度60°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固定 化細(xì)胞體積比為2 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為8h，收集填充柱流出液即為低聚異 麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定，有效三糖（IG+P+IG 3)含量為58. 16%。麥芽糖漿是以小 麥淀粉經(jīng)α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
[0028] 實(shí)施例5:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法5 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，35°C條件 下培養(yǎng)24h后，發(fā)酵液經(jīng)超濾收集菌體。
[0029] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉Ml菌體細(xì) 胞與助濾劑硅藻土、高嶺土和珍珠巖組合（1 :1 :1)按質(zhì)量比1 :3混合，攪拌均勻，然后按柱 體積的50%裝入柱體內(nèi)，制得無載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0030] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量40%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4. 0,循環(huán)連 續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度60°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固定 化細(xì)胞體積比為1. 5 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為8h，收集填充柱流出液即為低聚 異麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定，有效三糖（IG+P+IG 3)含量為70. 57%。麥芽糖漿為市 售產(chǎn)品，生產(chǎn)公司為肇慶煥發(fā)生物科技有限公司。
[0031] 實(shí)施例6:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法6 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，32°C條件 下培養(yǎng)36h后，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體。
[0032] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉Ml菌體細(xì) 胞與助濾劑硅藻土和酸性白土組合（1. 5 :1)按質(zhì)量比I : 1. 5混合，攪拌均勻，然后按柱體積 的50%裝入柱體內(nèi)，制得無載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0033] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量25%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4. 5,循環(huán)連 續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度55°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固定 化細(xì)胞體積比為1. 8 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為15h，收集填充柱流出液即為低聚 異麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定，有效三糖（IG+P+IG 3)含量為53. 38%。麥芽糖漿是以 大米淀粉經(jīng)α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
[0034] 實(shí)施例7:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法7 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，32°C條件 下培養(yǎng)36h后，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體。
[0035] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉Ml菌體細(xì) 胞與助濾劑高嶺土按質(zhì)量比1 :5混合，攪拌均勻，然后按柱體積的70%裝入柱體內(nèi)，制得無 載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0036] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量5%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4. 5,循環(huán)連 續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度55°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固定 化細(xì)胞體積比為1. 2 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為24h，收集填充柱流出液即為低聚 異麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定，有效三糖（IG+P+IG 3)含量為35. 96%。麥芽糖漿是以 木薯淀粉經(jīng)α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
[0037] 實(shí)施例8:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法8 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，32°C條件 下培養(yǎng)36h后，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體。
[0038] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉Ml菌體細(xì) 胞與助濾劑珍珠巖按質(zhì)量比1 :〇. 5混合，攪拌均勻，然后按柱體積的60%裝入柱體內(nèi)，制得 無載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0039] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量15%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4. 5,循環(huán)連 續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度65°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固定 化細(xì)胞體積比為1. 5 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為10h，收集填充柱流出液即為低聚 異麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定，有效三糖（IG+P+IG 3)含量為65. 06%。麥芽糖漿是以 馬鈴薯淀粉經(jīng)α-淀粉酶液化，β-淀粉酶糖化后制取。
