一種無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于低聚糖生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到一種無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚 異麥芽糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 低聚異麥芽糖（Isomaltooligosaccharides, IMO)，是由一系列聚合度為2-10的 葡聚糖組成的混合物，它們的分子中均至少帶有1個(gè)α-(1，6)糖苷鍵，其中含量較多的成 分為異麥芽糖（Isomaltose，IG)、潘糖（Panose，Ρ)和異麥芽三糖（Isomaltotriose，IG 3)， 這三種組分稱之為有效三糖，其含量高低是評價(jià)低聚異麥芽糖產(chǎn)品質(zhì)量的主要指標(biāo)，也是 影響產(chǎn)品應(yīng)用范疇和市場價(jià)格的關(guān)鍵因素。IMO是目前應(yīng)用最廣泛、需求量最大的低聚糖類 功能性甜味劑，具有低熱量、抗齲齒、促進(jìn)機(jī)體腸道雙歧桿菌增殖等特殊生理功能，現(xiàn)已廣 泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及保健品、飼料等行業(yè)，國內(nèi)年消費(fèi)量達(dá)數(shù)萬噸。
[0003] 目前，低聚異麥芽糖工業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)典工藝是先將淀粉原料經(jīng)液化、糖化后，再用 游離的α-葡萄糖苷酶進(jìn)行轉(zhuǎn)苷制備。該生產(chǎn)工藝最早是由日本企業(yè)(天野株式會社、林原 生工）創(chuàng)立，是目前最成熟、應(yīng)用最廣的低聚異麥芽糖主流生產(chǎn)工藝。近年來對于該工藝的 改進(jìn)，主要集中在 α -葡萄糖苷酶固定化及重復(fù)使用、簡化合并糖化轉(zhuǎn)苷工序并縮短該過 程時(shí)間以及頂0產(chǎn)品中有效三糖含量的提高上。其中，固定化α-葡萄糖苷酶相對于游離 α -葡萄糖苷酶，具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，可大幅度降低生產(chǎn)成本，因此得到了更 加廣泛的研宄和發(fā)展。
[0004] 固定化細(xì)胞技術(shù)是在上世紀(jì)七十年代在固定化酶基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新型生 物技術(shù)。固定化細(xì)胞與固定化酶法相比，操作更加方便，省去了酶的分離純化過程，可進(jìn)一 步節(jié)約生產(chǎn)費(fèi)用；保持了酶的原始狀態(tài)，提高了其穩(wěn)定性，進(jìn)一步減少了酶活性損失。多國 研宄人員嘗試將固定化細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于低聚異麥芽糖制備，以期簡化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn) 成本。然而，由于目前報(bào)道的微生物來源α-葡萄糖苷酶多為胞外酶，而菌體細(xì)胞被固定 后，其所分泌的酶仍將以游離酶形式存在，無法充分發(fā)揮固定化細(xì)胞的優(yōu)勢。因此，目前固 定化技術(shù)生產(chǎn)低聚異麥芽糖仍集中于固定化酶領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低 聚異麥芽糖的方法。本發(fā)明方法提供的無載體固定化黑曲霉細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)連續(xù)化制取有效三 糖（IG+P+IG 3)含量35~70%的低聚異麥芽糖，生產(chǎn)工藝簡便、生產(chǎn)成本低。
[0006] 本發(fā)明采用的黑曲霉（AspergiBM flige/OMl，其所產(chǎn)α -葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶， 而不是胞外酶，因此該菌株十分適用于固定化細(xì)胞技術(shù)。此外，由于菌體細(xì)胞即為酶的天然 載體，而無需再使用其它傳統(tǒng)的有機(jī)或無機(jī)載體對菌體進(jìn)行固定化，可通過無載體固定化 技術(shù)制備低聚異麥芽糖。與傳統(tǒng)載體固定化細(xì)胞技術(shù)相比，這種無載體固定化細(xì)胞技術(shù)具 有操作簡便、輔助材料消耗少、只需添加少量助濾劑、反應(yīng)器中菌體濃度高、生產(chǎn)強(qiáng)度大、連 續(xù)使用壽命長等顯著優(yōu)點(diǎn)。目前，利用無載體固定化細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)低聚異麥芽糖的研宄尚 未見報(bào)道。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： (1) 液體培養(yǎng)黑曲霉（AspergiBM Ml，收集菌絲體； (2) 將上述黑曲霉菌絲體與助濾劑以重量比為1 :(0~10)混合，攪拌均勻，然后裝入 填充柱反應(yīng)器中，制成無載體固定化細(xì)胞填充柱(菌絲體能夠自己交聯(lián)成團(tuán)裝結(jié)構(gòu)，無需再 使用其它傳統(tǒng)的有機(jī)或無機(jī)載體對菌體進(jìn)行固定化）； (3) 將固形物質(zhì)量百分含量5~50%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4~4. 5,然后流加至上述無載 體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度45~65°C，反應(yīng)時(shí)間3~24h后，收集填充柱流出液，即制 得有效三糖（IG+P+IG 3)含量為35~70%的低聚異麥芽糖。
[0008] 所述黑曲霉/?i供?r)Ml，保藏編號CCTCC N0:M2014421，保藏日期為 2014年9月23日，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：湖北省武漢市武昌珞珈 山武漢大學(xué)。
[0009] 所述步驟（1)的具體方法為：以黑曲霉/7ig6?r)Ml為發(fā)酵菌種，在 30~35°C條件下在培養(yǎng)24h~48h后，發(fā)酵液經(jīng)離心或膜分離技術(shù)收集菌體；所述膜分離 技術(shù)為真空抽濾、板框過濾或超濾中的任意一種。
[0010] 所述步驟（2)中的助濾劑為硅藻土、高嶺土、珍珠巖、硅膠粉、酸性白土、活性炭、纖 維素或鋸肩中的一種或其組合物。
[0011] 所述步驟（3)中固形物質(zhì)量百分含量5~50%的麥芽糖漿為利用薯類淀粉或谷類 淀粉，例如木薯淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉或大米淀粉經(jīng)α -淀粉酶 或真菌淀粉酶液化，然后用淀粉酶或真菌淀粉酶糖化后制??；或市售麥芽糖漿產(chǎn)品。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： 1、本發(fā)明采用的黑曲霉其所產(chǎn)α-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶，因 此菌體細(xì)胞即為酶的天然載體，其能夠自己交聯(lián)成團(tuán)裝結(jié)構(gòu)，無需再使用其它傳統(tǒng)的有機(jī) 或無機(jī)載體對菌體進(jìn)行固定化。與傳統(tǒng)載體固定化細(xì)胞技術(shù)相比，本發(fā)明工藝操作簡便、輔 助材料消耗少、只需添加少量助濾劑或膨松劑、無需特殊設(shè)備、固定化細(xì)胞可重復(fù)連續(xù)使用 2個(gè)月以上、生產(chǎn)強(qiáng)度大，特別適用于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。
