圍可以低于或高于最初或以前的溫 度或溫度范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在該實施方案中包括多個離散的溫度轉(zhuǎn)變。例如， 溫度可以轉(zhuǎn)變一次（到較高或較低溫度或溫度范圍），細胞在該溫度或溫度范圍保持一段 時間，之后溫度可以再次轉(zhuǎn)變到新的溫度或溫度范圍，其可以高于或低于以前的溫度或溫 度范圍。每次離散轉(zhuǎn)變后培養(yǎng)的溫度可以是恒定的或者可以保持在一定的溫度范圍內(nèi)。
[0135] 關(guān)于最初的溫度或溫度范圍，溫度轉(zhuǎn)變后細胞培養(yǎng)的溫度或溫度范圍通常主要基 于細胞培養(yǎng)物保持存活的溫度、產(chǎn)生高水平糖蛋白的范圍和/或所表達的糖蛋白含有所希 望的糖基化模式的范圍選擇。通常，多數(shù)哺乳動物細胞在約25°C到42°C的范圍內(nèi)保持存活 并且以商業(yè)上足夠的水平表達具有希望的糖基化模式的糖蛋白，盡管本公開教導(dǎo)的方法不 限于這些溫度。在一些實施方案中，哺乳動物細胞在約25°C到35°C的范圍內(nèi)保持存活并且 以商業(yè)上足夠的水平表達具有希望的糖基化模式的糖蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇生 長細胞的合適的溫度或溫度范圍，這取決于細胞的具體需要和實踐者的具體生產(chǎn)要求。取 決于實踐者的需要和細胞自身的需要，細胞可以生長任一時間量。
[0136] 在一些實施方案中，一旦所表達的糖蛋白達到足夠高的效價和/或一旦所表達的 糖蛋白顯示出希望的糖基化模式，就終止分批或補料分批反應(yīng)，如通過實踐者的需要確定。 額外或備選地，一旦細胞達到足夠高的密度就終止分批或補料分批反應(yīng)，如通過實踐者的 需要確定。例如，一旦細胞達到最大存活細胞密度的百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99就終止培養(yǎng)。額外或備選地，可以在代謝廢產(chǎn)物 如乳酸或者銨過量積累之前終止分批和補料分批反應(yīng)。
[0137] 在一些情況中，有益的是在隨后的生產(chǎn)期向細胞培養(yǎng)物補充被細胞耗盡或者代謝 的營養(yǎng)物或者其他培養(yǎng)基組分。作為非限制性實例，有益的是為細胞培養(yǎng)物補充激素和/ 或其他生長因子、無機離子（如鈉、氯化物、鈣、鎂和磷酸鹽）、緩沖劑、維生素、核苷或核苷 酸、微量元素（通常以極低終濃度存在的無機化合物）、氨基酸、脂類或者葡萄糖或其他能 源。此類補充組分可以一次都加入細胞培養(yǎng)物中，或者它們可以在一系列的添加中提供給 細胞培養(yǎng)物。
[0138] 在一些實施方案中，根據(jù)美國臨時專利申請序號60/605, 097(引入本文作為參 考）描述的任一種細胞培養(yǎng)方法生長細胞。在一些實施方案中，在美國臨時專利申請序號 11/213, 308 (引入本文作為參考）中所述的一種或多種條件下生長細胞。
[0139] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠定制具體細胞生長條件以便優(yōu)化細胞培養(yǎng)的一些特征，包 括但不限于生長速率、細胞活力、細胞培養(yǎng)物的最終細胞密度、有害的代謝副產(chǎn)物如乳酸和 銨的終濃度、所表達的糖蛋白的最終效價、寡糖側(cè)鏈的程度和組成或者實踐者認(rèn)為重要的 這些條件或其他條件的任一組合。
[0140] 所表汰糖蛋白的分離
[0141] 通常，典型的是希望分離和/或純化根據(jù)本發(fā)明表達的糖蛋白。在一些實施方案 中，表達的糖蛋白分泌到培養(yǎng)基中從而可以如通過離心或過濾除去細胞和其他固體，作為 純化方法中的第一步。
[0142] 備選地，所表達的糖蛋白可以結(jié)合到宿主細胞的表面。例如，可以除去培養(yǎng)基并裂 解表達糖蛋白的宿主細胞作為純化過程中的第一步?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任 一種方法實現(xiàn)哺乳動物宿主細胞的裂解，所述方法包括通過玻璃珠物理破碎和暴露于高pH 條件。
[0143] 可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離和純化表達的糖蛋白，所述方法包括但不限于，層析（例 如，離子交換、親和、大小排阻和羥基磷灰石層析）、凝膠過濾、離心、或差別溶解度、乙 醇沉淀和/或通過用于純化蛋白質(zhì)的任何其他可用的技術(shù)（見例如，Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2nd Edition,Springer-Verlag, New York, 1987 ；Higgins, S. J.和 Hames, B. D. (eds. ), Protein Expression:A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999 ；and Deutscher, M. P. , Simon, Μ. I. , Abelson, J. N. (eds. ), Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series, Vol. 182) ,Academic Press, 1997,各自引入本文作為參考）。尤其對于 免疫親和層析，可以分離糖蛋白：將它結(jié)合到親和柱，該親和柱包含針對該糖蛋白產(chǎn)生并固 定到固定支持體的抗體。備選地，可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)將親和標(biāo)記如流感外殼序列、聚組 氨酸或者谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶連接到糖蛋白以允許通過穿過合適的親和柱容易地純化。蛋 白質(zhì)抑制劑，如苯甲基磺酰氟（PMSF)、抑酶醛肽、胃蛋白酶抑制劑或抑酶肽可以在任一或所 有階段加入以便減小或者消除純化過程中糖蛋白的降解。當(dāng)細胞必須被裂解以便分離和純 化表達的糖蛋白時，蛋白酶抑制劑是尤其有利的。額外或備選地，糖苷酶抑制劑可以在任一 或所有階段加入以便減小或者消除共價連接的寡糖鏈的酶促修整。