[0040] 實(shí)施例9:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法9 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，32°C條件 下培養(yǎng)36h后，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體。
[0041] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉Ml菌體細(xì) 胞與助濾劑硅藻土、活性炭和鋸肩組合（1 :1 :〇. 5)按質(zhì)量比1 :8混合，攪拌均勻，然后按柱 體積的50%裝入柱體內(nèi)，制得無載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0042] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量20%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4. 0,循環(huán)連 續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度50°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固定 化細(xì)胞體積比為2 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為8h，收集填充柱流出液即為低聚異 麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定，有效三糖（IG+P+IG 3)含量為42. 55%。麥芽糖漿為市售 產(chǎn)品，生產(chǎn)公司為肇慶煥發(fā)生物科技有限公司。
[0043] 實(shí)施例10:無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法10 1、利用黑曲霉制備菌絲體：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，32°C條件 下培養(yǎng)36h后，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體。
[0044] 2、制備無載體固定化細(xì)胞填充柱：將上述黑曲霉（Aspergi/AAs· /7ig6?r)Ml菌體細(xì) 胞與助濾劑硅膠粉、酸性白土和纖維素組合（〇. 5 :0. 5 :1)按質(zhì)量比I :10混合，攪拌均勻， 然后按柱體積的50%裝入柱體內(nèi)，制得無載體固定化細(xì)胞填充柱。
[0045] 3、生產(chǎn)低聚異麥芽糖：將固形物質(zhì)量百分含量20%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4.0,循環(huán) 連續(xù)流加至上述無載體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度55°C，填充柱中麥芽糖漿：無載體固 定化細(xì)胞體積比為1. 5 :1，麥芽糖漿在柱體中的反應(yīng)時(shí)間為12h，收集填充柱流出液即為低 聚異麥芽糖漿；經(jīng)高效液相色譜儀測(cè)定，有效三糖（IG+P+IG3)含量為40. 32%。麥芽糖漿 為市售產(chǎn)品，生產(chǎn)公司為肇慶煥發(fā)生物科技有限公司。 核苷酸或氨基酸序列表
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 液體培養(yǎng)黑曲霉（AspergiTrAz1S Ml，收集菌絲體； (2) 將上述黑曲霉菌絲體與助濾劑以重量比為1 :(0~10)混合，攪拌均勻，然后裝入 填充柱反應(yīng)器中，制成無載體固定化細(xì)胞填充柱； (3) 將固形物質(zhì)量百分含量5~50%的麥芽糖漿調(diào)節(jié)pH4~4. 5,然后流加至上述無載 體固定化細(xì)胞填充柱，反應(yīng)溫度45~65°C，反應(yīng)時(shí)間3~24h后，收集填充柱流出液，即制 得有效三糖（IG+P+IG 3)含量為35~70%的低聚異麥芽糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法，其特征在 于：所述黑曲霉/?i職r)Ml，保藏編號(hào)CCTCC N0:M2014421，保藏日期為2014 年9月23日，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：湖北省武漢市武昌珞珈山武 漢大學(xué)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法，其特征在 于：所述步驟（1)的具體方法為：以黑曲霉Ml為發(fā)酵菌種，在30~ 35°C條件下在培養(yǎng)24h~48h后，發(fā)酵液經(jīng)離心或膜分離技術(shù)收集菌體；所述膜分離技術(shù)為 真空抽濾、板框過濾或超濾中的任意一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法，其特征在 于：所述步驟（2)中的助濾劑為硅藻土、高嶺土、珍珠巖、硅膠粉、酸性白土、活性炭、纖維素 或鋸肩中的一種或其組合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法，其特征在 于：所述步驟（3)中固形物質(zhì)量百分含量5~50%的麥芽糖漿為利用薯類淀粉或谷類淀粉 經(jīng)《 _淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用e _淀粉酶或真菌淀粉酶糖化后制?。换蚴惺埯溠?糖漿產(chǎn)品。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種無載體固定化黑曲霉生產(chǎn)低聚異麥芽糖的方法，通過培養(yǎng)黑曲霉（Aspergillus niger）M1收集菌絲體后，將其與助濾劑以適宜重量比混合，攪拌均勻后裝入填充柱反應(yīng)器中，制得無載體固定化細(xì)胞填充柱，通過流加方式生產(chǎn)有效三糖（IG+P+IG3）含量為35～70%的低聚異麥芽糖。本發(fā)明采用的黑曲霉（Aspergillus niger）M1，所產(chǎn)α-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶，因此菌體細(xì)胞即為酶的天然載體，無需再使用其它傳統(tǒng)的有機(jī)或無機(jī)載體對(duì)菌體進(jìn)行固定化。與傳統(tǒng)載體固定化細(xì)胞技術(shù)相比，這種無載體固定化技術(shù)具有工藝操作簡(jiǎn)便、輔助材料消耗少、不用特殊設(shè)備、菌體細(xì)胞使用壽命長(zhǎng)、生產(chǎn)強(qiáng)度大等優(yōu)點(diǎn)。CCTCC M 201442120140917
【IPC分類】C12P19-12, C12R1-685, C12P19-14
【公開號(hào)】CN104878054
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510073051
【發(fā)明人】梁智群, 陳桂光, 李瑋, 曾偉
【申請(qǐng)人】廣西南寧智天生物科技有限公司
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年2月12日