[0013] 2、本發(fā)明提供的無載體固定化黑曲霉（AspergiBM Ml細(xì)胞，其α -葡 萄糖苷酶活力高，可在55~65°C條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，轉(zhuǎn)苷時(shí)間短，轉(zhuǎn)苷后料液有效三糖 (IG+P+IG 3)含量可達(dá)35~70%，優(yōu)于傳統(tǒng)工藝，特別適用于生產(chǎn)低聚異麥芽糖不同品質(zhì)的 廣品。
[0014]
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于 實(shí)施例表示的范圍。
[0016] 實(shí)施例1:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法1 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，32°C條件 下培養(yǎng)36h后，發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾收集菌體。
[0017] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉Ml菌體細(xì) 胞與助濾劑硅藻土按質(zhì)量比1 :1混合，攪拌均勻，然后按柱體積的50%裝入柱體內(nèi)，制得無 載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0018] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量20%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4. 0,循環(huán)連 續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度55°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固定 化細(xì)胞體積比為2 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為3h，收集填充柱流出液即為低聚異 麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測定，有效三糖（IG+P+IG 3)含量為39. 52%。麥芽糖漿是以木 薯淀粉經(jīng)α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
[0019] 實(shí)施例2:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法2 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，35°C條件 下培養(yǎng)36h后，發(fā)酵液經(jīng)板框過濾收集菌體。
[0020] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉Ml菌體細(xì) 胞與助濾劑硅藻土按質(zhì)量比1 :1混合，攪拌均勻，然后按柱體積的50%裝入柱體內(nèi)，制得無 載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0021] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量30%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4. 0,循環(huán)連 續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度60°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固定 化細(xì)胞體積比為2 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為6h，收集填充柱流出液即為低聚異 麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測定，有效三糖（IG+P+IG 3)含量為68. 35%。麥芽糖漿為市售 產(chǎn)品，生產(chǎn)公司為肇慶煥發(fā)生物科技有限公司。
[0022] 實(shí)施例3:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法3 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，33°C條件 下培養(yǎng)40h后，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體。
[0023] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉Ml菌體細(xì) 胞不與任何助濾劑混合，直接按柱體積的50%裝入柱體內(nèi)，制得無載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0024] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量10%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4. 5,循環(huán)連 續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度50°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固定 化細(xì)胞體積比為2 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為6h，收集填充柱流出液即為低聚異 麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測定，有效三糖（IG+P+IG 3)含量為47. 82%。麥芽糖漿是以玉 米淀粉經(jīng)α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
[0025] 實(shí)施例4:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法4 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，30°C條件 下培養(yǎng)48h后，發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾收集菌體。
[0026] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉Ml菌體細(xì) 胞與助濾劑硅藻土和高嶺土組合（1 :1)按質(zhì)量比1 :2混合，攪拌均勻，然后按柱體積的50% 裝入柱體內(nèi)，制得無載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0027] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量30%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4. 0,循環(huán)連 續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