[0144] 根據(jù)本發(fā)明表達的糖蛋白可以比在常規(guī)細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)產(chǎn)生的糖蛋白具有 更廣泛的或者改變的糖基化模式。從而，可以在純化步驟利用的本發(fā)明的一個實際益處是 根據(jù)本發(fā)明的一些方法培養(yǎng)的糖蛋白上額外的和/或改變的糖殘基可以賦予其不同的生 物化學(xué)性質(zhì)，其與根據(jù)更常規(guī)的方法生長的糖蛋白相比可以被實踐者用于更容易地純化糖 蛋白，或純化至更高的程度。
[0145] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解確切的純化技術(shù)將取決于待純化的糖蛋白的特征、用于表 達糖蛋白的細胞的特征，和/或用于生長細胞的培養(yǎng)基的組成而變。
[0146] 免痔原件組合物
[0147] 根據(jù)本公開的教導(dǎo)產(chǎn)生的糖蛋白也可以用于免疫原性組合物如疫苗中。在一些實 施方案中，通過根據(jù)本發(fā)明的某些方法產(chǎn)生糖蛋白實現(xiàn)的改善的糖基化模式可以導(dǎo)致更有 效的免疫原性組合物。例如，含有所產(chǎn)生的糖蛋白的免疫原性組合物可以引發(fā)更有效的免 疫應(yīng)答，其中受試者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更多數(shù)目的抗該糖蛋白的抗體和/或產(chǎn)生顯示出對免 疫原性糖蛋白的更高特異性的抗體。額外或備選地，此類糖蛋白可以引發(fā)具有更少和/或 更小嚴(yán)重副作用的免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含一種或多 種糖蛋白。額外或備選地，發(fā)明性免疫原性組合物包括一種或多種生理學(xué)上可接受的載體。
[0148] 通常，發(fā)明性免疫原性組合物的組分的合適的"有效量"或劑量的選擇基于多種因 素，包括但不限于，使用的免疫原性組合物中所選糖蛋白的身份、糖蛋白的糖基化模式，和 受試者的身體狀況，最特別包括所免疫的受試者的一般健康、年齡和/或體重。如本領(lǐng)域已 知的，具體施用方法和途徑和免疫原性組合物中額外組分的存在也可以影響DNA質(zhì)粒組合 物的劑量和量。有效劑量的此類選擇和向上或向下調(diào)節(jié)也在本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)。誘導(dǎo)免 疫應(yīng)答，包括但不限于保護性應(yīng)答或者在患者中產(chǎn)生外源效應(yīng)而無顯著的不利副作用所需 的免疫原性組合物的量取決于這些因素而變。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定合適劑量。
[0149] 本發(fā)明的某些免疫原性組合物可以含有佐劑。佐劑是當(dāng)與免疫原或抗原一起施 用時增強免疫應(yīng)答的物質(zhì)。已經(jīng)表明許多細胞因子或淋巴因子具有免疫調(diào)節(jié)活性，從而可 以用作佐劑，包括但不限于，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(見例如，美國專利號 5,723, 127,完整引入本文作為參考）、13、14、15、16、17和18(和其突變形式），€1，|3和丫 干擾素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（見例如，美國專利號5, 078, 996,完整引入本文 作為參考）、巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子、GSF和腫瘤壞死因子α和β?？?用于本發(fā)明的其他佐劑包括趨化因子，包括但不限于，MCP-UMIP-I α、ΜΙΡ-1 β和RANTES。 黏著分子，如選擇蛋白，如L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白也可以用作佐劑。其他 有用的佐劑包括，但不限于，黏蛋白樣分子，如⑶34、GlyCAM-I和MadCAM-Ι，整聯(lián)蛋白家族 成員，如LFA-I、VLA-I、Mac-I和p 150. 95,免疫球蛋白超家族成員，如PECAM、ICAMs，例如， ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3,共刺激分子，如CD40和CD40L，生長因子，包括血 管生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、87.2、^)6?、81^1、和血管 內(nèi)皮生長因子、受體分子，包括 Fas、TNF 受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-I、DR3、TRAMP、Apo-3、 AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2 和 DR6。再一種佐劑分子包括胱天蛋 白酶（ICE)。也見國際專利公開號W098/17799和W099/43839,將其各自完整引入本文作為 參考。
[0150] 也可以用作佐劑的是霍亂毒素（CT)和其突變體，包括公開的國際專利申請